介绍
Hsp90是一种普遍存在的依赖ATP的分子伴侣蛋白，需要激活许多客户蛋白，许多参与癌症和其他疾病的进展(Taipale等人，2010年). 虽然大多数典型伴侣，如Hsp70，识别未折叠蛋白，但Hsp90是唯一的，因为它通过与部分折叠的中间产物结合，在折叠的后期发挥作用(Jakob等人，1995年). 大量研究揭示了一个复杂的ATP水解循环，其中Hsp90经历了剧烈的构象重排(Krukenberg等人，2011年). Hsp90是一种高亲和力的同源二聚体，通过其C末端结构域（CTD）在载脂蛋白状态下二聚，并采用扩展的V形构象(Krukenberg等人，2008年). N末端结构域（NTD）包含核苷酸结合位点，ATP结合稳定结构域重排，使臂以NTD二聚体闭合构象聚集在一起(Ali等人，2006年)，促进ATP水解(Wegele等人，2003年). 而Hsp90的ATP酶活性至关重要(Obermann等人，1998年)目前尚不清楚ATP水解如何促进客户端折叠和激活。
糖皮质激素受体（GR），一种参与关键生物过程的配体激活转录因子(克鲁斯和基诺，2009年)，是一位著名的专为Hsp90客户。体内GR需要Hsp90结合配体并激活(Picard等人，1990年). Hsp90在不同程度上与其他类固醇激素核受体如孕酮受体（PR）相互作用。与大多数核受体一样，GR的活性通过其C末端配体结合域（LBD）进行调节，LBD是一种螺旋结构，配体结合囊位于结构域的核心。在没有配体的情况下，LBD被认为是动态的，配体提供了结构稳定性和LBD与共调节蛋白相互作用以调节转录的变构控制能力(贝恩等人，2007年). Hsp90通过其LBD（GRLBD）直接与GR相互作用(霍华德等人，1990年).
目前尚不清楚为什么需要Hsp90，或者Hsp90如何激活GR进行配体结合。GR早期重建实验(Pratt等人，2006年)PR确定成熟途径中的中心蛋白包括Hsp40、Hsp70、Hsp90、HOP和p23(Dittmar等人，1996年;Kosano等人，1998年). 这些实验确定了蛋白质进入和退出通路的一般顺序(Morishima等人，2000b)，Hsp40和Hsp70首先将受体传递给Hsp90(Hernández等人，2002年;Smith等人，1992年). HOP最初被认为只是一种衔接蛋白，通过在两个伴侣之间提供物理连接来促进传递(Chen和Smith，1998年). 然而，最近对Hsp90:HOP复合物的冷冻电镜重建显示，HOP与Hsp90形成广泛的相互作用，预先组织Hsp90 NTD以进行ATP水解和客户结合(Southworth和Agard，2011年). 第二个Hsp90辅酶酮p23在该途径中作用较晚，与GR处于配体结合活性态的Hsp90复合体结合(Dittmar等人，1997年). 虽然HOP和p23在Hsp90上与地区区域绑定，但它们的绑定具有竞争力。HOP结合到开放状态，而p23需要闭合核苷酸结合状态().
Hsp90系统从Hsp70抑制中恢复GR配体结合并增强配体结合A） 没有核苷酸，Hsp90处于扩展开放状态。在ATP稳定关闭状态下，NTD二聚化需要绕MD界面旋转NTD。HOP用旋转的NTD绑定中间开放状态，p23绑定闭合ATP绑定状态。
B） 的实验方案.
C） 20nM F-dex与1µM MBP-GRLBD与不同伴侣成分的平衡结合（±SD）。检测条件；50µM 17AAG、2µM Hsp40和15µM Hsp70、Hsp90、HOP和p23。
D） 用2µM Hsp40将20nM F-dex与1µM MBP-GRLBD结合的饱和度图，以及15µ米Hsp70、HOP和p23，随着Hsp90 WT（红色）的增加，水解死亡的Hsp90；E47A（黑色）和D93N（蓝色）（±SD）。WT-Hsp90结合曲线符合半最大有效浓度方程。
E） 20nM F-dex与300nM MBP-GRLBD单独（蓝色）以及2µM Hsp40、15µM Hsp70、Hsp90、HOP和p23（红色）的结合动力学符合单相结合。
F） 100nM F-dex与1µM MBP-GRLBD（蓝色）和15µM Hsp70、2µM Hesp40和10µM Hsp90、HOP和p23（红色）结合的归一化解离动力学。关闭速度分别为0.041±0.004 min−1和0.059±0.002分钟−1（±SEM）（图S4D）。
G） 平均k光突发事件与GRLBD（蓝色）和15µM Hsp70、2µM Hsp40和10µM H sp90、HOP和p23（红色）的3-5个单独实验中的GRLBD浓度的关系（±SEM）。根据线性拟合斜率确定的速率为0.165±0.008和0.304±0.072µM−1最小值−1带伴侣（±斜率加权误差）（图S4C）。
H） 20nM F-dex与GRLBD的归一化平衡结合（蓝色），以及与15µM Hsp70、2µM Hsp40和10µM H sp90、HOP和p23（红色）的归一性平衡结合（2个单独实验的平均值（±SD）。
I） 平均配体KD类对于有或无伴侣的GRLBD，由5个单独的实验确定（如). K（K）D类伴随伴侣从201±42nM降至66±12nM（±SEM）。另请参见图S3和S4.
