胆道伤口愈合、导管反应和IL-6/gp130信号在肝脏疾病发展中的作用

摘要

引言

胆道的创伤愈合对肝脏疾病的发展起着重要作用。例如，无效的伤口愈合、壁疤痕和肝外大胆管狭窄的发展是导致诸如肝外胆道闭锁和原发性硬化性胆管炎等疾病的原因。这些是肝移植的主要适应症(网址：http://www.optn.org). 10%-15%的同种异体肝也存在类似问题，即胆汁淤积综合征。相反，由于多种原因，旺盛的伤口愈合反应或导管反应会导致肝硬化的发展[1-三].

位于肝外和肝内大胆管内的BEC具有不同的胚胎起源，并且与位于肝内小胆管的BEC在表型上不同。但关于伤口愈合的考虑因素彼此类似，也类似于其他部位的伤口愈合。胆道的独特方面可能对伤口愈合产生重大影响，包括：（1）解剖和生理学；（2） 接触高浓度胆汁；（3）除直接损伤和溃疡外，其他损伤也会在最小的肝内胆管中引发反应。此外，大胆管或小胆管的慢性炎症和持续的伤口愈合反应往往先于癌症的发展。

在皮肤和肠道中，伤口修复机制取决于损伤的深度。浅表伤口或单纯糜烂主要通过两个步骤愈合：恢复和再生。屏障上皮创面后立即恢复。缺陷边缘附近的细胞与相邻细胞失去紧密接触，发生形状变化，扩散、迁移，然后收缩以闭合孔洞。然而，由于剩余的细胞只能覆盖裸露表面的这么多区域，恢复必然是有限的。在较大的伤口中，还需要再生或增殖剩余的上皮细胞。最终上皮恢复到几乎原始状态[4，5]尽管存活的细胞可能携带着DNA损伤和衰老相关的变化[6]. 较深的伤口涉及上皮细胞和下层基质。血管生成等过程；（肌）成纤维细胞和内皮细胞的激活、迁移和增殖；肉芽组织形成；并且需要收缩伤口来闭合这些较大/较深的缺损。这些较广泛的伤口也经常发炎，一般来说，基质受累和发炎大大增加了后续疤痕形成的风险[7-10].

经常研究伤口修复的上皮方面，在体外通过在汇合的上皮单层中产生线性“伤口”轨迹。通过用化学有丝分裂抑制剂处理培养物来隔离恢复期，以防止细胞增殖导致伤口闭合。上皮细胞在预定时间点从伤口边缘迁移的距离衡量修复的效果。我们开发了一种BEC模型，使用胶原基质基质来防止BEC过早衰老，当BEC被镀在塑料或胶原涂层板上时，BEC会发生早衰，从而干扰测定[11].

“前排细胞”或最靠近缺损的上皮细胞经历上皮细胞-细胞接触的溶解和细胞形状的改变[5，12]. 它们还可以获得一些间充质特征，在某些情况下，可以经历完全的上皮-间充质转化（EMT）[13，14]. 前排细胞和EMT功能发生变化，分解上皮细胞单位，重塑上皮细胞以进行运动。过渡期上皮失去极性、粘附连接、紧密连接和缝隙连接、桥粒和下调的细胞角蛋白中间丝，以重排其F-actin应激纤维并表达丝状体和拉氏体[5，12-14]. 当伤口完全闭合，细胞增殖补充了丢失的细胞时，上皮间连接的重建恢复了屏障。协调这些过程对屏障适应和伤口愈合至关重要[13，14].

