临床投资杂志。1999年9月1日；104(5): 567–576.
RGS4因压力过载导致死亡率增加和心肌肥厚减少
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杰森·罗杰斯
1医学部心血管研究中心2美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院细胞生物学和生理学系，邮编63110
Praveen Tamirisa公司
1医学部心血管研究中心2美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院细胞生物学和生理学系，邮编63110
阿提拉·科瓦茨
1医学部心血管研究中心2美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院细胞生物学和生理学系，邮编63110
卡拉·温海默
1医学部心血管研究中心2美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院细胞生物学和生理学系，邮编63110
迈克尔·考特瓦
1医学部心血管研究中心2美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院细胞生物学和生理学系，邮编63110
肯德尔·J·布鲁默
1医学部心血管研究中心2美国密苏里州圣路易斯市华盛顿大学医学院细胞生物学和生理学系63110
丹尼尔·凯利
1医学部心血管研究中心2美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院细胞生物学和生理学系，邮编63110
安东尼·穆斯林
1医学部心血管研究中心2美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院细胞生物学和生理学系，邮编63110
1医学部心血管研究中心2美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院细胞生物学和生理学系，邮编63110
通信地址：Anthony J.Muslin，心血管研究中心，美国密苏里州圣路易斯市欧几里德大道660号华盛顿大学医学院8086信箱，邮编：63110，电话：（314）747-3525；传真：（314）362-0186；电子邮件：ude.ltsuw.etagmi@nilsuma. 收到日期：1999年3月4日；1999年7月27日接受。
摘要
RGS家族成员是异源三聚体G蛋白的GTPase激活蛋白（GAP）。有证据表明RGS基因表达的改变可能与心肌肥厚和心力衰竭的发病机制有关。我们使用转基因小鼠模型研究了RGS4调节心脏生理的能力。出生后心室组织中RGS4的过度表达不会影响心脏形态或基础心脏功能，但会显著降低心脏适应横主动脉收缩（TAC）的能力。与野生型小鼠相比，转基因动物在压力超负荷下显著减轻心室肥厚，也没有表现出心脏“胎儿”基因程序的诱导。转基因小鼠的TAC在大多数动物中导致快速失代偿，其特征是左心室扩张，收缩功能降低，与非转基因同窝鼠相比，术后死亡率增加。这些结果表明RGS蛋白是信号通路的关键组成部分，参与急性心室压力超负荷的心脏反应和心脏肥厚程序。
介绍
出生后哺乳动物心肌细胞通过发生肥大反应对机械应激和生长因子作用作出反应(1). 这种反应的特点是细胞尺寸增加、蛋白质合成和收缩蛋白组织成肌节(2)并通过特定基因的诱导，包括心钠素（ANF）(三)，即早期原癌基因c-fos(4)和肌球蛋白轻链-2（MLC-2）(5). 心肌细胞肥大导致整个心脏生长，导致心室壁增厚，随之而来的是壁应力降低。人类心脏肥大的临床后果是非常重要的，包括严重心律失常、舒张功能障碍（可导致肺水肿和液体超载）以及充血性心力衰竭的发展(6,7). 心脏肥大并不总是与不良预后相关。例如，职业运动员心脏肥大的发展并不能预测不良结果，运动水平降低时心脏尺寸减小(8,9). 这一发现和其他研究结果促使研究人员假设肥大可能是对增加的环境压力的必要适应，肥大只有在其后期才变得不适应。
在培养的心肌细胞中，机械应激或苯肾上腺素等配体(10)，内皮素-1(11)和血管紧张素II(12)促进肥大反应。这3种激动剂通过异源三聚体G蛋白：内皮素-1发出信号(13)和血管紧张素II(14)与偶联到G的7个跨膜受体结合q个蛋白质，而苯肾上腺素与α结合1-与G偶联的肾上腺素能受体我和Gq个蛋白质(15). 先前的研究表明，机械应激可能导致心脏局部释放血管紧张素II或内皮素-1(16). 异源三聚体G蛋白由α、β和γ亚基组成，在非刺激细胞中形成复合物(17——19). 这些蛋白质被7-跨膜受体激活。在激动剂刺激下，α亚基上发生鸟嘌呤核苷酸交换，导致GTP与α亚基结合，导致βγ二聚体解离。相反，GTPase活性导致GTP与α亚单位分离，导致异源三聚体的重组。
最近在转基因小鼠模型系统中检测了G蛋白导致心肌肥厚和衰竭的能力(20——22). G的四倍过度表达αq心脏组织中ANF和β-肌球蛋白重链（β-MHC）基因的表达显著增加，导致心脏重量和心肌细胞大小增加(20). 此外，转基因小鼠的超声心动图显示Gαq过度表达，Starling关系改变，对多巴酚丁胺刺激的收缩反应减少。在更高的G水平αq一些动物出现过表达、双心室衰竭和死亡(20). 在另一项研究中，G的组成活性突变形式的瞬时表达αq出生后8至30周龄时，心脏组织发生肥大、扩张和死亡(21). 在第三项研究中，G抑制剂在心脏的特异性表达q个-介导的信号传导阻断压力超负荷诱导心肌肥厚(22).
