ebselen、白屈菜红碱和阿扑吗啡作为谷氨酰胺酶抑制剂的动力学表征

摘要

1.简介

谷氨酰胺是通过谷氨酰胺水解为高度增殖和肿瘤细胞提供能量的主要来源[1,2]. 谷氨酰胺被转运到谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.2）将谷氨酰胺水解为谷氨酸的细胞中[三]. 谷氨酸通过三羧酸循环进一步分解代谢为ATP。谷氨酰胺酶已被证明通过c-Myc调节的过程在谷氨酸分解中发挥关键作用[4]. 谷氨酰胺酶siRNA，一种原型谷氨酰胺酶抑制剂和谷氨酰胺剥夺都已被证明会导致各种癌细胞株的细胞增殖显著下降[4–9]提示小分子谷氨酰胺酶抑制剂在癌症治疗中的作用。

谷氨酰胺酶也被认为在谷氨酸的生成中起着关键作用，谷氨酸是中枢神经系统中的一种关键兴奋性神经递质[10,11]. HIV感染的巨噬细胞表达增加的谷氨酰胺酶水平，并产生大量谷氨酰胺依赖性谷氨酸[12]. 原型谷氨酰胺酶小分子抑制剂和谷氨酰胺酶特异性siRNA能够消除HIV感染巨噬细胞引起的谷氨酸增加[13]. 这些结果表明谷氨酰胺酶在艾滋病病毒引起的神经毒性中起着重要作用。谷氨酰胺酶介导的小胶质细胞谷氨酸释放也显示在多发性硬化模型中发生[14]和缺血[15]表明谷氨酰胺酶抑制可能对神经炎症和神经退行性疾病具有广泛的治疗意义。

尽管谷氨酰胺酶抑制可能具有治疗效用，但迄今为止，还没有已知的有效和选择性谷氨酰胺酶抑制剂可用。DON是已知最早的谷氨酰胺酶抑制剂，是一种活性位点定向抑制剂[16,17]已被用作工具化合物，以帮助阐明谷氨酰胺酶在HIV-相关痴呆（HAD）发病机制和多发性硬化中的潜在参与[12,14]. 然而，DON是一种非选择性有毒试剂，可抑制几种谷氨酰胺利用酶[18]. DON在在体外疾病模型[12,14]并且不能很好地容忍体内[19–21]. Elan Pharmaceuticals描述了一种谷氨酰胺酶抑制剂（Newcomb，美国专利，2002年），称为低摩尔效力的BPTES(K（K）_我=0.2μM）和非竞争性抑制模式[22]. 尽管BPTES比DON更有效，但它并不是一种类药物化合物，因为它具有高分子量（534）、低溶解性和低生物利用度[23]. 围绕BPTES的结构-活性关系（SAR）研究没有产生明显更好的类似物[8,23]. 因此，为了鉴定更多的类药物抑制剂，我们对药理活性化合物库（LOPAC）进行了筛选¹²⁸⁰（西格玛），包括小分子调节剂和所有主要药物类别的批准药物。在此，我们报道了从我们的筛选工作中鉴定出的三种新抑制剂的动力学特征，以及它们与DON和BPTES的直接比较。

2.材料和方法

3.结果

3.2. ebselen、白屈菜红碱、阿扑吗啡、DON和BPTES的动力学表征

为了确定ebselen抑制的动力学，在不同浓度的ebselen存在下进行谷氨酰胺饱和实验（补充：图1a）。随着抑制剂浓度的增加，表观米氏常数(K（K）_{地图绘制程序})增加，同时减少6倍V（V）_最大值数据的双倒数图产生了斜率不同的线，这些线在第二象限相交（补充：图1b），表明混合非竞争性抑制。双倒数图中每条线的斜率的二级图(K（K）_{地图处理程序}/V（V）_最大值)与抑制剂浓度相比K（K）_我约15nM(表2; 补充：图1c）。

表2

竞争研究——不同抑制剂浓度下的底物饱和度分析。（数据是2-4次测定的平均值。）

化合物	结构	抑制模式	K（K）我，米
埃布森	在单独的窗口中打开	混合非竞争性	1.49E–08年
白屈菜红碱	在单独的窗口中打开	竞争的	2007年7月27日
盐酸阿扑吗啡	在单独的窗口中打开	竞争的	东经2.32–06
BPTES公司	在单独的窗口中打开	无竞争力	东部时间1.25–07
大学教师	在单独的窗口中打开	时间相关	纳