与大多数专为Hsp90服务的客户一样，GR的深入生化研究因难以获得稳定的载脂蛋白而受到阻碍在体外调查。因此，以前的GR研究都是针对质量可变且仅限于基本特征的蛋白质进行的。也就是说，在第一次纯粹在体外研究表明，变性和复性的GRLBD可以刺激Hsp90的水解，表明纯化的Hsp90和GRLBD之间存在直接的相互作用(McLaughlin等人，2002年).
我们研究的目的是详细确定Hsp90如何促进GR配体结合，并在这样做的过程中，为了解Hsp90是如何激活真正的客户提供急需的信息。在一个完整的在体外系统中，我们直接测量GRLBD配体结合。与…相反体内，我们纯化的apo GRLBD结合配体，无需Hsp90的辅助或增强。在apoGR稳定的条件下工作，对Hsp90的生物依赖性只有在包括Hsp70、Hsp90和三种特定耳蜗的整个伴侣系统的背景下才能完全理解。在这些条件下，我们发现Hsp70和Hsp90伴侣循环紧密相连，Hsp70与Hsp90协同调节和增强GR功能。
结果
不含Hsp90的纯化GRLBD结合配体
为了获得可行数量的GRLBD，同时尽可能接近野生型，我们使用了一个溶解度增强突变（F602S）(Ricketson等人，2007年). 虽然活化对Hsp90的依赖性较小体内，这种突变允许在细菌中大规模表达(Bledsoe等人，2002年). GRLBD（F602S），除非另有规定，否则称为GRLBD，在存在配体的情况下纯化至均匀，然后进行大量透析以去除配体。GRLBD可以在无溶解度标记的情况下在载脂蛋白状态下纯化和获得，但经验证，N末端MBP标记不会干扰所示的实验，并且通常会保留下来，因为它在较长的实验时间内增强了稳定性。
通过测量荧光素标记地塞米松（F-dex）与GRLBD结合时荧光偏振的增加来监测配体结合。如前所述，但与之相反体内(Bledsoe等人，2002年)，纯化的GRLBD可以在没有伴侣的情况下结合配体(). F-dex结合动力学显示出标准的单相缔合和解离动力学，缔合发生的速度远快于解离，表明我们的GRLBD是无配体的。在我们的实验条件下，平衡测量结果是离解常数（KD类)150±20 nM(). 考虑到Hsp90的戏剧性效果体内我们感到惊讶的是，没有检测到Hsp90增强配体结合(). 即使使用p23和HOP，也未观察到显著的Hsp90效应（未显示）。此外，我们无法重现先前报道的GRLBD对Hsp90的ATP酶活性的刺激，尽管我们注意到之前用于稳定GRLBD的洗涤剂也可以刺激ATP酶活性。相比之下，我们使用Hsp90酵母进行研究，发现其ATP酶活性更高，我们证实了最近报道的GRLBD抑制作用(Lorenz等人，2014年)（未显示）。
GR配体结合活性体外试验Hsp90是否独立A） 通过荧光偏振测量20nM F-dex与GRLBD的平衡结合（±SD）。绑定曲线拟合KD类154±14nM（±SEM）。
B） 与5mM ATP/MgCl的平衡结合2单独使用GRLBD（蓝色）和5µM Hsp90（红色）（±SD）。
由于已知GRLBD突变会影响GRLBD的构象和配体结合特性(Pfaff和Fletterick，2010年;Ricketson等人，2007年)我们希望确保F602S突变不是独立功能性GRLBD或缺乏ATP酶加速的原因。从可以纯化的少量WT-GRLBD中，WT-GRLDD不仅能够结合配体，而且比F602S突变体具有更高的亲和力(图S1A)，与之前报告一致的趋势(Ricketson等人，2007年). 使用WT GRLBD，我们仍然无法检测到对Hsp90的ATP酶速率的显著影响（未显示）。值得注意的是，我们纯化的GRLBD与观察到ATP酶刺激的变性和复性蛋白质处于非常不同的功能状态。除了配体亲和力相差近300倍（150nM比46µM）之外，我们纯化的载脂蛋白F602S和WT GRLBD都是单体(图S2B)而重折叠蛋白是二聚体(麦克劳林和杰克逊，2002年)这表明这两项研究不应进行比较。总之，不依赖F602S突变，我们纯化的GRLBD可以独立发挥作用，并且我们无法检测到仅GRLBD和Hsp90之间的任何显著的高亲和力功能相互作用。
Hsp70通过部分展开GR抑制GR配体结合
由于Hsp70可以促进客户向Hsp90的交付，我们推断Hsp70可能会稳定GRLBD的状态，从而更好地与Hsp90交互；因此，增强Hsp90对配体结合可能产生的任何影响。值得注意的是，apo GRLBD仅与Hsp70系统预孵育，导致完全抑制GRLBD配体结合(). 基于先前的研究(Dittmar等人，1998年)，我们使用亚化学计量的酵母Hsp40（Ydj1）来加速Hsp70-ATP水解。通过ATP，Hsp70底物结合盖打开，水解引发变构变化，导致盖子关闭，促进稳定的高亲和力底物结合并防止聚集() (梅耶和布考，2005年). Hsp40本身没有作用，但需要抑制GRLBD()并促进Hsp70与GRLBD的稳定结合(图S1D). ATP水解也是必不可少的，因为AMPPNP或ADP未观察到GRLBD抑制(图S1C). Hsp70的浓度依赖性显示出与IC的协同抑制模式504.6±0.6µM，希尔系数1.6±0.6(). F602S突变对IC无影响50(图S1E).