激活的7-跨膜受体催化G的形成α-GTP复合物，反过来调节效应分子的活性。GTP水解的速率决定了7-跨膜受体生成信号的强度和持续时间。G公司α亚基具有微弱的内在GTP水解活性（kCAT公司=2-5–1)小G蛋白，如ras，水解GTP的速度比G慢得多α(23). GTPase激活蛋白（GAP）存在于细胞中，以促进小G蛋白的失活。例如，p120GAP将ras的固有GTPase活性提高了10万倍(23). 最近，异三聚体G蛋白的GAP被鉴定出来，并被命名为RGS蛋白（G蛋白信号调节蛋白）(24,25). RGS蛋白与GDP-AlF高亲和力结合4——G的配合物α模拟假定五价过渡状态的亚单位和RGS蛋白催化GTP水解至少比基本速率高50倍(27——29). RGS蛋白对GDP-AlF的高亲和力4——G的复数α与GTPγ-S结合形式相比，RGS蛋白通过稳定GTP和GDP结合形式之间的过渡状态发挥作用(23). 使用纯化蛋白进行的体外生化研究表明，RGS1、RGS4、RGS10和RGS16（RGS-r）对G的异源三聚体G蛋白的α亚基具有GAP活性我和Gq个，但不是G秒，个家庭(26——29).
我们之前已经证明RGS3和RGS4 mRNA在心脏中表达(30)和其他研究人员最近表明，包括RGS1、RGS5和RGS6在内的其他RGS家族成员在心室组织中表达(31). RGS家族成员在心脏组织中的表达模式在病理生理状态和心肌细胞分离时发生改变(30,31). 我们假设RGS基因表达的改变可能影响G蛋白介导的心脏信号转导。为了解决这种可能性，我们之前发现培养心肌细胞中RGS4的过度表达抑制了苯肾上腺素和内皮素诱导的心肌细胞肥大(32). 为了评估RGS4的过度表达是否能够抑制活体动物对生理刺激的心肌肥厚反应，我们建立了一个转基因小鼠模型系统。
方法
转基因小鼠代。
将带有3′-三重myc-1表位标签的大鼠RGS4 cDNA编码区亚克隆到包含α-肌球蛋白重链（α-MHC）启动子和SV-40多聚腺苷化位点的载体（克隆26；美国俄亥俄州辛辛那提大学Jeffrey Robbins的礼物）中(33). 如前所述，在阿拉巴马大学伯明翰分校（美国阿拉巴马州伯明翰）国家儿童健康与人类发展研究所转基因小鼠发育设施，将线性化DNA注射到1细胞C57BL/6×SJL胚胎的原核中(34). 通过PCR分析子代以检测转基因整合。获得了两个创始人，斑点杂交分析证实，5个转基因拷贝被并入1个品系（5x-RGS4-myc），而8个转基因拷贝并入第二品系（8x-RGS4-myc）。
所有涉及使用小鼠的研究都严格按照华盛顿大学动物研究委员会批准的方案进行。
蛋白质分析。
如前所述，心室组织细胞溶质提取物用于通过免疫印迹分析RGS4-myc蛋白水平(30). 采用小鼠单克隆抗–myc-1表位（美国马萨诸塞州剑桥市癌基因研究产品公司）、仓鼠单克隆抗RGS4和兔多克隆抗–14-3-3β（美国加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司）抗体。使用辣根过氧化物酶结合的山羊抗鼠、山羊抗仓鼠或山羊抗兔多克隆抗体（ICN Pharmaceuticals Inc.，Costa Mesa，California，USA）。使用增强化学发光（ECL）系统（美国新泽西州皮斯卡塔韦Amersham Pharmacia Biotech）观察色带。使用NIH Image软件对免疫印迹进行的密度分析显示，5x-RGS-myc小鼠含有4-5倍的多余RGS4蛋白，8x-RGS4-myc小鼠含有2-3倍的多余的RGS4蛋白质。
丝裂原活化蛋白激酶活性测定。
如前所述进行心内注射苯肾上腺素(22). 90秒后，迅速分离心室组织并在液氮中快速冷冻(30). 用SDS-PAGE分离心室组织的细胞溶胶提取物，并将蛋白质电泳转移到硝化纤维过滤器。过滤器在含有1%吐温-20（TBS/T）和30%牛血清白蛋白的Tris-buffered生理盐水中封闭。过滤器用1:1000稀释的抗活性ERK-1有丝分裂原活化蛋白（MAP）激酶鼠单克隆抗体（美国威斯康星州麦迪逊市Promega Corp.）清洗并孵育。过滤器在TBS/T中广泛清洗，然后与辣根过氧化物酶结合的抗小鼠二级抗体（Amersham Pharmacia Biotech）孵育。使用ECL系统（Amersham Pharmacia Biotech）观察色带，并如上所述通过密度测定法进行分析。
横行主动脉缩窄。
主动脉横缩术（TAC）主要如前所述进行(35——37). 简言之，用木聚嗪（16 mg/kg）和氯胺酮（80 mg/kg）的混合物麻醉12周龄小鼠。打开胸部，通过肋间肌进行钝性解剖，确定胸主动脉。将7-0丝线缝合在横主动脉周围，并绑在26号钝针上（“紧密”TAC）(37)或25号钝针（“松动”TAC），随后将其取出。胸口用一条purse-string缝合线缝合。手术结束时，切口分两层闭合，缝合方式中断。将小鼠放在加热垫上，直到对刺激产生反应。外科医生对小鼠的转基因状态一无所知。假手术动物接受了相同的手术程序，只是没有放置主动脉收缩。7天后，处死幸存动物，解剖心脏并称重。
心导管插入术。
TAC后7天，用木聚嗪（16 mg/kg）和氯胺酮（80 mg/kg）的混合物麻醉小鼠。通过识别并插管右侧颈动脉，将1.4F Millar导管插入主动脉缩窄近端的升主动脉，并固定导管，进行闭胸心导管术；然后记录血液动力学测量结果。
超声心动图。
如前所述，使用配备15-MHz（15L8）换能器的Acuson Sequoia 256超声心动图系统（Acuson Corp.，Mountain View，California，USA）对麻醉小鼠进行经胸超声心动图检查（每克体重腹腔注射0.01 mL 2.5%阿维汀）(38,39). 病前小鼠昏昏欲睡，不需要阿维汀镇静剂。
多巴酚丁胺刺激和反应评估。
如前所述进行经胸超声心动图和血流动力学测量(40).