胆汁树生理解剖对创伤愈合的潜在影响

胆道树可以被认为是一个精致、相对复杂、独立的器官，它与肝脏沟通，并被肝脏包裹（图​（图1）。1). 它监测、改变胆汁的成分，并将胆汁分入肠道。纤细的动脉血供很容易被疾病和外科手术破坏。BEC和导管周（肌）成纤维细胞之间的密切关系和相互作用贯穿整个胆道树：对一个群体的损伤通常会导致另一个群体发生反应性变化。例如，导管周围（肌）成纤维细胞经常受到激活和增殖，以应对BEC的显著生长、损伤和小胆管的胆汁泄漏[15-21]或大胆管[22-24]. 在肝外和大的肝内胆管中，这会导致壁狭窄和管腔狭窄。在较小的肝内胆管中，可能发生肝纤维化和/或胆管管腔闭塞。丰富的淋巴网络包裹着胆管，并将其排入局部肺门淋巴结[25，26]. 肝外胆管中的许多壁内胆管周腺体在创伤后会被隔开并产生粘液囊肿。所有这些潜在的问题来源都使胆道树有了一个很好的绰号，即肝移植的“阿基里斯之踵”。

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图1

肝外和肝内大胆管示意图强调了一些可能影响伤口愈合的重要解剖和生理因素。除了胆周腺和BEC的一些特征外，小的肝内胆管也有类似的解剖结构。所有胆管，包括小的肝内胆管，仅由肝动脉和胆周血管丛供应，以红色显示。所有胆管的壁上也含有平滑肌细胞和/或兼性肌成纤维细胞。胆道树的深部伤口会导致肌成纤维细胞的活化和/或转化，从而大大增加伤口收缩、纤维化和狭窄形成的风险。

胆汁中含有胆汁盐，可以诱导[27-30]或保护BEC免受凋亡[31]，交叉激活EGFR通过转化生长因子α配体结合[32]，诱导COX-2表达[33]或触发BEC IL-6和其他细胞因子的产生[34]. 胆汁通常还含有几种生长因子（如HGF）、细胞因子（IL-6）和其他分子[35]. 了解各种胆汁成分对伤口愈合（尤其是恢复）的影响至关重要，因为胆汁成分可以在治疗上改变（例如用熊去氧胆酸治疗患者）[36，37].

内嵌最小肝内胆管的BEC来源于成肝细胞，并被认为含有可分化为肝细胞或BEC的肝干细胞群[38-41]. 除了直接损伤和溃疡之外，肝内环境的变化可能会触发这些最小导管的伤口修复反应。这些“导管反应”被认为是BEC和病变肝脏界面区周围的肌成纤维细胞[三，42，43]. 导管反应可能由以下因素引起：（1）局部BEC损伤和炎症[44，45]；（2） 胆道内压升高，以及（3）以下因素的结合：（a）强烈的肝脏再生刺激，如部分肝切除或慢性坏死性炎症性肝病，以及（b）由于致癌物暴露或慢性氧化应激导致肝细胞有丝分裂抑制[1-三]. 最小导管中BEC再生不足会导致肝脏疾病，如慢性“导管开放性”排斥反应和药物诱导的导管开放症[44].

脐外胆道树的伤口愈合

动脉血流量和伤口深度的重要性

对同种异体肝移植中胆汁淤积综合征的研究特别说明了胆道伤口愈合的病理生理机制。这种相对常见且特别令人沮丧的并发症影响大约10%的同种异体肝移植。胆道伤口愈合不良的潜在原因有很多，包括手术造成的解剖异常；由于技术问题、吻合口狭窄、血栓形成或抗体介导的排斥反应导致动脉血流不理想；复发性上升性胆管炎；复发性原发性硬化性胆管炎；和缺血再灌注损伤[46]. 无论何种原因，胆汁引流障碍都会导致进行性肝内纤维化，从而增加发病率并降低器官半衰期。

肝外胆道树仅由肝动脉维持，肝动脉流入三个末端经典毛细血管微血管网，供应：（1）胆管（胆道周围丛），（2）门管结缔组织，以及（3）肝门和肝门周围结构[47]. 同种异体胆道树在术后最初几个月尤其容易发生动脉缺血。保存性损伤会损伤胆周神经丛的微血管。移植手术会损伤动脉血供，也会破坏正常的侧支循环，这是供应所有胃肠器官（包括肝脏）的典型动脉级联结构[46]. 在任何程度上干扰动脉血流都可能导致“缺血性胆管炎”，这是一个简洁的短语，用来描述动脉血流不良和胆道缺血之间的共同联系，表现为持续性溃疡、炎症、淤积和狭窄[48，49].