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通过时间依赖性抑制实验，进一步研究了ebselen对谷氨酰胺酶的抑制模式[25]. 谷氨酰胺酶剩余活性与时间的半对数图显示出伪一级动力学。此外，ebselen对谷氨酰胺酶的灭活取决于培养浓度和时间（补充：图1d）。计算的K（K）_我ebselen约为14 nMk个_不正确的ebselen对谷氨酰胺酶的作用为1.32/h(表3; 补充：图1e）。

表3

失活研究-相对亲和力(K（K）_我)，失活速率常数(k个_不正确的)和二阶速率常数(k个_不正确的/K（K）_我)ebselen、螯合氰菊酯、盐酸阿扑吗啡、BPTES和DON对抗谷氨酰胺酶。（数据是在八个浓度和六个不同时间点的两次测定的平均值。）

化合物	K（K）我，M（计算值）	k个不正确的，小时−1	k个不正确的/K（K）我，米−1秒−1
埃布森	1.44E–08年	1.31	2.52E+04
白屈菜红碱	2008年3月29日	3.45	2.92东经+04
盐酸阿扑吗啡	4.17E–09年	0.20	东经1.32+04
BPTES公司	2.58E–07年	0.25	2.68东经+02
大学教师	东经5.57–06	0.05	2.53E+00

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对白屈菜红碱、阿朴吗啡和原型抑制剂、BPTES和DON进行了类似的实验。结果如所示表2和​和3三（补充：图2、3、4和5）。与BPTES的竞争研究表明K（K）_{地图处理程序}随着V（V）_最大值（补充：图4a）。数据的双倒数图产生了平行线（补充：图4b），表明无竞争性抑制。倒数的二次图K（K）_{地图处理程序}与抑制剂浓度相比K（K）_我125 nM(表2; 补充：图4c）。由于DON同时作为谷氨酰胺酶的底物和共价修饰物，因此无法进行竞争研究[16]. 总之，DON对谷氨酰胺酶的灭活取决于培养的浓度和时间k个_不正确的0.05/h和aK（K）_我6μM(表3; 补充：图5）。

3.3. ebselen、白屈菜红碱和阿朴吗啡的类似物

由于ebselen含有一个硒原子，因此有兴趣评估硒被硫和氧取代的类似物，这些元素属于周期表中的同一组（6A）元素。结果与这些原子的氧化能力以及离开基团的能力相一致；硒类似物的效力最强，其次是硫醇和氧代类似物(表4). 用碳取代硒（4A组）导致活性丧失。

表4

ebselen的类比。

化合物	分子结构	平均IC50（微米）
埃布森	在单独的窗口中打开	0.009
2-苯并[d]异噻唑-3（2H）-酮	在单独的窗口中打开	0.02
2-苯并[d]异恶唑-3（2H）-酮	在单独的窗口中打开	20
2-苯基异吲哚-1-酮	在单独的窗口中打开	>100

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对四种白屈菜红碱类似物的谷氨酰胺酶活性进行了测试。虽然氯化两面针碱和氯化血根碱都保持了生物活性，但去甲血根碱（一种结构类似的缺乏亚氨基的血根碱类似物）却没有(表5). 此外，氯化小檗碱（一种与螯合菊酯结构相关的类似物）在氮上带正电荷，但含有一个额外的融合环，而不是侧链甲基，因此不能保持活性。结果证实了亚胺键在白屈菜红碱生物活性中的重要性[27].

