胰腺。作者手稿；PMC 2014年7月9日发布。
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慢性胰腺炎大鼠脑源性神经营养因子上调并介导疼痛行为
加利福尼亚州斯坦福市斯坦福大学医学院医学系胃肠病学和肝病科
转载：Pankaj J.Pasricha，医学博士，斯坦福大学医学院M211 Alway Bldg，300 Pasteur Dr，Stanford CA 94305(ude.drofnats@ahcirsaP) 摘要
目标
我们在慢性胰腺炎（CP）实验模型中检测了脑源性神经营养因子（BDNF）在疼痛发病机制中的作用。
方法
用三硝基苯磺酸逆行注入成年大鼠胰管诱导胰腺炎。注射后21天，通过免疫组织化学方法检测胰腺特异性背根神经节（DRG）中BDNF的表达，并从DRG和脊髓提取物中定量蛋白质水平。通过腹壁对纤维探测的敏感性以及胰腺对电刺激的伤害性行为来评估鞘内注射BDNF中和抗体对胰腺痛觉过敏的影响。
结果
与对照组相比，三硝基苯磺酸大鼠DRG和脊髓（T9-13）中的BDNF水平显著升高，同时表达BDNF免疫反应性的胰腺特异性神经元数量增加。脑源性神经营养因子拮抗剂抑制了CP大鼠脊髓中磷酸原肌球蛋白相关激酶B受体的水平，并显著降低了行为反应。
结论
脑源性神经营养因子在CP大鼠胰腺特异性初级传入神经元中上调，BDNF拮抗作用与这些动物疼痛相关行为的减少有关，表明这种神经递质在CP的痛觉感受中起着重要作用。
关键词：慢性胰腺炎、内脏疼痛、感觉神经元、BDNF、TrkB
疼痛是慢性胰腺炎（CP）的主要症状，约75%的酒精性CP患者、50%的晚发性特发性CP患者和100%的早发性特发性CP患者存在疼痛。1这些患者的疼痛管理是一项重大的治疗挑战。治疗是经验性的，通常具有很强的侵入性，长期效果往往不令人满意。更合理有效的治疗需要在进一步了解这种情况下疼痛的神经生物学基础上发现新的靶点。2,三
持续的组织损伤会导致伤害感受系统的反应性或敏感性增强，包括外周和中心。疼痛信号开始于外周，将局部损伤转化为初级传入神经元或痛觉感受器的电信号。动作电位一旦在外周产生，就会向心传导到伤害感受器的脊髓末端，在那里它们启动神经递质释放，从而将伤害性信息传递给二级神经元。对相对温和刺激的早期反应是通过谷氨酸传递的，但如果刺激持续或足够强烈，则会导致神经生长因子（NGF）释放肽类神经递质，如P物质（SP）、降钙素基因相关肽（CGRP）和脑源性神经营养因子（BDNF）–响应性小直径感觉神经元，用于增强对谷氨酸的反应，并以其他方式参与伤害性敏化。
有效啮齿动物模型的开发促进了胰腺疼痛发病机制的研究。因此，我们之前已经表明，在CP大鼠模型中，经典神经递质（如SP和CGRP）和瞬时受体电位阳离子通道V亚家族成员1（TRPV1）在胰腺感觉神经元中上调。4,5然而，在这种情况下，其他神经递质和通道的作用还需要仔细检查。脑源性神经营养因子是短期和长期突触效率的强大调节剂，被认为对脊髓二级神经元表达的原肌球蛋白相关激酶B受体（TrkB）发挥作用。6脑源性神经营养因子主要在躯体疼痛模型中进行研究，目前尚不完全了解，并且与神经递质存在一定的矛盾，在大多数炎症状态下起到促痛作用，在神经病模型中起到抗痛作用。6在CP患者的标本中也发现了胰腺BDNF的表达，并发现其与疼痛评分相关。7因此，本研究的总体目的是在实验性CP模型中检测BDNF在疼痛发病机制中的作用。我们的结果证明，BDNF上调了CP大鼠胰腺特异性初级传入神经元，并且BDNF拮抗与这些动物疼痛相关行为的减少有关，这表明这种神经递质在CP的伤害感受中具有重要作用。
材料和方法