冷缺血保护损伤耗尽微血管内皮细胞和BEC中的能量储存。这导致金属蛋白酶激活，内皮细胞和BEC从基质中脱落，微血管在再灌注后易发生血栓[50，51]. 移植后再灌注血液也会产生白细胞，白细胞会被组织损伤激活。活化的白细胞释放效应分子，进而导致更多组织损伤并进一步促进血栓形成[50，51]. 胆道树中残留的疏水性胆汁盐也会进一步损害边缘存活的BEC[50，52]已经被保存损伤削弱了。受损的BEC掉入胆汁[53]. 虽然移植后最初几周内患者和同种异体移植物的存活主要取决于实质功能，但长期的同种异体移植存活率主要取决于胆道伤口的愈合和充分的胆汁引流[54，55]. 最终失败的同种异体移植物显示胆汁淤积、粘膜溃疡、炎症肉芽组织以及肝外和肝内大胆管壁中的肌成纤维细胞活化/增殖[55]（图​（图2）。2). 底层基质暴露于胆汁似乎是胆汁污泥结晶的巢穴，并刺激炎症和肌成纤维细胞的活化。这会导致伤口收缩和纤维化，最终导致大口径导管狭窄和小口径导管管腔闭塞（图​（图2C2摄氏度).

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图2

A： 因胆汁淤积综合征而失败的同种异体肝移植肝外胆管的横切面（用虚线勾勒）。注意肝动脉分支沿外壁走行，胆管周围腺体，粘膜溃疡，管腔几乎闭塞。溃疡使下面的基质暴露于胆汁，从而导致炎症、肉芽组织和下面基质中的肌成纤维细胞活化和增殖。插图以较高的放大率显示箭头附近的区域；注意胆汁淤积、恢复期BEC、基质炎症和肉芽组织（箭头所示）；B： 来自同一肝脏的几个大肝内胆管的交叉切片。请注意，同样的过程也发生在这些管道中。左下方的管腔几乎被发炎的肉芽组织和肌成纤维细胞堵塞（插图）；C： 如图所示，肝内胆管“病理性伤口愈合”的最后阶段可导致胆管管腔被同心纤维组织环完全纤维闭塞；D： 同一肝脏周围的切片显示由BEC和导管周肌成纤维细胞组成的显著导管反应（插图）。发生这种情况的原因是胆道管阻塞部位远端的胆道树压力增加。请注意，胆管和肌成纤维细胞形成一个楔形组织，从门静脉道产生，扭曲肝脏结构（如图右侧所示）。

两项观察结果表明，充足的动脉血供应对伤口愈合至关重要。首先，任何直接干扰动脉血流的侮辱通常与大胆管溃疡和狭窄有关。第二，在移植前用低粘度保存液灌注肝动脉和胆周神经丛可显著降低移植后胆道并发症的发生率，而在其他易受影响且冷缺血时间较长的大标准供体肝脏中[56]. 这种方法被认为可以清除胆道周围丛中的血栓形成物质，促进移植后的再灌注和氧合。与许多临床观察一样，这一机制缺乏确证。但可以合理地得出结论，如果没有足够的动脉流量，胆道伤口就不可能正常愈合。一旦确定了足够的动脉流量，就可以更详细地研究其他对BEC伤口修复也有重要贡献的因素。

肝外胆管的深部伤口促使基质细胞参与伤口愈合。颗粒组织和炎症，局部产生干扰素-γ[57]和转化生长因子β（TGF-β）[58]我们的实验室主要关注创伤修复的BEC方面，重点关注白细胞介素6/gp130信号依赖性细胞过程。该信号通路对胃肠道伤口愈合也至关重要[59]和皮肤[60，61].