Hsp70抑制GR配体结合A） F-dex与GRLBD（蓝色）、Hsp40（黄色）、Hps70和ATP（黑色）以及Hsp40、Hsp70和ATP的关联动力学（红色）。分析条件：5mM ATP/MgCl2、50nM F-dex、1µM MBP-GRLBD、2µM Hsp40和15µM Hsp70。
B） Hsp70的伴侣酮循环。ATP结合的NBD打开SBD，使底物结合较弱。底物和Hsp40刺激ATP水解，导致高亲和力底物结合状态，盖子被锁住。底物释放发生在ADP：核苷酸交换因子（NEF）促进的ATP交换。
C） 1µM MBP-GRLBD与20nM F-dex（与2µM Hsp40）平衡结合的Hsp70浓度依赖性（±SD）。拟合合作竞争绑定模型会产生IC504.6±0.4µM，希尔系数1.6±0.4μM（±SEM）。
D） 100nM F-dex与MBP-GRLBD（含2µM Hsp40）的解离是由过量（100µM）的未标记dex（蓝色）和15µM的Hsp70（红色）引发的，符合单指数衰减。插图显示平均关闭率；0.029±0.002分钟−1和0.066±0.005分钟−1使用Hsp70（±SEM）。另请参见图S1.
虽然这些数据表明Hsp70可以与载脂蛋白GRLBD结合并阻止配体结合，但我们想知道Hsp70是否会主动取代已经与配体结合的GRLBD中的配体。为了研究这一点，GRLBD与Hsp40和F-dex进行了预平衡，并由过量的未标记dex引发配体解离，无论是否含有Hsp70(). 我们发现，Hsp70加速了F-dex的分解2倍以上，表明Hsp70可以直接催化GRLBD中配体的去除。
从上面我们假设Hsp70积极促进GRLBD去折叠，从而破坏配体识别所需的构象。我们的预期是，Hsp70将显著地将平衡转向完全展开的GRLBD。然而，有限的蛋白水解仅在单个区域（螺旋3，图S2A). 通过氢氘交换耦合质谱（HDX-MS）对Hsp70诱导的去折叠进行了更为定量的研究。虽然仅Hsp40没有影响（未显示），但在三个有限的GRLBD区域，Hsp70和Hsp40的H/D交换显著增加(和图S2). 螺旋3（残基564-573）和β-片状区域（残基621-631）的增加幅度最大。这与有限的蛋白水解有关，证实了Hsp70只诱导局部去折叠。有趣的是，除了破坏局部结构和与配体的重要疏水接触外，螺旋3上受影响最大的区域还包含残基N564和Q570，它们形成了GRLBD和配体之间六个氢键中的三个(). 这表明，虽然整体去折叠的程度是最小的，但它位于配体结合的最佳破坏位置。
氢交换质谱法检测Hsp70对GRLBD部分展开的影响GRLBD和Hsp70结合的GRLBD之间的差异HDX映射到GRLBD（1M2Z）的dex和辅激活肽结合的晶体结构上。平均HDX的差异以百分比变化表示，并根据键进行着色，Hsp70使用橙色更快。括号内的数字是3个重复之间的标准偏差。图中显示了发生最显著构象变化的区域的相应氘积累曲线（±SD）。右上角显示放大dex，以及螺旋3形成的三个氢键。另请参见图S2.