CP的诱导、细胞标记和电极植入
在成年雄性Sprague-Dawley大鼠中，通过将0.5 mL 1%三硝基苯磺酸（TNBS）与PBS（pH 8.0）中的10%乙醇逆行输注到胰管中，诱导慢性胰腺炎。在将连接至PE-10导管的30号针头插入十二指肠并引导其穿过乳头进入胰管之前，用夹钳暂时堵塞总胆管，以避免TNBS进入肝脏，以便如前所述缓慢注射TNBS/盐水溶液。4在涉及免疫组织化学的实验中，向大鼠胰腺注射脂溶性荧光染料DiI（1,1′-二烯丙基-3,3,3′，3-四甲基吲哚碳菁甲烷磺酸盐；以晶体形式从Molecular Probes，Eugene，Ore获得），25 mg溶于0.5 mL甲醇中，在暴露胰腺的8到10个部位，体积为2-μL，TNBS输注前。对于涉及电刺激测试的实验，在TNBS输注后不久，将一对电极（Myo-Wires；新泽西州Farmingdale的a&E Medical）缝合到胰腺中，并将开口端皮下隧道化并在颈部背侧区域外穿。
BDNF酶联免疫吸附试验
注射TNBS三周后，在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下处死动物，快速采集颈、胸背根神经节（DRGs；T9-13）。同时收集相应的颈、胸、腰椎脊髓节段。使用研钵和杵将组织在液氮中粉碎，然后在缓冲液中解冻，然后使用转子驱动的特氟隆均质器将其均质。在冰上进一步培养30分钟后，将其离心14000克在4°C下10分钟，将上清液转移到新鲜试管中进行酶联免疫吸附测定（ELISA）和蛋白质测定。缓冲液的组成如下：20 mM Tris-HCl pH 7.4、100 mM NaCl、40 mM NaF、1 mM EDTA、1 mM-EGTA、1 m M原钒酸钠、25 mMβ-甘油磷酸、5 mM焦磷酸和10%甘油。就在使用之前，添加蛋白酶抑制剂混合物（1:100，P8340；Sigma，St Louis，Mo），然后使用ELISA试剂盒（Millipore，Billerica，Mass）从组织提取物中定量BDNF。结果被归一化为总蛋白浓度，并表示为每微克总蛋白中BDNF的微图。蛋白质通过BCA方法进行测量（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）。
免疫组织化学
注射TNBS三周后，用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉大鼠，并经心灌注200 mL 0.9%氯化钠溶液，然后再灌注500 mL冷的4%多聚甲醛PBS（pH 7.4）。采集胰腺特异性DRG（T9-T13），在4%多聚甲醛中固定过夜，然后在30%蔗糖中冷冻保护。将背根神经节植入最佳切割温度培养基中，制备10μm厚的冷冻切片。为了确保一个神经元只计数一次，将连续切片放在连续的载玻片上，同一载玻片的切片之间至少间隔50μm。切片被封闭并在5%正常山羊血清和0.3%Triton X-100的PBS中渗透30分钟，然后在4°C的兔抗BDNF一级抗体（Millipore；1:100）中孵育过夜，在PBS中冲洗，最后用荧光羊抗兔二级抗体孵育（Alexa Fluor 488；Invitrogen，Carlsbad，Califa；1:300）。然后在尼康Eclipse E600（尼康仪器公司，纽约州梅尔维尔）显微镜上观察载玻片，该显微镜配备适用于DiI（罗丹明滤光片）的滤光片立方体和适用于Alexa 488染料的带通和长通滤光片。结果表示为BDNF阳性染色的胰腺特异性（DiI-标记）神经元的百分比。
鞘内放置导管和皮下植入渗透泵持续输送抗-BDNF