肝内小胆管-胆管反应的伤口愈合

除了直接损伤和溃疡之外，环境变化也可以在最小肝内胆管的BEC中触发伤口愈合反应。这通常发生在慢性坏死性炎症性肝病中，无论其根本原因如何。几年来，我们一直对以下观察结果感到困惑：导管反应对BEC和肌成纤维细胞来说比肝细胞更具生存优势，但肝细胞和BEC对慢性肝病中上调的许多细胞因子和生长因子（例如HGF、EGF、IL-6、TGFβ、，等.[81，107]). 那么为什么BEC和肌成纤维细胞在这些情况下优先存活。为了回答这个问题，将慢性坏死性炎症性肝病视为应用于肝脏的“达尔文”选择压力是有帮助的。由于增殖率相对增加、死亡率相对降低、肝细胞转化为BEC或上述多种因素的组合，BEC的生存优势可能会出现。无论其机制如何，最终结果是肝细胞体积百分比相对减少，胆道上皮细胞和肌纤维母细胞相对增加，这是肝硬化发展的典型模式[1，74]. 结合足够的时间[1，2]即使是肝细胞存活率的微小缺陷也足以引发导管反应，从而扭曲肝脏结构。

利用建立的失代偿性胆汁性肝硬化小鼠模型[74]对于p21缺陷小鼠，我们验证了肝细胞有丝分裂抑制与胆管结扎再生刺激相结合会加重导管反应并加速结构扭曲的假设。结果表明，长期（12周）结扎后易失代偿的小鼠表现出明显的氧化应激和肝细胞核p21的表达，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂和肝细胞有丝分裂抑制的重要介质[1]. 正如预期的那样，与倾向于代偿的对照组相比，倾向于失代偿的小鼠也表现出较少的肝细胞增殖、过度的导管反应和加速的结构扭曲[1]. 接下来，我们将p21基因缺陷小鼠进行12周的胆管结扎，因为p21基因缺失小鼠的肝细胞增殖显著增强，因此预计其能够更好地补偿长期BDL。事实上，这些实验的结果表明，与野生型对照组相比，p21缺陷小鼠表现出更大的肝质量，因为肝细胞增殖更多，导管反应更少，结构变形更少[1].

接下来我们想确定这个概念是否适用于其他非胆汁淤积性或非胆汁性肝病。为了完成这项任务，我们首先表明等待肝脏替代的人类肝细胞核p21的表达与病理疾病分期和终末期肝病评分模型直接相关[1]. 我们还与Clouston等人进行了一项合作研究，他们此前曾表明，当存在并存的肝脂肪变性时，HCV相关的肝病进展更快[108]. 115名HCV患者脂肪变性、炎症和纤维化评分的肝活检结果显示，（a）导管反应和门脉纤维化，以及（b）脂肪变性和肝细胞复制受损之间存在着强烈的相关性[2]. 脂肪变性与导管反应和肝大祖细胞增殖有关，但不是一个必然特征。即使经过多变量分析，导管反应面积与纤维化分期之间仍存在高度显著的相关性[2]. 由p21表达确定的肝细胞复制受损与肝祖细胞扩张、体重指数增加和小叶炎症独立相关。

当肝细胞有丝分裂抑制与肝再生刺激相结合时，导管反应经常出现，这一观察并不新鲜。它最初是几年前制作的，当时用基因毒性致癌物治疗实验动物，然后对其进行部分肝切除术（参见[三，109，110]). 这些操作刺激卵圆细胞或肝上皮祖细胞[111]，界面区扩张/增殖-导管反应。然而，在致癌实验中，导管反应最终在没有纤维化的情况下消失。