北方印迹法。
通过硫氰酸胍和苯酚法（RNA-STAT60；Tel-Test Inc.，美国德克萨斯州Friendswood）从冷冻小鼠心室组织中分离出总RNA。RNA（15μg）通过1%甲醛-淀粉凝胶电泳分离，转移并交联到尼龙膜上。ANF、GAPDH和中链酰基辅酶A脱氢酶（MCAD）探针用[α-32P] dCTP使用随机六聚体和DNA聚合酶I的Klenow片段（Amersham Pharmacia Biotech）。如前所述，对印迹进行预杂交、杂交和洗涤(30). 使用Bio-Rad GS-525分子成像仪系统和分子分析2.1.2软件（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Read Laboratories Inc.）查看和分析色带。
心室组织的组织学分析。
TAC后7天，处死野生型和5x-RGS4-myc小鼠，获取心室组织。心室组织固定在4%多聚甲醛磷酸盐缓冲盐水中，嵌入石蜡中，并使用切片机切片。组织切片用Masson三色染色。
细胞凋亡检测。
使用FragEl试剂盒（美国马萨诸塞州剑桥市癌基因研究产品公司）通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）检测原位评估细胞凋亡。
统计分析。
所有数据均以平均值±SEM报告。统计分析由双尾学生的t吨检验，χ2分析和方差分析（如适用）。采用方差分析和Fisher事后比较进行多组比较。A类P（P）值小于0.05被认为具有统计学意义。
结果
RGS4-myc转基因小鼠的产生。
我们之前已经证明RGS3和RGS4基因在心脏中表达(30). 我们最近证实，RGS4的过度表达可以抑制培养心肌细胞中苯肾上腺素和内皮素-1的作用，但不能抑制碱性成纤维细胞生长因子的作用(32). 为了确定RGS4是否可以在动物模型系统中抑制心肌肥厚，我们用含有α-MHC启动子的转基因小鼠构建了一个转基因小鼠，该启动子先前已被证明可以引导适度胚胎和增加出生后心室基因转录(33). α-MHC启动子与大鼠RGS4的编码区相连，该编码区含有3′-三重-myc-1表位标签（RGS4-myc）。获得两个创始小鼠，并用于生成独立的系。在1个品系中，整合了5份转基因（5x-RGS4-myc），在第二个品系，整合了8份转基因（8x-RGS4-myc）。
使用抗RGS4单克隆抗体和抗myc-1表位单克隆抗体对小鼠RGS4-myc融合蛋白的表达进行了分析（数据未显示），结果表明，从5x-RGS4-mcy小鼠分离的心室组织含有4到5倍的过量RGS4蛋白，尽管拷贝数较高，8x-RGS4-myc小鼠只含有2到3倍多余的RGS4蛋白。在5x-RGS4-myc小鼠、8x-RGS4-myc转基因小鼠及其非转基因同窝小鼠中，控制蛋白14-3-3β的水平是相同的（图). 在没有实验干预的情况下，所有5x-RGS4-myc和8x-RGS4-myc杂合转基因小鼠在出生时看起来基本正常，并存活了至少6个月。5x-RGS4-myc小鼠和非转基因同窝小鼠的基线超声心动图参数相同（表). 8x-RGS4-myc小鼠的左心室收缩功能、心室大小和壁厚也正常。5x-RGS4-myc和8x-RGS4-myc小鼠的心脏基本正常。对5x-RGS4-myc和8x-RGS4-myc小鼠心室组织的组织学分析显示，与非转基因同窝鼠相比，心肌细胞外观正常（数据未显示）。
RGS4-myc心肌组织的特征。与非转基因同窝小鼠（NTG）相比，5x-RGS4-myc（5x）和8x-RGS4-myc（8x）小鼠的心室RGS4蛋白水平增加。5x-RGS4-myc小鼠表达4-5倍的多余蛋白质，而8x-RGS4-myc小鼠仅表达2-3倍的多余蛋白。使用仓鼠单克隆抗RGS4抗体和兔多克隆抗14-3-3β抗体（以确认相同的负载量）。每组有6颗心脏也获得了类似的结果。
RGS4-myc小鼠对紧密TAC的反应。
接下来，我们研究了小鼠通过使用紧密TAC对激发性刺激产生心肌肥大反应的能力。在这个过程中，手术结扎会造成横主动脉60-70%的狭窄(35——37). 在非转基因同窝动物中，TAC是可以耐受的，近80%的动物存活了至少一周（图). 1周后，大多数小鼠出现明显的心脏肥大，超声心动图研究很容易检测到。
紧密TAC后RGS4-myc转基因小鼠的存活率降低。8x-RGS4-myc小鼠、5x-RGS4-myc小鼠，5x-RGS-myc小鼠的非转基因同窝鼠（NTG同窝鼠）和非转基因同源小鼠（NTG C57BL×SJL TAC）经严密TAC后的存活率。
相反，5x-RGS4-myc转基因小鼠不能耐受紧密TAC，大多数在手术后数小时至2天内死亡（图). 紧密TAC后1至2天内，对病前5x-RGS4-myc动物的超声心动图显示心室扩张、室壁变薄、心功能降低，LV质量无明显增加（表和图).