TNBS治疗三周后，在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下，通过寰枕膜将鞘内导管（6 cm长）插入脊髓水平T9-10。将导管固定到肌肉上，并用渗透迷你泵（Alzet型号：2001；加利福尼亚州库比蒂诺的Durect公司）填充200μL 500μg/mL BDNF中和抗体，或作为对照，填充等浓度的纯化免疫球蛋白，两者均来自创新研究公司（密歇根州诺维市），将其植入皮下并连接至鞘内导管。该泵设计为在动物体内初始激活4小时后，以1μL/h的速度持续输送抗体7天。
西方印迹法
磷酸化TrkB和β-微管蛋白的免疫印迹如下。在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂（分别为P5726和P8340；Sigma）、2.5 mM苯甲基磺酰氟、1 mM原钒酸钠、5 mM EDTA、，和50 mM氟化钠。匀浆在14000 rpm下离心30分钟，每个样品中的蛋白质浓度通过BCA分析测定（Thermo Scientific，Rockford，Ill）。用4%至12%的NuPage Bis-Tris凝胶（Invitrogen，Carlsbad，Calif）溶解50微克的总细胞蛋白质，然后将其电印在Hybond聚偏二氟乙烯膜上（GE Healthcare，Piscataway，NJ）。封闭后，用特定的一级抗体（磷酸化TrkB[Ab81288；Abcam，Cambridge，Mass]或β-微管蛋白[Ab6046；Abcam]）探测细胞膜。根据制造商的说明，通过SuperSignal West Pico化学发光Western印迹检测系统（34080；Thermo Scientific）处理印迹。磷酸化TrkB的密度读数根据相应的β-微管蛋白测量值进行归一化，结果以无CP大鼠的平均值的相对单位表示。
冯·弗雷灯丝试验
冯·弗雷灯丝（VFF）测试如前所述进行。4测试前，将腹部剃光，并在前肢和后肢上标记指定的刺激区域。将大鼠放在一个有网眼地板的塑料笼中，在测试前给予30分钟的适应时间。将不同口径/强度的Von Frey细丝（Stoelting，Wood Dale，伊利诺伊州）按升序涂敷到动物剃光的腹部，直至靠近胸腔的中腹上部，每次10次，每次持续1至2秒，涂敷间隔10秒。积极的反应包括提起腹部和/或抓挠和舔腹部。数据表示为10次使用灯丝期间的响应数。一旦给定动物的水平达到10，就不再进行进一步的测试，为了进行分析，假设较高的纤维强度也会导致相同的分数。所有测试均以盲法进行。
胰腺电刺激和刺激性反应的测量
在用生理盐水或TNBS输注胰管后，将一对电极连接到胰腺上，并在头后外穿。这些动物通过与电刺激器相连的一对电极连续接受2、5和10毫安的电流，持续5分钟，两次刺激之间休息20分钟。在每5分钟的刺激期内，对伤害行为的次数进行计数。如前所述，这些行为包括伸展、舔腹部、收缩腹壁肌肉和伸展后肢。4
数据分析
数据以平均值±SEM表示。电刺激行为数据通过重复测量方差分析（ANOVA）进行分析，处理作为组间因素，刺激电流（mA）作为组内因素。学生确定了来自对照组和TNBS治疗组大鼠的其他数据之间的统计差异t吨检验、Fisher精确检验或χ2测试。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
结果
CP增强胰腺DRG和脊髓段BDNF蛋白的表达