Hsp90恢复GR配体结合
鉴于Hsp90至关重要体内对于配体结合，以及我们发现Hsp70使GRLBD处于非活性状态，我们探索了Hsp90将GRLBD从Hsp70抑制中解放出来的能力。在与Hsp70和Hsp40的预孵育中加入Hsp90后，配体结合的恢复最小(). 相比之下，Hsp90和HOP或p23均能显著恢复。完全恢复需要两个耳蜗。用于HOP和p23的浓度在其效果上是饱和的；因此，部分恢复不是由于蛋白质不足（未显示）。配体结合的恢复完全依赖于Hsp90，因为没有Hsp90或使用特定的Hsp90抑制剂17AAG时没有恢复。因此，Hsp90是恢复配体结合所需的活性成分，概括了其体内要求。有趣的是，在Hsp90二聚体和GRLBD的化学计量量下，GRLBD回收的Hsp90浓度依赖性饱和(). 这表明单体GRLBD和二聚体Hsp90之间存在1:1的相互作用，并表明Hsp90和耳蜗酮与Hsp70:GRLBD复合物紧密结合，估计KD类约为200nM或更少。
释放Hsp70抑制需要Hsp90的ATP水解
17AAG与Hsp90的ATP结合口袋结合并阻止核苷酸结合，其抑制作用表明ATP对恢复GRLBD配体结合的重要性。为了进一步探索，我们利用了Hsp90中两个先前特征化的水解死亡突变：不能结合核苷酸的D93N和能结合核苷酸并闭合但不能水解ATP的E47A(Obermann等人，1998年). 两个突变体都无法恢复配体结合()，表明需要核苷酸结合和水解来逆转Hsp70抑制。
下拉研究表明，在伴侣存在下，Hsp90:Hsp70:HOP:GRLBD复合物形成，17AAG和Hsp90突变都不能阻止这种大复合物的形成(图S3). 相比之下，抑制ATP水解导致p23结合缺失。p23和HOP的结合似乎弱于其他组分，并通过western blot进行了额外的检测。这证实了HOP的存在，并且没有发现p23与Hsp90突变或17AAG结合(图S3). 对于D93N，这是预期的，因为该突变体不能结合ATP，而ATP是稳定p23结合的闭合状态所必需的(Ali等人，2006年). 相比之下，由于E47A已被证明支持p23和Hsp90之间的二元相互作用，因此p23与E47A突变的GR复合物结合的显著缺失是意料之外的(Johnson等人，2007年). 在整个系统中，p23与E47A突变体结合的缺失表明，在水解之前，p23结合被Hsp90:GR复合物的某些成分抑制。
这一点，再加上无法恢复配体结合，清楚地表明Hsp90上的水解有助于释放Hsp70抑制所需的途径中的一个重要步骤，并且阻断水解会导致与Hsp70、Hsp90和HOP（而不是p23）形成停滞的非活性中间络合物。因此，p23在受体成熟途径中的作用必须发生在Hsp90的水解后状态。
Hsp70和Hsp90的协同作用增强GR配体亲和力
在研究全伴侣系统对配体结合恢复的反应时，我们注意到与配体结合的GRLBD数量略有增加(). 这种增强并不是由于激活了GRLBD群体中先前不活跃的部分，因为整个伴侣系统并没有改变GRLBD的特定活性(图S4A). 相反，全伴侣系统以Hsp90浓度依赖的方式加速配体结合率(图S4B). 比较F-dex与GRLBD单独或GRLBD与整个伴侣系统饱和量预平衡的结合和分离率()揭示了两个协会的加速()和离解率(). 所观察到的分离速度大约快1.5倍，与仅用Hsp70系统测量的分离速度相似(). On速率由k的线性拟合斜率确定光突发事件在不同GRLBD浓度下测量()，与陪护人员在速度上加快约2倍(图S4C). 此外，平衡测量显示K值增加了约3倍D类和陪同人员一起(和S4E系列). 这些数据表明，在完整的伴侣系统中，Hsp90比单独的GRLBD具有更高的配体亲和力构象，因此表明伴侣结合复合物能够直接结合配体。
Hsp90:HOP:Hsp70:GR复合物支持Hsp90和Hsp70-ATP水解循环的耦合
为了提供一个理解Hsp70和Hsp90之间GR传递的结构框架，我们纯化了具有一个Hsp90二聚体和Hsp70、HOP和GRLBD各一个拷贝的中间复合物(图S5)，并利用单粒子冷冻EM获得三维重建。使用组装反应和运行缓冲液的目的是捕获Hsp70的GRLBD结合ADP状态和Hsp90的apo-HOP结合状态。虽然重建的分辨率估计为38º，并且可能受到样品异质性的限制，但单个Hsp90和Hsp70结构域的大小和独特形状使这些成分在复合体中的总体结构得以高置信度地确定(). Hsp90与之前的Hsp90-HOP EM结构类似，处于V形状态(Southworth和Agard，2011年)然而，整个Hsp90组织明显不对称，只有一个单体具有HOP络合物和Hsp90封闭ATP态晶体结构中所示的完全旋转的N末端结构域（NTD）取向(Ali等人，2006年). 为了适应我们的密度，其他Hsp90 NTD需要围绕NTD中间域（MD）接口向外旋转约23°(图S6A). 符合HOP诱导构象的相反的Hsp90单体有两个以MD为中心的额外密度区域，这可能对应于显示为GR活化所必需和充分的HOP域（TPR2A、TPR2B和DP2）(Schmid等人，2012年).
Hsp90、Hsp70、HOP、GRLBD复合物的冷冻电镜重建A） Hsp90、Hsp70、HOP、GRLBD复合物的冷冻EM重建，过滤至38℃。
B） 用Hsp70-NTD（3ATU）和SBD（1DKX）在青色中放置，以及Hsp90-NTD旋转HOP模型在A中进行低温EM重建(Southworth和Agard，2011年)洋红。客户绑定站点残留物大肠杆菌热休克蛋白90；E466、W467、N470显示为红色，M546、M550、L553、F554显示为蓝色(Genest等人，2013年).
C） 俯视图显示Hsp70域（青色）之间链接器的密度。
D） 顶视图显示Hsp70 NTD在Hsp90 NTD之间的定位。另请参见图S5和S6.