M型超声心动图分析5x-RGS4-myc转基因小鼠的心脏功能。一只5x-RGS4-myc小鼠和一只非转基因同胞（NTG）在基线时的典型经胸M型超声心动图描记。TAC图像显示为非转基因（紧密TAC后1周）和5x-RGS4-myc（病前，TAC后一天）小鼠。
χ2分析表明，与非转基因同窝小鼠（78%）相比，5x-RGS4-myc转基因小鼠（11%）在紧密TAC后7天的存活率下降具有统计学意义(P（P）=0.0001）或非转基因同类C57BL×SJL动物（63%）(P（P）=0.0001）。为了排除5x-RGS4-myc转基因小鼠对麻醉或开胸手术唯一敏感的可能性，进行了与TAC程序相同的假手术，但主动脉经解剖鉴定后未结扎。所有6只假手术的5x-RGS4-myc小鼠耐受了该过程，存活了7天以上。
在8x-RGS4-myc小鼠上进行紧密TAC，并且它们也不耐受TAC。所有8x-RGS4-myc小鼠（14:14）在严密TAC后3天内死亡（图)以及对病前小鼠进行的超声心动图检查显示，这些结果与紧致TAC后在病前5x-RGS4-myc小鼠中发现的结果相同。
RGS4-myc小鼠对松散TAC的反应。
考虑到紧贴TAC后5x-RGS4-myc和8x-RGS4-myc小鼠的高死亡率，为了提高术后生存率，我们采用了一种改良的TAC程序，在横主动脉上放置一条限制性较低的带，导致大约40-50%的狭窄。在5x-RGS4-myc小鼠和非转基因小鼠上进行这种修饰形式的TAC（松散TAC）或假手术。所有小鼠大约12周大，与体重相匹配（表). 术后1周对所有存活的小鼠进行心导管插入术，以证实TAC松动导致生理学意义上的狭窄。插管显示，非转基因动物假手术后平均升主动脉收缩压（SBP）为131±6mmHg，TAC松动后7天为195±19mmHg。在5x-RGS4-myc动物中，假手术组的收缩压为127±7 mmHg，松动TAC 7天后为176±5 mmHg（表). 如果在错误操作的动物中升主动脉收缩压不大于平均升主动脉收缩压力至少2个标准差，则在松动TAC后将小鼠排除在分析之外。
松散TAC后7天，非转基因小鼠存活率为75%，5x-RGS4-myc小鼠存活率提高了33%，而紧密TAC后存活率为11%。与非转基因小鼠相比，5x-RGS4-myc转基因小鼠松动TAC后7天的存活率下降，经χ检验具有统计学意义2分析(P（P）=0.0001）（图).
松动TAC后RGS4-myc转基因小鼠的存活率降低。5x-RGS4-myc小鼠（5x-RGS6-myc TAC）和非转基因同源C57BL×SJL小鼠（C57BLxSJL TAC）在松散TAC后的存活率，以及5x-RGS4-myc小鼠（5x-RGS4-mcy假手术）在假手术后的存活速率。
松动TAC后7天对5x-RGS4-myc存活者的超声心动图评估显示，他们表现出保留的左室功能，但与非转基因存活者相比，左室肥厚明显减少。具体而言，在松动TAC后1周，非转基因小鼠和5x-RGS4-myc小鼠的缩短分数和左室舒张末期和收缩末期尺寸没有统计学差异（表). 然而，与非转基因小鼠相比，5x-RGS4-myc动物的左室肥厚指数（如舒张末期后壁和室间隔厚度、相对壁厚和M型衍生左室重量）显著降低（表). 用重量法测定左心室质量/体重比（LVMI）。假手术非转基因小鼠的LVMI为3.06±0.10 mg/g(n个=5）和非转基因带状小鼠在TAC松动7天后4.24±0.33 mg/g(n个= 4;P（P）= 0.0002). 在松散TAC组中，非转基因动物的LVMI与假手术小鼠相比增加了39%（表和图). 相反，与假手术5x-RGS4-myc小鼠相比，松散TAC后5x-RGS6-myc动物的LVMI仅增加18%。假手术5x-RGS4-myc小鼠的LVMI为3.00±0.08 mg/g(n个=8），在5x-RGS4-myc小鼠中为3.53±0.27 mg/g(n个=4）TAC松动后7天(P（P）=0.04）（表和图). 在5x-RGS4-myc小鼠中观察到的LVMI增加（18%）明显小于未转基因小鼠（39%）(P（P）=0.02），尽管平均升主动脉SPB相似。
5x-RGS4-myc小鼠对TAC的肥厚反应降低。在非转基因同源C57BL×SJL小鼠（NTG）或5x-RGS4-myc小鼠中，在松动TAC后7天或假手术后测定LV重量/体重比（LVW/BW），这是LV质量的一个指标。如果升主动脉收缩压比假手术动物获得的平均升主动脉收缩压力大2个标准差，则在TAC后将小鼠排除在LVW/BW分析之外。误差条代表SEM。
在TAC后7天，对幸存者的5x-RGS4-myc和非转基因同窝配偶的LV组织进行组织学分析。非转基因动物在TAC后表现出典型的肌原纤维紊乱和纤维化，而转基因动物很少或没有纤维化，肌原纤维结构相对保留（图).