我们确定TNBS诱导的CP是否改变了BDNF的蛋白表达。从对照组和TNBS处理组动物的胰腺反应性DRG和脊髓片段中提取总蛋白，并使用ELISA试剂盒分析BDNF。如所示BDNF蛋白在DRG和脊髓T9-13节段的表达分别显著升高约1.4倍和1.7倍（每组6只大鼠）。相反，对照组和CP组的DRG和颈段或腰椎段的脊髓样本中BDNF蛋白水平没有显著差异（结果未显示）。在平行免疫荧光研究中，我们还计算了胸椎T9-13节段表达BDNF免疫反应的DiI-标记神经元的数量(). 与对照组相比，患有CP的大鼠BDNF染色阳性的DiI-标记细胞比例较高（43.2%比50.9%，P（P）< 0.01; n=每组6只大鼠）。
慢性胰腺炎导致感觉神经中BDNF的上调。A、 胸段DRG的冰冻切片被荧光染色以检测BDNF的存在。DRG部分BDNF阳性神经元的代表性图片（顶部面板）和DiI-标记的胰腺特异性神经元的代表图（中间面板）。底部面板显示了一张合并的图片，识别了两个胰腺特异性BDNF表达神经元。与对照组相比，经三硝基苯磺酸处理的动物表达BDNF的胰腺特异性神经元的百分比显著高于对照组（50.9%比43.2%，P（P）< 0.05). 比例尺，50μm。B、 与对照组相比，TNBS大鼠胸椎T9-13 DRG（顶面板）和脊髓（底面板）中的BDNF蛋白水平也显著升高(P（P）<0.006 vsP（P）分别<0.05）。
BDNF拮抗剂抑制TrkB磷酸化
抗BDNF治疗一周后，患有CP的大鼠（n=9）的胸脊髓中磷酸化TrkB水平与没有CP的大鼠相似（“正常”，n=5；). 相比之下，用对照IgG治疗的大鼠（n=10）的水平显著高于正常大鼠和用抗BDNF抗体治疗的大白鼠(P（P）方差分析=0.03）。
脊髓中磷酸化TrkB水平在CP中上调，并通过鞘内抗BDNF恢复正常。A、 磷酸化TrkB水平通过Western blot定量，并表示为无胰腺炎大鼠正常化的β-微管蛋白表达比率。
B、 实际蛋白质印迹的代表性示例（正常=无CP的大鼠）。
脑源性神经营养因子拮抗剂减弱CP中的体感敏感性
接下来，我们确定在TNBS治疗的大鼠中观察到的胰腺伤害性行为是否由BDNF通过使用中和抗体介导，如之前报道的那样。8我们首先在TNBS治疗的大鼠中应用抗BDNF或对照免疫球蛋白前后测量腹部对机械刺激的敏感性（一种参考躯体痛觉过敏的检测，内脏疼痛的特征）。总的来说，与预处理基线相比，TNBS输注3周后抗BDNF治疗的大鼠（n=6）的反应频率显著降低，刺激-反应曲线向右移动(; 双向方差分析：刺激效应，P（P）< 0.0001; 治疗效果，P（P）< 0.0001). 相比之下，免疫球蛋白治疗的对照大鼠（n=7）在TNBS输注3周后的反应频率增加(; 双向方差分析：刺激效应，P（P）< 0.0001; 治疗效果，P（P）< 0.0001). 因此，BDNF拮抗剂显著降低了TNBS治疗大鼠对腹部机械探测的敏感性。
鞘内中和BDNF可减弱TNBS治疗大鼠鞘内输注对照IgG前后CP.A、Von Frey丝对有害刺激的行为反应。响应平均数图（每根灯丝10次应用）。这些数据表明，对照IgG治疗后反应增加(P（P）<0.001）在CP.B动物中，TNBS治疗大鼠鞘内注射抗BDNF前后的Von Frey丝反应。鞘内注射抗BDNF可显著降低CP动物在VFF测试期间的反应活性(P（P）<0.001）。C、 TNBS治疗大鼠鞘内注射控制性IgG前后对分级电刺激的反应。输注对照IgG前后胰腺电刺激5分钟内的伤害性反应次数。虽然所有动物的电刺激反应都很强烈，但输注后的反应数与输注前的实验相比没有显著差异。D、 TNBS治疗大鼠鞘内注射抗BDNF前后对分级电刺激的反应。在输注抗BDNF之前和之后对胰腺进行电刺激5分钟期间的伤害性反应次数。鞘内注射抗BDNF后，动物对电刺激的反应明显减少(P（P）< 0.01).