表5

白屈菜红碱类似物。

化合物	分子结构	平均IC50（微米）
白屈菜红碱	在单独的窗口中打开	0.03
氯化尼替丁	在单独的窗口中打开	9
氯化小檗碱	在单独的窗口中打开	>100
血根碱盐酸盐	在单独的窗口中打开	0.1
氯去血根碱	在单独的窗口中打开	>100

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谷氨酰胺酶对阿朴吗啡没有对映体选择性(表6). 而阿扑吗啡的丙基类似物稍微较弱，用甲氧基取代了其中一个羟基(对（−）-阿波可待因盐酸盐）导致活性损失10倍。

表6

阿扑吗啡的类似物。

化合物	分子结构	平均IC50（微米）
对-盐酸阿扑吗啡	在单独的窗口中打开	0.6
S公司-盐酸阿扑吗啡	在单独的窗口中打开	0.4
对（−）-丙基去甲吗啡盐酸盐	在单独的窗口中打开	0.9
对（−）-盐酸阿波可待因	在单独的窗口中打开	4

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4.讨论

我们对药理活性化合物库进行了筛选，以确定潜在的类药物谷氨酰胺酶抑制剂。在这里，我们报告了三种新发现的谷氨酰胺酶抑制剂的动力学特征和初步模拟评估：ebselen、chelerythrine和apomorphone。

探讨ebselen、白屈菜红碱和阿扑吗啡与谷氨酰胺酶（hKGA）相互作用的机制_Δ1)，我们进行了竞争和失活研究(方案1). 在竞争研究中(E类)暴露于两种基底(S公司)和抑制剂(我)同时。这些研究允许测量平衡常数(K（K）_我)谷氨酰胺存在下酶和抑制剂之间的相互作用。在灭活研究期间，将酶与抑制剂孵育不同时间，然后将底物用作确定剩余酶活性百分比的工具。失活研究允许测量平衡常数(K（K）_我)除失活率外，还有一种时间依赖性抑制剂(k个_不正确的) [25].

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方案1

竞争性研究表明，对ebselen的混合非竞争性抑制、对白屈菜红碱和阿朴吗啡的竞争性抑制以及对BPTES的无竞争性抑制(表2). BPTES的结果证实了早期关于无竞争性抑制的报道[22]以及BPTES和谷氨酰胺酶之间的变构相互作用[8,28]. 这个K（K）_我无法通过竞争研究准确确定DON。这很可能是因为DON部分充当谷氨酰胺酶的底物[16].

值得注意的是，失活研究导致所有五种抑制剂谷氨酰胺酶活性的时间和浓度依赖性丧失（补充：图1d、2d、3d、4d、5a），这表明存在不可逆或可逆的慢结合抑制。BPTES和阿扑吗啡的时间依赖性抑制可能归因于缓慢结合的可逆抑制，因为BPTES和阿扑吗啡都没有表现出反应性部分。事实上，3D结构研究证实了BPTES和酶之间的非反应性变构相互作用[8,28]. 另一方面，根据早先的报告，我们发现DON具有时间依赖性和不可逆性[17]. 可以想象，ebselen和chelerythrine也由于其结构中的反应性部分而不可逆。

这个K（K）_我从竞争和失活研究中获得的ebselen的相似性（分别为15和14 nM），表明谷氨酰胺的存在或缺失不会改变ebselen对酶的亲和力(表2和​和3）。三). BPTES（分别为125和260 nM）也是如此。这些数据支持通过变构位点与谷氨酰胺酶共价加合物形成（ebselen）或慢结合相互作用（BPTES）的观点。相比之下K（K）_我从竞争和失活研究中获得的结果对于白屈菜红碱（分别为270和30 nM）和阿朴吗啡（分别为2μM和4 nM）来说是不同的。谷氨酰胺的存在使其具有明显的亲和力(K（K）_我)白屈菜红碱和阿朴吗啡的活性较弱，表明活性部位可能存在竞争。或者，白屈菜红碱和阿朴吗啡可以在变构位点结合，这反过来又排除了谷氨酰胺在活性位点的结合。考虑到白屈菜红碱的生物活性被认为是通过白屈菜黄碱的亚胺键和酶的硫醇基团之间的加合物形成介导的，白屈菜黄碱和谷氨酰胺酶之间的变构相互作用并非不可能发生[27].