TAC后心脏形态学的组织学分析。在松弛TAC（原始放大倍数×200）后1周，用Masson三色染色对5x-RGS4-myc（RGS4-myc）和5x-RGS4-myc小鼠的非转基因同窝小鼠（NTG）的心室组织切片进行染色。注意非转基因心脏组织中细胞外基质含量增加（蓝色）、心肌细胞增大和紊乱。
松散TAC后RGS4-myc小鼠心肌肥大基因调控程序的检测。
在野生型小鼠中，先前的工作已经证实，TAC的刺激刺激可诱导“胚胎”基因的表达，如ANF和MLC-2(35)减少线粒体脂肪酸氧化途径相关基因的表达，如MCAD(41). 对5x-RGS4-myc小鼠和非转基因C57BL/6×SJL小鼠进行宽松TAC，术后7天收集心室组织。从心室组织获得的RNA的Northern blot分析显示，松散TAC诱导非转基因动物ANF表达显著增加，但5x-RGS4-myc动物ANF的表达没有显著增加（图a） ●●●●。与TAC后的非转基因动物相比，5x-RGS4-myc小鼠的正常ANF水平显著降低（图b）(P（P）= 0.03). 松散TAC导致非转基因小鼠MCAD表达显著下降，但5x-RGS4-myc小鼠没有。松散TAC不影响5x-RGS4-myc动物中RGS4-mmy mRNA的水平（图a） ●●●●。
TAC后心脏基因表达的Northern blot分析。(一)松散TAC后ANF、MCAD、RGS4和GAPDH基因表达的Northern blot分析。在5x-RGS4-myc或非转基因（NTG）同源C57BL×SJL小鼠上进行松动TAC（+）或假手术（-）。(b条)松动TAC后7天心脏ANF基因表达的定量分析。通过自动二维计算机密度测定法，在线性范围内量化所得谱带的相对强度。该图描述了从5x-RGS4-myc或非转基因同源C57BL×SJL小鼠（NTG）获得的心室组织中归一化ANF mRNA水平。RGS4 mRNA水平由GAPDH mRNA标准化。数据以任意单位表示，误差条反映了4次测定的SE。
RGS4-myc小鼠对α肾上腺素能和β肾上腺素能刺激的反应。
确定RGS4 myc心室组织是否对激活G我或Gq个蛋白质受损，心脏注入α-肾上腺素配体苯肾上腺素，并评估细胞内MAP激酶的激活。先前的研究表明，脑室内注射苯肾上腺素会导致心脏MAP激酶活性快速（90秒）增加(22). 通过抗活性MAP激酶（ERK-1）免疫印迹测定，非转基因同窝小鼠（而非5x-RGS4-myc转基因小鼠）在心内注射苯肾上腺素后MAP激酶活性增加（图).
降低RGS4-myc对G的心脏反应我/G公司q个-偶合配体苯肾上腺素。心内注射苯肾上腺素（或对照缓冲液）90秒后，在RGS4-myc小鼠或其非转基因同窝小鼠的心室组织中评估p44-MAP激酶活性。使用抗活性ERK-1 MAP激酶单克隆抗体分析细胞溶质提取物的免疫印迹。每条车道上装载了等量的总蛋白质。使用NIH Image软件对3个单独的实验进行了密度分析，数据表示为平均信号强度±SEM。
为了确定5x-RGS4-myc转基因小鼠是否能对激活G秒与激活G我和Gq个蛋白质，我们在分级输注β-肾上腺素能激动剂多巴酚丁胺后进行了体内超声心动图和血液动力学评估(40,42). 通过5x-RGS4-myc小鼠的LV+dP/dt峰值和心率来评估LV收缩力的增强，与非转基因小鼠相当，并且在任何剂量的多巴酚丁胺输注下，LV+dP/dt峰值或心率都没有统计学上的显著差异（图). 这与RGS4不能灭活G一致秒蛋白质。
保存5x-RGS4-myc小鼠对多巴酚丁胺的变力和变时反应。峰值LV+dP/dt(一)和心率(b条)在5x-RGS4-myc小鼠的基线和逐步输注多巴酚丁胺后显示（平方；n个=3）或非转基因C57BL×SJL小鼠（钻石；n个= 3). 峰值+dP/dt，左心室压力的最大一阶导数。P（P）=5x-RGS4-myc小鼠和任何剂量多巴酚丁胺输注的非转基因小鼠之间的NS。
TAC后5x-RGS4-myc非幸存者和幸存者的细胞凋亡检测。
为了研究凋亡机制在TAC后急性致死性或肥厚表型降低中是否起作用，从TAC后2天内死亡或TAC后7天存活的5x-RGS4-myc小鼠分离心室组织。还从TAC后存活7天的非转基因小鼠收集心室组织。用TdT分析对细胞核进行染色显示，凋亡细胞核较少，与TAC后1周的非转基因存活小鼠相比，在TAC后2天内死亡或存活至1周的5x-RGS4-myc小鼠的凋亡指数没有统计学上的显著差异。具体来说，凋亡指标如下：未转基因小鼠在TAC松动后1周，凋亡率为0.87±0.43%；5x-RGS4-myc小鼠松动TAC后1周，1.1±0.59%；TAC后24小时内死亡的5x-RGS4-myc小鼠为1.43±0.87%（图).