我们的研究表明，这一概念适用于与慢性坏死性炎症性肝病和纤维化/肝硬化发展相关的导管反应[1]（图​（图3）。三). 在慢性坏死性炎症性肝病期间，肝细胞更容易受到损伤和有丝分裂抑制，因为它们：（1）产生和分泌胆汁，是胆汁淤积的主要部位；（2） 代谢更复杂，能够优先储存脂质和金属，例如铁和铜，它们是自由基形成的发生器和/或催化剂；（3）支持HBV和HCV复制，（4）可能最重要的是，线粒体比BEC多，线粒体是产生超氧物的主要场所[112]. 胆汁淤积等多种疾病[1]，HCV复制[113，114]、脂肪变性[2，115]，铜沉积[116]和酒精[117]优先应激或损伤肝细胞，这导致细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21的核表达[1，2]从而抑制肝细胞增殖。

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图3

该图显示了胆道树的外围部分，包括正常（A：图底部）和病变肝脏（B：图顶部）的门脉和门脉周围肝实质。A： 罕见的肝祖细胞或干细胞被认为位于海岭管内，或连接BEC和肝细胞的胆管部分。如图所示，大导管中的BEC、动脉供应和导管周肌成纤维细胞之间的密切关系一直延续到胆道树外围。B： 在慢性坏死性炎症性肝病期间，会出现各种损伤，如胆汁淤积[1]，HCV复制[114，115]、脂肪变性[2，116]铜沉积[117]和酒精[118]可导致氧化应激，尤其是肝细胞。应激上调肝细胞核p21的表达（如图顶部的实心细胞核所示），进而抑制肝细胞增殖并加重导管反应[1，2]. BEC与最小胆管中的导管周肌成纤维细胞之间的密切关系通常导致这些人群的共同激活，这些人群被认为是导管反应，通常发生在肝硬化发生之前。

当药物或慢性同种异体排斥反应导致肝内小胆管破坏（胆管减少）时，典型肝硬化通常不会发展[45，109，118，119]. 尽管存在免疫性肝损伤和纤维化，但再生结节和相关的门脉高压并发症很少发生。这些小导管损伤后BEC的存活和增殖与免疫损伤、环境影响以及重要的动脉血流量有关[120]比如大胆管。也许动脉疾病也会抑制再生结节的形成（图​（图44).

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图4

总结导致慢性肝病和肝癌发展的最常见“伤口修复”反应。尽管文中描述的所有过程都可能发生在胆道树的任何部位，但某些类型的反应在某些部位更为常见。例如，在肝外和大的肝内胆管（右下）中，上皮恢复或增殖不足或无效会导致持续性溃疡、结石和淤泥形成。反过来，这可能导致祖细胞活化和基质受累，这也可能由大导管的“深度损伤”触发。基质受累通常伴有炎症、血管生成、肌成纤维细胞活化和增殖。所有这些过程都会导致伤口收缩和狭窄形成，这是大导管中最常见和最具临床意义的问题之一。

祖细胞活化、持续性伤口修复与癌症

人类慢性坏死性炎症性疾病中持续的导管反应可以激活祖细胞相关系，如上文所讨论的实验动物致癌模型（参考文献38、39、41中所述）。包括我们在内的几个小组已经表明，小鼠卵圆细胞的扩增明显依赖于IL-6/gp130/STAT3信号[121，122]. 这增加了导管反应加速肝硬化发展并可能增加肝细胞癌风险的可能性。因为卵圆细胞最终分化为肝细胞[111]暴露于致癌物或氧化应激引起的基因毒性损伤会在假定的肝干细胞中留下基因突变印记。然后，这些细胞分裂、分化并在整个肝细胞群中更广泛地传播启动细胞。当启动的肝细胞受到肿瘤促进剂的作用时，通常会导致肝细胞增殖，从而发生肝癌。慢性肝病是一个很好的致癌环境。

在皮肤中，STAT3信号使表皮干细胞能够逃避皮肤致癌物诱导的凋亡[123]. 启动的干细胞在促进生长的环境中存活、分裂、分化，并随后引发皮肤癌[123]. 肝细胞癌和胆管癌也可能发生类似的过程。白细胞介素-6/gp130/STAT3信号可能为启动的肝上皮祖细胞提供重要的生存信号，这些祖细胞随后在慢性坏死性炎症疾病的背景下引发肝癌。进化生物学[124]这一过程被称为“拮抗多效性”，即以长期增加癌症风险为代价的短期生存益处。