该复合物最显著的特征是Hsp70底物结合域（SBD），它从Hsp70上的底物结合位点延伸到Hsp90的MD和C末端域（CTD）界面具有额外的密度，这表明GRLBD同时与Hsp90和Hsp70结合。此外，Hsp70似乎正在将GRLBD直接递送到最初在大肠杆菌热休克蛋白90(Genest等人，2013年). 在酵母中测试时，该区域的突变对GR信号传导有显著影响体内事实上，CTD双亲螺旋的结合位点部分被认为与apo GRLBD直接接触(Fang等人，2006年).
正如ADP状态下的Hsp70所预期的那样，Hsp70 SBD与其核苷酸结合结构域（NBD）分离。这两个域之间不仅有明显的方向，而且可以看到连接密度(). 重建的一个令人惊讶的方面是，Hsp70 NBD位于两个Hsp90 NTD之间。Hsp90和Hsp70之间的直接接触是意料之外的，因为在体外Hsp90和Hsp70之间的结合仅在HOP存在时检测到，HOP通过单独的TPR域独立结合两者。由此得出结论，HOP是一个被动连接体，Hsp70:Hsp90相互作用纯粹是通过与HOP的物理连接实现的。虽然Hsp70-NBD似乎与两个Hsp90-NTD都接触，但它与HOP结合的Hsp90单体的ATP酶结构域有更强的联系。这种连接的形成需要HOP诱导的Hsp90构象，这表明HOP不仅为接收客户预先组织了Hsp90，还为与Hsp70的相互作用预先组织了它。
利用Hsp70域连接子作为约束，Hsp70 NTD最适合EM密度，使得IB瓣接近Hsp90的HOP臂，IIA瓣的基部接近相对的Hsp90 NTD(). 有趣的是，这种取向表明Hsp90核苷酸结合口袋的盖子位于与Hsp70 NBD接触的区域。这种潜在相互作用的功能意义重大，因为Hsp70和Hsp90的ATP酶结构域之间的直接接触为我们的配体结合研究所建议的两个水解环的耦合提供了结构基础。
Hsp90是一种具有伴侣功能的Hsp70释放因子
上述实验表明，在一个需要Hsp90水解ATP的过程中，Hsp90逆转了Hsp70的抑制作用，可能是通过促进GRLBD释放Hsp70。在没有其他因素的情况下，Hsp70的底物释放缓慢，但核苷酸交换因子促进了ADP的释放，使ATP重新结合，并打开底物结合位点和盖子(梅耶和布考，2005年). 我们试图在GR配体结合试验中直接对比Hsp90和传统的Hsp70交换因子。我们选择了特征良好的Bag-1，因为它能够刺激Hsp70 ADP和客户端释放(Sondermann等人，2001年)以及Bag-1在GR降解途径中发挥作用的证据(Demand等人，2001年).
Bag-1从Hsp70中诱导的GRLBD释放通过下拉证实(图S1D). 为了进行功能比较，我们预先形成了抑制的Hsp70-GRLBD复合物，然后监测Bag-1或Hsp90加HOP和p23刺激的Hsp70释放导致的F-dex结合动力学(). 在这些条件下，Hsp90系统显示出配体结合恢复的滞后阶段(和图S7A). 缓慢的恢复可以解释为Hsp70–Hsp90客户端移交所需的时间，因为它依赖于缓慢的Hsp90水解速度。事实上，先前的结果表明，Hsp90 ATP水解是循环中的限速步骤(Morishima等人，2001年). 使用Hsp90，完全配体结合恢复40分钟，并在实验期间保持。Bag-1功能迅速，配体结合迅速恢复（<10分钟）。通过释放Bag-1观察到的配体结合率比F-dex自身与GRLBD的基础结合快约2倍，但随后配体结合稳步下降。这种减少相对较慢，并随时间呈线性变化，直到几乎所有配体结合丧失3小时。光散射的增加表明功能的丧失与聚集有关(). 值得注意的是，在实验过程中，没有伴侣的GRLBD能够保持完全的配体结合，并且在该温度下通过光散射没有表现出聚集。这表明直接从Hsp70而不是从Hsp90系统释放的GRLBD处于聚集倾向状态，这意味着额外的GRLBD折叠可能发生在Hsp90上。这表明Hsp90有两种不同的功能；一个是Hsp70释放GRLBD，另一个是伴侣功能。
Hsp90的水解非依赖性伴侣功能对维持活性GR群体至关重要A） Hsp70和Hsp40预抑制B.GRLBD的实验方案，并与F-dex平衡。配体结合是由Bag-1或Hsp90系统启动的。
B） 配体结合起始于：Bag-1（黑色）、Hsp90与HOP和p23（红色）、Hps90（E47A）与HOP及p23（绿色）、Bag-1与Hsp90及HOP和p23（紫色）、Bag-1与Hps90的结合（E47A）与HOP及p23的结合（黄色）。同样显示，GRLBD单独与F-dex（蓝色）预孵育。分析条件：50nM F-dex，1µM MBP-GRLBD，2µM Hsp40，15µ米Hsp70、Hsp90、HOP、p23和Bag-1。
C） GRLBD（蓝色）的光散射时间过程，以及与Hsp40和Hsp70预孵育的GRLBD的（A），时间过程由Bag-1（黑色）启动。条件与B相同，但没有F-dex。另请参见图S7.