TAC后5x-RGS4-myc小鼠的凋亡指数没有增加。所有数字均为左心室心肌（原始放大倍数×400），代表了所进行的TdT分析。(一)阳性对照：在DNA酶中孵育的组织通过TdT标记分析显示核酸DNA的泛染色。(b条)松动TAC后1周，5x-RGS4-myc。注意箭头所示的凋亡细胞核较少。(c（c）)5x-RGS4-myc，TAC后24小时内死亡。注意没有凋亡细胞核。非凋亡细胞核用甲基绿复染。
讨论
在人类患者中，心脏肥大是由于后负荷增加、心内血容量增加、心肌细胞蛋白遗传异常或先天性代谢错误引起的(43). 人类后负荷增加的常见原因包括高血压和主动脉狭窄，这些情况通常与心肌肥厚有关。在本研究中，我们将TAC作为一种实验方法用于小鼠，以急剧增加后负荷，从而引发心肌肥厚(35——37). 主动脉收缩触发快速代偿反应，导致几分钟内心脏收缩力增加，以维持心输出量。如果动物不能对这种增加的后负荷立即作出反应，就会导致心脏扩张和运动减退，经常导致死亡。目前还没有明确确定哪种配体（如果有的话）介导对增加心脏后负荷的快速反应。先前的研究表明，内皮素-1或血管紧张素II的局部心内释放可能参与了这一过程，导致Gq个-蛋白质活化(16). G公司q个反过来，活化可以导致磷脂酶C的活化，从而产生三磷酸肌醇和释放细胞质钙(44,45). 此外，TAC后心输出量的立即下降预计会导致儿茶酚胺的释放，从而刺激心内α-肾上腺素能和β-肾上腺素能受体，刺激G我蛋白质和G秒蛋白质。除了快速的肌力反应外，心肌细胞的大小也会延迟增加，导致心肌肥大，这种肥大会持续几天到几周。目前尚不清楚有助于收缩力快速增加的刺激是否也参与促进心肌细胞延迟生长。
本报告中描述的结果表明，RGS4在小鼠心室组织中的过度表达抑制了心脏对TAC诱导的急性后负荷增加的补偿能力。事实上，5x-RGS4-myc和8x-RGS4-myc小鼠在紧密和松散TAC后的术后死亡率均显著增加。转基因小鼠在死亡前接受了超声心动图检查，结果显示左室扩张伴整体运动减退。对这些结果的一种解释是，转基因动物缺乏对增加的后负荷产生肌力反应的能力。然而，在5x-RGS4-myc小鼠中，对β-激动剂多巴酚丁胺的变力和变时反应被保留。β-肾上腺素能反应受损似乎与TAC后的急性死亡率无关。与我们的结果相反，当Akhter等人以Gαq与非转基因动物相比，TAC术后死亡率没有增加，但TAC诱导的心肌肥大被抑制(22). 对这些差异的一个可能解释是RGS4具有抑制G我和Gq个，但Gαq抑制肽仅抑制Gq个-介导信号传导。
我们研究了心肌细胞凋亡是否与TAC后的急性死亡率有关，但发现5x-RGS4-myc动物TAC后凋亡指数没有增加。这与最近的一项研究形成对比，该研究提供了证据，证明压力过大心脏的早期死亡可能是通过gp130依赖性心肌细胞生存途径的丧失而发生的，从而导致心肌细胞凋亡(46). 另一个对比是脑室特异性gp130敲除小鼠（gp130 CKO）在TAC后对胚胎基因程序的诱导正常，而5x-RGS4-myc小鼠对ANF的诱导明显减弱。5x-RGS4-myc和gp130 CKO小鼠似乎代表了心脏生物力学应力途径的不同遗传修饰物。
在TAC存活下来的5x-RGS4-myc转基因动物中，我们观察到，尽管近端主动脉压力增加，但通过心脏重量或ANF诱导测量，7天后心脏肥大减弱。存活7天的动物保留了左心室功能，我们不知道它们是否会活得更长。相比之下，TAC存活的对照动物在7天后发生了严重的心肌肥大。一个有趣的问题是，在TAC中存活下来的转基因动物是否最终会比对照带状动物表现更好。换句话说，肥大对术后即刻TAC反应的动物有益吗？我们的实验结果表明，对后负荷增加有一种双相反应：一种以收缩力增加和肥大反应延迟为特征的初始反应。抑制最初的反应会产生灾难性的后果，可能导致死亡，但抑制延迟的反应可能并不不利。目前正在进行实验，以更详细地解决这些可能性。
在这项工作中，我们使用了一种转基因方法，导致RGS蛋白在心脏中过度表达。这种过度表达策略与心脏对增加后负荷的反应有关，我们之前的研究证明非转基因小鼠肺动脉结扎导致右心室组织中RGS4表达增加(30). 此外，最近的研究表明，RGS16（RGS-r）在从完整心室组织分离后不久在心肌细胞中高度诱导(31). 综上所述，这些发现表明心脏可能通过调节RGS蛋白水平来调节肥厚反应的程度。RGS4是G的真正差距我和Gq个蛋白质，因此RGS4-myc小鼠的一个可能缺陷是G我或Gq个传递对增加后负荷的急性和慢性反应所需的信号。
致谢
我们感谢Ken Chien（美国加州大学圣地亚哥分校）和Jeffrey Robbins（美国俄亥俄州辛辛那提市辛辛那蒂大学）提供的试剂。我们感谢M.Hafeez Qureshi提供的技术援助。我们感谢Mike Parmacek和Howard Rockman提供的技术建议。A.J.Muslin得到了巴恩斯犹太医院基金会、美国心脏协会和国家卫生研究院的资助。K.J.Blumer和D.P.Kelly是美国心脏协会的资深研究员。这项工作是在美国心脏协会Heartland Affiliate Inc.的博士后研究员任期内完成的。
工具书类