IL-6/gp130/STAT3信号在多种肿瘤中确实增加，包括肝细胞癌、黑素瘤、白血病和骨髓瘤，以及肺癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、宫颈癌、卵巢癌和头颈癌[125，126]. 这种信号通路参与和/或调节许多在肿瘤发生中重要的通路，包括细胞周期进展、凋亡、肿瘤血管生成、肿瘤细胞侵袭和转移以及免疫系统的肿瘤细胞逃逸（综述于[125，126]).

这一概念是否适用于肝外和肝内胆管癌尚不确定，因为尚未对这些部位的BEC更新机制进行详细研究。在较大的胆管中，新BEC有两个潜在来源：（1）成熟BEC的增殖；（2）祖细胞群体的增殖和/或成熟。这些潜在的来源并不是相互排斥的，文献中只有一项研究甚至间接地涉及到这个话题。Koike等人[127]使用脉冲和连续DNA标记研究表明，在大鼠体内，一个与BEC祖细胞群一致的增殖区位于胆道旁腺（在他们的研究中称为“隐窝”）。对动物的长期随访显示，标记的BEC逐渐迁移到表面并脱落到管腔中，迁移时间约为30-40天[127]. 他们得出结论，肝外胆管中BEC更新的排列和模式与肠道和结肠相似，但BEC更新动力学较慢[127]. 在这方面需要进行更明确的工作。

未回答的问题和未来方向

以下是胆道伤口愈合研究中许多尚未解决的问题的几个例子，这些问题激发了我们实验室的研究。例如，肝外和肝内大胆管的胆道周围腺体或隐窝中是否存在祖细胞群。如果肝外胆道树中存在祖细胞，它们确切位于何处，以及如何识别它们在伤口修复过程中是否激活，它们是否有助于胆管癌的发展

EMT有助于伤口愈合和肾纤维化。EMT是BEC创面愈合和肝纤维化形成的重要过程吗？可以，也可以，BEC转化为肌（成纤维细胞），BEC在导管反应和肝纤维化发生过程中出现迁移并获得间充质特征。胆管结扎后和PBC中，它们从极化立方上皮细胞转变为纺锤状或树突状波形蛋白阳性细胞[128，129]. 在胚胎肝中，胆管板BEC“侵入”或迁移到门管结缔组织，形成成熟的肝内胆管。迁移期间BEC express vimentin[130]和下调膜性E-钙粘蛋白[131]表达式。一旦胆管成熟，BEC完全恢复为上皮表型。我们实验室的初步研究表明，在某些情况下，IL-6/gp130/STAT3信号会触发BEC变化，从而诱导BEC EMT。然而，EMT对BEC伤口愈合的影响程度需要进一步研究。

多项研究表明，IL-6预处理可以预防肝实质缺血再灌注损伤[132-136]. 我们在同种异体肠移植中也显示出类似的结果：IL-6预处理可限制上皮损伤并促进修复[137]. 用IL-6对供体肝脏进行预处理，特别是在主动脉充血时，对胆道周围神经丛的保护性损伤和促进胆道树的伤口愈合具有有益作用。我们希望IL-6/gp130信号能够帮助减少胆道狭窄的发生，因为它上调微血管内皮细胞中的抗凋亡分子[133，136]，保持上皮完整性[11，137]，并刺激BEC恢复[11，73]和再生[79]受伤后。

其他几种策略可用于预防胆道狭窄[138，139]如用曲尼司特减少嗜酸性粒细胞和肥大细胞的积聚[140，141]和卡托普利[142-144]使用抗氧化剂，如α-生育酚（维生素E）和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）配体，如噻唑烷二酮类药物，减少肌成纤维细胞的活化和转化[145-147].

脚注

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