抑制效率的程度，由二级速率常数测量(k个_不活跃的/K（K）_我)，表明白屈菜红碱是最有效的抑制剂(表3). ebselen对谷氨酰胺酶的二级速率常数与之前发表的自由基清除活性相似[29]. 当阿朴吗啡的时候k个_不正确的是三种新抑制剂中最低的，其抑制效率与ebselen和白屈菜红碱相当，因为其亲和力最高。相反，BPTES的抑制效率比ebselen、白屈菜红碱和阿朴吗啡低两个数量级，但仍比DON高两个数量级别。

Ebselen已被证明与来自几个不同功能类别的蛋白质的半胱氨酸残基形成硒烯基硫醚（–Se–S–）连接[30]. 虽然谷氨酰胺酶活性部位没有已知的半胱氨酸残基，但在该酶的所有亚型中都有许多半胱氨酸残留[5,28]. 当ebselen中的硒部分被具有降低氧化电位和保留基团能力的硫、氧和碳取代时，抑制效力相应降低(表4). 白屈菜红碱也被认为通过其亚胺部分和蛋白质上的硫醇基团之间的加合物形成共价相互作用[27]. 当亚胺的功能性与尼替丁和血根碱一样被保留时，生物活性也被保留。然而，当血根碱中的甲基-碘键被亚胺取代时，就像去甲血根碱一样，生物活性丧失，这意味着这种功能性参与了其生物活性(表5). 最近的出版物[31]表明亚甲基二氧基参与了这些苯并菲咯烷生物碱的活性。然而，具有两个二甲氧基分子的白屈菜红碱和具有亚甲基二氧基的血根碱对谷氨酰胺酶的活性相似。ebselen和chelerythrine对谷氨酰胺酶的活性可能是由于它们能够赋予谷氨酰胺酶非活性四聚体构型[22]或干扰四聚反应过程[5].

与ebselen和白屈菜红碱的硫醇相互作用相反，阿朴吗啡的活性似乎依赖于其邻苯二酚部分。虽然阿朴吗啡对映体具有等效力，丙基类似物稍弱，但用甲氧基取代邻苯二酚的一个羟基会导致活性损失10倍(表6). 此外，阿扑吗啡的平面性可能有助于其对谷氨酰胺酶具有与BPTES相同的变构效应，即“冻结”界面环，以阻止构象变化在整个四聚体中的传递[28].

尽管如此，由于生物效应的多样性和缺乏选择性，ebselen、白屈菜红碱和阿朴吗啡可能不是很好的谷氨酰胺酶抑制原型抑制剂体内在国家生物技术信息中心（NCBI）进行的研究中，在597次检测中的99次检测和207次检测的29次检测中，发现ebselen和chelerthrine分别具有活性[32,33]. Ebselen是一种硒有机电泳剂，在药理学上被认为是一种抗氧化剂[30]. 白藜芦醇具有高度极性的亚氨基部分，该部分反应性很强，易受亲核攻击[34]. 此外，已知ebselen、白屈菜红碱和阿朴吗啡可抑制各种酶和/或受体[34–39].

然而，值得注意的是，ebselen对谷氨酰胺酶的活性是ebselen（对UDP-葡萄糖4′-差向异构酶，一种有效的治疗非洲昏睡病的药物靶点）的2倍[33]. Ebselen已广泛用于各种损伤/疾病的实验动物模型[37]并作为神经保护剂治疗急性缺血性卒中患者[40–42]动脉瘤性蛛网膜下腔出血[43]. 目前正在进行一项临床试验，以确定ebselen在听力损失范式中的效用[44]. 白屈菜红碱是一种从大白屈菜五十、 罂粟科的一员[45]. 从植物中提取的生物碱已被证明具有一系列活性，包括抗炎、抗肿瘤、抗菌和抗病毒活性。最近，一些二苯并菲已被证明具有抗增殖作用[6]. 阿朴吗啡以各种商标销售，用于治疗帕金森病[46]. 另一项研究表明阿朴吗啡可能被用作海洛因依赖症的生物标记物[47].

总之，依布硒仑、白屈菜红素和阿扑吗啡似乎更有效（>k个_不正确的/K（K）_我)而不是DON或BPTES。它们也比BPTES更易溶解。据我们所知，这是首次报道ebselen、白屈菜红碱和阿扑吗啡是有效的谷氨酰胺酶抑制剂，并提出了一个问题，即之前报道的这些化合物的某些生物活性是否可能是由于谷氨酰胺酶的“非靶向”抑制。

致谢

缩写

附录A补充数据

与本文相关的补充数据可以在在线版本中找到，网址为http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2013.06.110.

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