1Sadoshima J，Izumo S.心肌细胞对机械应激的细胞和分子反应。《生理学年鉴》。1997;59:551–571.[公共医学][谷歌学者] 2Thorburn J，Frost JA，Thorburn.A.有丝分裂原活化蛋白激酶介导基因表达的变化，但不介导与心肌细胞肥大相关的细胞骨架组织。细胞生物学杂志。1994;126:1565–1572. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。Knowlton KU等。α肾上腺素能刺激新生大鼠心室细胞期间心钠素和心肌肌球蛋白轻链-2基因的共同调节。生物化学杂志。1991;266:7759–7768.[公共医学][谷歌学者] 4Izumo S、Nadal-Ginard B、Mahdavi V。压力过载产生的心脏基因表达的原癌基因诱导和重编程。美国国家科学院程序。1988;85:339–343. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Lee H等。α1-肾上腺素能刺激新生大鼠心肌细胞心脏基因转录：对肌球蛋白轻链-2基因表达的影响。生物化学杂志。1988;263:7352–7358.[公共医学][谷歌学者] 6Levy D、Garrison RJ、Savage DD、Kannel WB、Castelli WP。Framingham心脏研究中超声心动图测定的左心室重量对预后的影响。英国医学杂志。1990;322:1561–1566.[公共医学][谷歌学者] 7Messerli FH、Soria F.高血压、左心室肥大、心室异位和猝死。美国医学杂志。1992;93：21S–26S。[公共医学][谷歌学者] 8Longhurst JC，Stebbins CL。力量运动员。心脏病学临床。1997;15:413–429.[公共医学][谷歌学者] 10Simpson P，McGrath A，Savion S.新生大鼠培养物中的肌细胞肥大及其受血清和儿茶酚胺的调节。圆形Res。1982年；51:787–801.[公共医学][谷歌学者] 11Shubeita HE等。内皮素诱导心室肌细胞中肌醇磷脂水解、肌节组装和心脏基因表达。生物化学杂志。1990;265:20555–20562.[公共医学][谷歌学者] 12Sadoshima J，Izumo S.血管紧张素II诱导心肌细胞肥大和心肌成纤维细胞增生的分子特征。圆形Res。1993;73:413–423.[公共医学][谷歌学者] 13Sokolovsky M.大鼠心肌细胞中内皮素受体和多个G蛋白之间的功能耦合。受体通道。1993;1:295–304.[公共医学][谷歌学者] 14Wang C、Jayadev S、Escobedo JA。使用受体嵌合体鉴定血管紧张素II 1型受体中决定Gq偶联的结构域。生物化学杂志。1995;270:16677–16682.[公共医学][谷歌学者] 15Steinberg SF、Drugge ED、Bilezekian JP、Robinson RB。由神经支配的心肌细胞获得与α1受体相关的百日咳毒素特异性调节蛋白。科学。1985;230:186–188.[公共医学][谷歌学者] 16Komuro I等。心肌细胞中机械应激激活的蛋白激酶级联反应：血管紧张素II的可能参与。欧洲心脏杂志。1995;16（补遗C）:8–11.[公共医学][谷歌学者] 17Gilman AG.G蛋白：受体生成信号的传感器。生物化学年度收益。1987;56:615–649.[公共医学][谷歌学者] 18Hamm HE，Gilchrist A.异三聚体G蛋白。当前操作细胞生物学。1996;8:189–196.[公共医学][谷歌学者] 19Neer EJ公司。异三聚体G蛋白：跨膜信号的组织者。单元格。1995;80:249–257.[公共医学][谷歌学者] 20D'Angelo DD等。转基因Gαq过度表达诱导小鼠心脏收缩衰竭。美国国家科学院程序。1997;94:8121–8126. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Mende U等。组成性活性Gαq的瞬时心脏表达通过钙调神经磷酸酶依赖和独立的途径导致肥大和扩张型心肌病。美国国家科学院程序。1998;95:13893–13898. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Akhter SA等。靶向受体-Gq界面以抑制体内压力过载肥大。科学。1998;280：574–577。[公共医学][谷歌学者] 23Tesmer JJG、Berman DM、Gilman AG、Sprang SR.与AlF结合的RGS4结构4——-激活的Giα1：稳定GTP水解的过渡状态。单元格。1997;89:251–261.[公共医学][谷歌学者] 24Druey KM、Blumer KJ、Kang VH、Kehrl JH。一个新的哺乳动物基因家族抑制G蛋白介导的MAP激酶激活。自然。1996;379:742–746.