而Hsp90逆转Hsp70抑制的能力依赖于ATP水解()，我们想确定伴侣功能是否也是如此。为此，我们研究了Bag-1和Hsp90（与Hop和p23）的联合作用。当加在一起时，可以看到类似Bag-1的快速恢复，但随后Hsp90系统将保持全部活动(). 这表明，在Bag-1释放Hsp70的情况下，Hsp90与HOP和p23可以起到防止GRLBD功能丧失的作用。为了真正将Hsp70释放与伴侣功能解耦，Bag-1中添加了水解死亡的Hsp90 E47A（含HOP和p23）。使用Bag-1，Hsp90 E47A与野生型Hsp90一样能够防止GRLBD功能丧失()，清楚地表明伴侣功能独立于ATP水解。这与早期研究相关，该研究表明Hsp90与未折叠的中间产物相互作用并防止聚集的能力是ATP独立的(Jakob等人，1995年).
对Bag-1和Hsp90联合作用的进一步研究表明，HOP和p23的缺失仅导致部分功能丧失受到抑制，这表明两种耳蜗都需要完全维持GRLBD功能(图S7B). 与带有p23的Hsp90的D93N突变体一样，在没有p23的情况下也出现了等效的功能丧失，这表明使用p23访问闭合状态是Hsp90伴侣功能的一个重要方面(图S7C). 总之，这表明Bag-1在与Hsp90和HOP的停滞复合物中促进Hsp70的核苷酸交换的途径中发挥作用。当使用Hsp90系统将Bag-1添加到GRLBD下拉时，可以进一步证明这一点。添加Bag-1导致Hsp70和HOP水平降低，并显著增强p23的结合(图S3).
讨论
在重组GRLBD稳定的条件下体内对Hsp90激活的要求需要在通往Hsp70系统的路径中查找上游。在这里，我们显示与Hsp70的关联局部展开GRLBD，导致失活。在这种抑制状态下，Hsp90促进配体结合的恢复，解释了体内GR功能对Hsp90的要求。与短暂切换中微弱的相互作用不同，整个耳蜗与Hsp90之间存在紧密的协调，这种生化协调与Hsp90:Hsp70:HOP:GRLBD复合体低温EM重建中的整体物理协调相匹配。在这个复合体中，Hsp90和Hsp70之间的互连体现在Hsp90上MD:CTD客户端结合位点附近的Hsp70底物结合区域的定位以及两个ATP酶域之间的直接相互作用。这为通过配体结合恢复观察到的两个水解循环的耦合提供了结构解释。
Hsp90对ATP的水解对于逆转Hsp70抑制至关重要。考虑到水解的能量集中在驱动促进活化的客户端构象重排上，这是令人惊讶的。相反，我们的结果表明，水解被用于调节客户转移和Hsp70释放。我们的工作也为Hsp90抑制剂如何影响伴侣系统提供了新的见解。阻断ATP结合囊的Hsp90抑制剂不能阻止Hsp90与Hsp70、HOP和GR中间复合物的结合(怀特塞尔和库克，1996年)，但如图所示，它们阻止了Hsp70介导的客户端抑制的逆转。体内，Hsp90的ATP酶的抑制导致GR以及其他Hsp90客户端的蛋白水解降解，揭示了客户端切换失败与通过Hsp70途径进行的降解之间的直接联系(Stankiewicz等人，2010年). 因此，从Hsp70到Hsp90的交接是决定客户命运的关键调节点。
除了Hsp70释放功能外，将Hsp90与Hsp70核苷酸交换因子Bag-1进行比较，发现Hsp90还提供了维持Hsp70释药后客户稳定性所需的伴侣功能。我们的工作为Hsp90系统提供的功能增强提供了第一个直接证据，并且解释了Hsp90在GR的整个功能寿命期间，而不仅仅是在初始折叠期间的构成要求。
Hsp70结合并诱导GRLBD的部分展开
遗传研究表明Hsp40的缺失体内在缺乏和存在激素的情况下导致GR信号升高(Kimura等人，1995年). 本文报道的Hsp40依赖性Hsp70抑制作用解释了这种相关性。缺乏激素时GR信号升高表明Hsp70的失活作用超出了配体结合抑制作用，并指出Hsp70是在缺乏配体时保持GR处于非活性、非DNA结合状态的关键成分。
Hsp70促进配体释放的观察结果令人惊讶。这意味着Hsp70可以与GRLBD的配体结合形式结合，并通过去折叠积极促进配体解离。GRLBD中观察到的最小程度的去折叠也令人惊讶，因为已知Hsp70以未折叠状态结合蛋白质。在晶体结构中，Hsp70的盖子在未折叠的多肽上锁住，这需要对结合的客户端进行显著的展开(朱等人，1996). 然而，有证据表明，当Hsp70处于更自然的状态时，它可以与一些蛋白质结合(Wawrzynow等人，1995年). 其中σ32类似地，在Hsp70结合时仅部分展开(罗德里格斯等人，2008年). 在这个案例中，最近的证据表明Hsp70盖子没有完全锁定(Schlecht等人，2011年)这表明Hsp70可以容纳具有不同程度三级结构的蛋白质底物，例如部分折叠的GRLBD。事实上，与肽结合结构中的弯曲构象相比，延伸盖构象更适合我们的络合物的EM密度(图S6C). 由于ADP状态下底物亲和力的增加大多来自底物结合位点内的构象变化(Mayer等人，2000年)，似乎GRLBD仍然安全绑定。