BDNF拮抗剂减轻慢性胰腺炎胰腺痛觉过度
上腹壁压力的躯体反应是内脏敏感性的间接标志，并不一定与胰腺有关。为了直接测试胰腺致敏性，我们之前已经建立了一个使用电刺激器官的模型。4虽然电刺激不是一种自然的内脏刺激，但已经证明它会引起动物和人类的疼痛；具体地说，电刺激胰腺会以区域特定的方式对人体产生疼痛。9我们的结果表明，总的来说，与预处理反应相比，TNBS治疗3周后（n=8）大鼠鞘内注射抗BDNF后，对分级电刺激的反应曲线显著降低(; 双向方差分析：刺激效应，P（P）< 0.01; 治疗效果，P（P）< 0.0001). 这种效应在2 mA的刺激下最为明显，在本研究中使用的最高刺激水平（10 mA）下消失。相反，对照IgG输注对TNBS治疗大鼠在任何刺激水平下的疼痛行为均无影响（n=9；).
讨论
伤害性系统的致敏是局部损伤或炎症（如CP）的标志。事实上，在CP患者的标本中发现了胰腺神经形态的显著变化以及相关的炎症细胞病灶。10–16鉴于无法研究这些神经在人类中的功能，这一领域的研究已因合适的动物模型的可用性而得到促进，该模型在形态学上模拟了人类的条件，并具有对胰腺特异性有害刺激的可再现疼痛行为。4在本研究中，我们使用该模型研究了神经递质BDNF在CP疼痛发病机制中的作用。
神经元BDNF与其他神经递质（如SP和CGRP）在同一批初级感觉神经元中共表达和共定位，尽管根据传入刺激的模式，其释放可能不同。17一般来说，BDNF通过自分泌方式增加突触前谷氨酸和其他肽的释放，以促兴奋的方式发挥作用，18,19增强突触后反应N个-甲基-D-天冬氨酸受体，可能由TrkB诱导磷酸化。20–23这些可能包括脊髓中ERK1/2等细胞内信号分子的激活，正如结肠炎和尿膀胱炎大鼠模型所示。24,25此外，BDNF可能以复杂的方式调节GABA释放和氯离子通道。26,27BDNF作用的最有力证据来自拮抗剂研究，使用药理学（抗体和隔离蛋白）以及分子和遗传（反义核苷酸和条件敲除）方法。正如最近回顾的那样，这些研究表明BDNF是炎症疼痛的一种重要介质，对这些模型中的痛觉过敏有显著影响。6内脏疼痛综合征似乎也是如此。在TNBS诱导的大鼠结肠炎模型中，至少有一项内脏疼痛的研究，其中使用系统传递的抗体拮抗BDNF能够逆转对结肠扩张的痛觉过敏反应，但在对照大鼠中没有效果。28
炎症可导致BDNF在多个层面上调：外周神经、其靶组织以及脊髓中的其他结构。我们之前已经证明，在急性胰腺炎中，脑实质中的BDNF参与了似乎是一种普遍的神经营养素上调。29在另一种内脏疼痛模型中，尿囊炎导致膀胱BDNF表达增加。25与我们的研究更为相关的是，慢性胰腺炎患者的外周神经上调，神经和神经结构表达增加，BDNF水平似乎与疼痛强度和频率相关。7这可能反映了BDNF在驱动外周神经敏化中的作用，与其作为脊髓中的神经递质的参与不同。在各种躯体疼痛的炎症模型中，也显示了伤害性神经中BDNF的增加27以及实验性结肠炎。24最后，伤害感受器神经元并不是唯一产生BDNF的细胞；除其他外，小胶质细胞也可能是疼痛状态下BDNF的重要来源，尤其是神经病变引起的疼痛状态。30–33因此，在痛觉感受器特异性BDNF敲除模型中，炎症性而非神经病理性疼痛被减弱。34在我们的研究中，我们重点关注神经BDNF的作用，并表明CP与DRG中BDNF和胰腺相关节段中相应脊髓区域的增加相关。此外，逆行标记实验的结果表明，这种增加至少有一部分是由于胰腺特异性神经元的表达增加，而不仅仅是小胶质细胞等其他脊髓结构的表达增加。总之，我们的结果表明，CP导致初级传入神经元及其脊髓投射中BDNF的上调。