[公共医学][谷歌学者] 25Koelle MR，Horvitz HR。EGL-10调节秀丽线虫神经系统与许多哺乳动物蛋白质共享一个保守的结构域。单元格。1996;84:115–125.[公共医学][谷歌学者] 26Berman DM、Wilkie TM、Gilman AG。GAIP和RGS4是G蛋白α亚基Gi亚家族的GTPase激活蛋白。单元格。1996;86:445–452.[公共医学][谷歌学者] 27Watson N、Linder ME、Druey KM、Kehrl JH、Blumer KJ。RGS家族成员：异源三聚体G蛋白α亚基的GTP酶激活蛋白。自然。1996;382:172–175.[公共医学][谷歌学者] 28Huang C，Hepler JR，Gilman AG，Mumby SM。通过RGS4或GAIP在哺乳动物细胞中的表达减弱Gi-和Gq介导的信号。美国国家科学院程序。1997;94:6159–6163. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Natochin M，Lipkin VM，Artemyev NO。人类视网膜RGS与G蛋白α亚单位的相互作用。FEBS通讯。1997;411:179–182.[公共医学][谷歌学者] 30Zhang S等。RGS3和RGS4是心脏中的G蛋白抑制剂。分子细胞心血管杂志。1998;30:269–276.[公共医学][谷歌学者] 31Kardestuncer T、Wu H、Lim AL、Neer EJ。心肌细胞表达10种RGS蛋白的mRNA：心室肌细胞和培养心房中RGS mRNA表达的变化。FEBS通讯。1998;43:285–288.[公共医学][谷歌学者] 32Tamirisa P、Blumer KJ、Muslin AJ。RGS4抑制心肌细胞中的G蛋白信号传导。循环。1999;99:441–447.[公共医学][谷歌学者] 33Subramaniam A等。转基因小鼠α-肌球蛋白重链基因启动子的组织特异性调节。生物化学杂志。1991;1266:24613–24620.[公共医学][谷歌学者] 34Disch DL等。转基因小鼠中编码线粒体脂肪酸氧化酶的核基因的转录控制：核受体在心脏和棕色脂肪表达中的作用。分子细胞生物学。1996;16:4043–4051. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Rockman HA等。在小鼠体内心肌肥大模型中心房特异性和诱导性心钠素转基因表达的分离。美国国家科学院程序。1991;88:8277–8281. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 36Dorn GW，II，Robbins J，Ball N，Walsh RA。主动脉支小鼠左心室肥厚后肌球蛋白重链调节和心肌细胞收缩抑制。美国生理学杂志。1994;267：H400–H405。[公共医学][谷歌学者] 37Sakata Y，Hoit BD，Liggett SB，Walsh RA，Dorn GW，II，Robbins J，Ball N。Gαq过表达小鼠压力超负荷肥大的代偿。循环。1998;97:1488–1495.[公共医学][谷歌学者] 38Tanaka N等人。小鼠心脏病模型的经胸超声心动图。循环。1996;94:1109–1117.[公共医学][谷歌学者] 39Rockman HA等。β-肾上腺素能受体激酶1抑制剂的表达可防止基因靶向小鼠发生心肌衰竭。美国国家科学院程序。1998;95:7000–7005. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 40Arber S等。MLP缺陷小鼠表现出细胞结构组织破坏、扩张型心肌病和心力衰竭。单元格。1997;88:393–403.[公共医学][谷歌学者] 41Sack MN等。脂肪酸氧化酶基因在衰竭心脏中表达下调。循环。1996;94:2837–2842.[公共医学][谷歌学者] 42Nabauer M等。非衰竭和终末期衰竭人类心脏分离心室心肌的正性肌力效应。欧洲临床投资杂志。1988;18:600–606.[公共医学][谷歌学者] 43Jacob R、Brandle M、Dierberger B、Rupp H。心脏肥大和扩张的功能后果。基础研究心脏病学。1991;86（补充1）:113–130.[公共医学][谷歌学者] 44Smrcka AV，Hepler JR，Brown KO，Sternweis PC。纯化Gq对多磷酸肌醇特异性磷脂酶C活性的调节。科学。1991;251:804–807.[公共医学][谷歌学者] 45Taylor SJ、Chae HZ、Rhee SG、Exton JH。Gq类G蛋白的α亚单位激活磷脂酶C的β1同工酶。自然。1991;350:516–518.[公共医学][谷歌学者] 46Hirota H等。gp130心肌细胞生存途径的缺失是生物力学应激期间心力衰竭发病的关键事件。单元格。1999;97:189–198.[公共医学][谷歌学者] 