更一般地说，Hsp70加速紧密结合GR配体释放的能力表明一种未被认可的机制，即催化去折叠可以对细胞配体浓度的突然降低做出更快的反应。伴侣被认为参与转录复合物的分解(弗里曼和山本，2001年)然而，大多数注意力都集中在Hsp90和p23上(Freeman和Yamamoto，2002年). 我们的发现表明，Hsp70在促进GR转录复合物分解中的作用被忽视了。
Hsp70:Hsp90系统对GR折叠态的调制增强了GR的稳定性、功能和调节
虽然Pratt及其同事已经研究了Hsp70在GR传递到Hsp90中的作用，但Hsp70的失活功能以及因此Hsp90在逆转抑制中的作用尚未得到重视。这可能是因为这些研究中使用的GR从一开始就处于非活动状态。值得注意的是，在相关研究中，纯化的PR在冰上可以结合配体，而伴侣只需要在高温下保持配体结合(Smith，1993年). 类似地，虽然我们的功能性apoGRLBD可以维持在25°C，但在低至30°C的温度下检测到GRLBD的热诱导聚集，没有可溶性增强的MBP标记（未显示）。这表明，在我们的实验条件下，载脂蛋白受体只是略微稳定。此外，Pratt及其同事使用的全长野生型结构可能更不稳定，可能折叠错误或已经形成小聚集体，因此需要Hsp70和Hsp90协同展开，然后再折叠受体以获得配体结合。这突出了GR的不稳定性和伴侣互动的真正需要体内.
Pratt及其同事此前提出，Hsp90使配体结合裂开(Pratt等人，2008年). 在他们的模型中，Hsp70被要求“启动”受体，而Hsp90以ATP依赖的方式打开结合间隙。我们的数据表明，Hsp70的“启动”是打开结合囊，而ATP水解Hsp90的关键事件是释放Hsp70。在任何一种情况下，最终结果都是GRLBD通过开放的结合口袋与Hsp90结合（因此我们的配体接通速度更快）。
考虑到这一点，核激素受体可能对Hsp90:Hsp70伴侣产生调节依赖性，因为它们是一类蛋白质，部分去折叠可能有益。如我们的模型所示()，我们建议LBD必须部分展开以允许配体进入和释放。因此，用Hsp70展开是打开装订袋的关键步骤。Hsp70实现这一点的机制尚不清楚。平衡抑制中的协同作用可能是两个Hsp70结合事件同时作用的结果，然而，在GRLBD构象的多状态平衡中，也可能是一个Hsp七十与不同GRLBD折叠状态之间不同结合亲和力的结果，表现为明显的协同作用。动力学建模不能排除任何一种模型。沿着这些思路，以前的一份报告建议，在Hsp70启动步骤中，要么一个Hsp70在GR上交互循环，要么两个Hsp70s依次作用(Morishima等人，2001年). 虽然确切的机制尚不清楚，但很明显，虽然GRLBD与Hsp70结合，但缺乏配体结合的基本结构决定簇，而配体结合只有在NEF或Hsp90系统释放Hsp70后折叠完成才能获得。虽然Bag-1以部分未折叠状态释放的GRLBD比单独释放的GRLBD结合配体更快，但在不受Hsp90影响的情况下，它很容易聚集，因此在Hsp70结合和释放的每个周期中都会丢失一部分GRLBD。
GR配体结合模型载脂蛋白GRLBD本身主要是折叠的，暂时采样一种更非结构化的状态，在这种状态下，蛋白质核心的结合囊是可接近的，允许配体结合和分离。在需要ATP水解和Hsp40的过程中，Hsp70与GRLBD结合，并通过稳定部分未折叠的非活性状态促进配体释放。当NEF Bag-1刺激Hsp70释放GRLBD时，GRLBD以部分未折叠状态快速释放，虽然能够结合配体，但容易聚集。在Hsp90存在下，GRLBD结合的Hsp70通过HOP与Hsp90结合在一起，形成一个非活性络合物。Hsp90上的后续ATP水解需要释放Hsp70（和HOP），允许进入闭合状态和p23结合。Hsp90和Bag-1共同促进Hsp70释放，从而不需要Hsp90 ATP水解。与Hsp90和p23形成成熟复合物导致高亲和力配体结合。
在Hsp90系统存在的情况下，HOP招募了GRLBD:Hsp70复合体，以便GRLBD在靠近Hsp90的客户端绑定位点的位置传递。EM密度表明GRLBD与Hsp90直接接触，但仍与Hsp70结合。从这种被抑制的状态，Hsp70的释放需要在Hsp90上水解。HOP通过促进Hsp70和Hsp90 ATP酶域之间接触所需的NM旋转来调节这种相互作用。在没有HOP的情况下，Hsp90可能会获得这种构象，尽管效率较低，因此可以解释没有HOP时出现的部分配体结合恢复。这与之前的研究结果一致，之前的研究也显示在没有HOP的情况下约50%的GR激活(Morishima等人，2000a)HOP促进了Hsp70-Hsp90相互作用，这种作用可以在没有HOP的情况下发生，但效率很低(Morishima等人，2000年b).