在我们的研究中，我们没有专门研究导致BDNF上调的因素，尽管NGF可能是一种介质。神经生长因子调节肽能伤害感受器的化学敏感性，是炎症状态下初级传入神经元最重要的“敏化剂”之一。在这种情况下，它主要通过其特异性受体TrkA发挥作用，激活多种机制，包括诱导基因可塑性，涉及离子通道和神经递质，包括SP和CGRP。我们之前已经证明，TNBS诱导的CP与胰腺实质中NGF免疫反应增强和持续相关，4,5与在人类CP中观察到的情况类似。35由于BDNF与DRG中的其他感觉神经肽在相同的神经元群中表达，因此BDNF mRNA和蛋白质似乎也受到NGF依赖机制的上调也就不足为奇了。36,37
接下来，我们使用中和抗BDNF抗体在我们的模型中研究了BDNF在介导对胰腺毒性刺激的敏感性中的作用。大多数在疼痛模型中使用这些拮抗剂的研究都评估了单次给药的短期效果。这些结果可能无法预测长期阻断对慢性致敏动物的影响。通过在1周内通过持续鞘内注射“慢性”给予抗BDNF，我们希望消除药物输送的波动，同时避免重复处理动物，这本身可能会产生与经典条件反射模型相关的混淆问题。38使用这种方法，我们已经表明BDNF的拮抗作用将TrkB磷酸化抑制到与无胰腺炎大鼠相同的水平。这一点很重要，因为BDNF在伤害感受中的主要作用似乎是通过其高亲和力受体，即具有内在酪氨酸激酶活性的全长TrkB介导的。
脑源性神经营养因子拮抗剂还显著改善了与CP相关的体细胞超敏反应（通过VFF测试测量）以及胰腺痛觉过敏（通过电刺激反应测量）。BDNF拮抗产生的镇痛程度在较低刺激强度下最为明显。在较高的强度下，该效应消失，表明BDNF的痛觉过敏效应充其量是适度的。然而，考虑到许多其他因素在高强度的有害刺激下起作用，包括释放其他神经肽，如SP和CGRP，这并不完全令人惊讶。可能是由于剂量不足，在较高刺激下缺乏效果；然而，TrkB磷酸化几乎完全抑制到正常水平，这与此相反，并表明BDNF是CP中伤害性敏化的一个重要但不是唯一的介质。在这方面，CP类似于炎症（其中BDNF明显是促伤害性的）而不是神经病理性疼痛模型（不同的研究人员已经证明了抗伤害性和促伤害性）。虽然我们的结果与神经产生的BDNF参与脊髓中的伤害性信号传导一致，但不排除胰腺BDNF（作用于初级神经元的外周末端）的可能作用28,39或脊髓中的胶质BDNF。
总之，我们已经证明，CP与胰腺特异性DRG神经元BDNF表达上调相关，BDNF拮抗剂可以逆转该模型中对有害胰腺刺激的典型行为改变。这项研究还验证了BDNF信号作为治疗CP患者疼痛的合理靶点。
致谢
这项研究得到了美国国立卫生研究院（R01 DK073558 to P.J.P.）和P30 DK56339（斯坦福消化疾病中心）的资助。
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