虽然我们没有提供直接证据证明Hsp90促进Hsp70释放ADP，但基于Hsp90和Hsp70在EM重建中的直接接触，这一结论具有很强的启发性。在催化死亡的Hsp90的情况下，该复合物被停止，GR活化无法实现。然而，在Bag-1存在的情况下，GR激活不需要Hsp90上的ATP水解。我们的数据表明，Bag-1在Hsp90通路中起作用。此外，在EM结构中，可以访问Hsp70上的Bag-1（以及细菌交换因子GrpE）结合位点。这表明Hsp90和核苷酸交换因子可以协同作用，促进Hsp70上的核苷酸释放。这就解释了GrpE与细菌Hsp90和Hsp70协同工作以重新折叠变性蛋白质的能力(Genest等人，2011年)，并进一步表明我们的发现在基本水平上延伸到了Hsp70:Hsp90系统。
总之，这项工作说明了热休克蛋白70和热休克蛋白90是如何在细胞内作为蛋白质折叠的阴阳功能发挥作用的。虽然Hsp70的去折叠/失活和Hsp90的重折叠/再激活似乎存在浪费性的矛盾，但它们的结合可以是互补的。持续几轮Hsp70介导的去折叠/配体释放和Hsp90介导的重折叠/配子结合有助于GR对激素水平的变化做出快速而精细的反应，同时也能将apoGR维持在非聚集、高亲和力状态。此外，这为调控和协调信号与蛋白质稳态提供了机会。此外，这两种伴侣对耳蜗的依赖和大量翻译后修饰使微调达到了更高的水平。重复的去折叠和重折叠循环还有一个额外的好处，那就是允许伴侣通过防止非功能性错误折叠状态的积累，并利用重折叠性作为靶向受损蛋白质进行降解的指标，来确保功能蛋白质组。这些结果为为什么许多信号蛋白对Hsp70:Hsp90伴侣系统产生依赖性提供了除稳定性之外的明确益处和理由。
实验程序
蛋白质表达与纯化
人Hsp90α、Hsp70、HOP和p23以及酵母YDJ1在pET151细菌表达质粒中表达，带有可切割的6×His-tag，并按照前面所述进行纯化(Southworth和Agard，2011年). 人Bag-1在带有可切割6×His标签的pET28a载体中表达，并如上所述进行纯化。对于冷冻-EM，如前所述，从Sf9细胞中纯化Hsp70(Southworth和Agard，2011年). 对于GRLBD，LBD（F602S）（521–777）被克隆到具有N末端可切割6×His-MBP标记的pMAL-c2X衍生物和具有可切割6 x His标记的pACYCDuet衍生物中。简言之，GRLBD在16°C地塞米松存在下在BL21星（DE3）中表达，并在配体存在下通过Ni-亲和层析和离子交换纯化。然后通过过夜透析去除配体，并从尺寸排除色谱（SEC）中排除。通过大量透析进入无配体缓冲液完成纯化。请参见补充信息了解详细信息。
荧光偏振分析
在SpectraMax M5平板阅读器（分子器件）上测量荧光标记地塞米松（生命科技）的荧光偏振，其激发/发射波长为485/538 nm，温度控制设置为25°C，以及在30mM HEPES pH7.5、150mM KCl和2mM DTT中。请参见补充信息了解详细信息。
氢氘交换质谱法
采用全自动系统进行溶液相酰胺HDX(Goswami等人，2013年). 将GRLBD和Hsp70以1:1.2摩尔比与2µM Hsp40和5mM ATP/MgCl混合2在HDX前在室温下孵育1小时。对于HDX，用D将5µl 10µM GRLBD或复合物（GRLBD和Hsp70）稀释至25µl2含O的HDX缓冲液，在4°C下培养10s、30s、60s、900s或3600s。交换后，用0.1%（v/v）TFA在3 M尿素和50 mM TCEP中稀释至50µl，使蛋白质变性，并进行在线胃蛋白酶消化和电喷雾电离，直接耦合到高分辨率（60000 at M/z 400）Orbitrap质谱仪（LTQ Orbitrab XL with ETD，Thermo Fisher）。内部软件用于分析(Pascal等人，2012年). 对于回汇修正，估计平均回收率为70%。
聚集分析
使用Jobin Yvon FluoroMax-3荧光分光光度计监测聚集，并将温度控制夹套设置为25°C。将激发和发射波长设置为500 nm，狭缝宽度为1.4 nm，测量直角光散射。
Hsp90-Hsp70-GR装载综合体的组装
Hsp90、HOP、Hsp70、MBP-GRLBD和Hsp40在室温下与ATP孵育1小时。该复合物由SEC用Ettan LC（GE Healthcare）纯化。将级分在室温下用0.02%戊二醛交联20分钟，并用20mM Tris-HCl（pH 7.5）骤冷。用SDS-PAGE分析交联组分。含有全复合物的组分用于低温电子显微镜数据收集。请参见图S5了解详细信息。
