血管内皮生长因子退出后对已建立的人类肿瘤中未成熟血管的选择性消融

摘要

介绍

通过抑制肿瘤新生血管的能力来治疗肿瘤的概念是基于肿瘤是血管生成依赖性的前提(1)如果新生血管被阻止，它将保持休眠状态(2). 抗血管生成性肿瘤治疗的可行性已被许多动物研究所证实，这些动物研究使用的任何一种药物都可以对抗血管生成的正调节因子，主要是血管内皮生长因子（VEGF）(三–7)或给予血管生成的负调控因子，例如血管抑素和内皮抑素(8–10). 重要的是，实验性癌症的抗血管生成治疗不会诱导获得性耐药性(11). 非肿瘤内皮细胞的一般静止(12)与肿瘤中正在进行的血管生成和血管重塑的状态相反，这表明抗血管生成治疗可能不会损害非肿瘤血管系统。

然而，理想情况下，治疗已确立的人类肿瘤可能不仅需要抑制进一步的血管生成，还需要失去现有的肿瘤血管以减少现有的肿瘤重量。为了实现这一点，需要寻找将预先形成的肿瘤血管与宿主血管区分开来的特征，其中一个特征可能是血管成熟状态。我们最近发现，在发育过程中，未成熟血管与成熟血管在依赖VEGF生存方面有所不同。因此，虽然血管内皮生长因子需要维持新生血管，但这种存活因子对于成熟的血管网是不可或缺的(13). 在发育过程中，无周细胞内皮丛的短暂存在允许氧调节修剪（由VEGF介导），作为根据周围组织的需要确定最终血管密度的机制。重要的是，周细胞涂层的获得标志着这种可塑性窗口的结束，并稳定了脉管系统(14).

先前的胚胎发生研究强调了内皮周细胞在维持血管完整性方面的重要作用，包括破坏编码内皮细胞特异性受体Tie-1和Tie-2的基因(15–17)，Tie-2配体血管生成素-1（Ang1）(18)组织因子（TF）系统(19)血小板衍生生长因子（PDGFB）/PDGF-β受体系统(20–22).

我们推断，由于肿瘤血管的持续血管生成和重塑，有一部分肿瘤血管尚未招募内皮周细胞。事实上，我们发现，成熟的人类肿瘤中有相当一部分血管缺乏内皮周细胞。然后，我们研究了这篇论文，因为这些血管依赖血管内皮生长因子等血管生存因子，所以这些血管可能会被迫退化。在异种移植性胶质瘤中，通过设计有条件表达VEGF的基因系统，首次证明了强迫未成熟血管选择性回归的可行性。为了检验这种方法在一个成熟的、生长缓慢的人类肿瘤中的可行性，我们分析了前列腺癌标本。

啮齿动物前列腺的生长似乎受到血管内皮细胞的调节，血管内皮细胞本身对睾酮刺激下前列腺上皮分泌的血管生成/营养因子作出反应(23). 尤其是VEGF是由正常前列腺、增生前列腺和肿瘤前列腺的分泌上皮产生的(24,25). 雄激素停药后，雄激素依赖细胞系中VEGF的表达下调，在由这些细胞组成的肿瘤中，去势会导致血管退化，从而导致肿瘤细胞死亡(26). 在前列腺癌患者中，全雄激素清除治疗是一种常见的治疗方法，旨在减少肿瘤体积和减少可手术肿瘤。未经治疗和去除雄激素的前列腺组织的临床材料的可用性为我们提供了一个独特的机会来研究VEGF在一个自然的、成熟的人类肿瘤中丢失的后果。我们在此表明，雄激素消融选择性地消除了未成熟血管，从而为这种治疗模式提供了一种新的机制。

方法

结果

VEGF缺失导致异种移植性胶质瘤中未成熟血管选择性闭塞。

为了能够控制肿瘤细胞分泌的VEGF的水平，我们创建了一个条件VEGF表达系统，在该系统中，当将四环素添加到荷瘤裸鼠的饮用水中时，C6胶质瘤的VEGF-表达受到抑制。在这个系统的帮助下，我们之前已经表明，VEGF的过度表达导致血管过度化，内源性基因提供的VEGF不足以维持在VEGF过度表达条件下生成的所有血管。后者的明显发现是，阻断VEGF从转基因中的产生，导致部分内皮细胞从一些预制血管壁上脱落，并随后因凋亡而死亡。血管塌陷反过来导致大量出血和广泛的肿瘤坏死(27). 该系统用于确定VEGF缺失的脆弱性是否与血管成熟状态相关。

肿瘤首先在VEGF最大表达的条件下生长数周。切除术后，我们测定了血管成熟指数，定义为与α-SMA阳性内皮周细胞相关的血管部分。这一测量是通过对大于毛细血管的血管进行评分来确定的(即，含有足以容纳数个红细胞的管腔的血管），因为毛细血管被周细胞稀疏地覆盖，因此，在薄片中可能会错误地显示为未覆盖。α-SMA阳性的内皮周细胞在大多数血管中未被检测到，表明大部分肿瘤血管尚不成熟（图。​（图11一). 在其余的荷瘤动物中，转基因产生的VEGF被关闭。我们之前已经证明，该方案几乎完全废除转基因表达(27). 血管退化的中间阶段可以在关闭VEGF生成72小时后检测到，内皮细胞衬里的连续性丧失和红细胞逃逸是明显的。引人注目的是，血管损伤的证据仅在没有内皮周细胞涂层的血管中检测到，包括α-SMA阴性血管和α-SMA阳性血管占据相同肿瘤小生境的情况（图。​（图1，1,b条和c（c）). 这种不同易损性的结果是，在VEGF退出五天后，发现大多数存活的血管获得了平滑肌细胞/周细胞涂层（图。​（图11d；另请参阅e（电子）用于量化血管成熟指数的增加）。这一结果表明，只有未成熟的肿瘤血管依赖可溶性VEGF生存。

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图1

异种移植性胶质瘤中未成熟血管的退化。(一)在构成性高VEGF表达条件下生长的肿瘤，显示α-SMA阳性和α-SMA阴性血管的混合物。α-SMA阴性血管(箭头)插图中以更高的放大倍数显示（用H&E复染），以突出其内皮的完整性。(b条和c（c）)VEGF退出72小时后出现肿瘤。两者均涵盖(右箭头)和未覆盖(左箭头)仍能观察到血管。然而，未覆盖的容器显示出明显的崩解迹象（最好在c（c）在用H&E复染的序列部分中描绘了相同的容器）。(d日)VEGF退出5天后出现肿瘤。请注意，大多数存活血管为α-SMA阳性。(e（电子）)按照方法中的描述，在VEGF退出前或退出后5天获得的切片的高倍视野中测定VMI（分别为270或87条血管评分）。计算的VMI分别为0.30（SEM=0.04）和0.94（SEM=0.05）。小时&E类苏木精和曙红；座椅模块组件平滑肌肌动蛋白；血管内皮生长因子血管内皮生长因子；VMI公司、血管成熟指数。

已证实的人类肿瘤中有相当一部分血管缺乏内皮周细胞。

在考虑以未成熟肿瘤血管为靶点之前，必须表明，与异种移植的胶质瘤模型一样，天然人类肿瘤中包含大量未成熟血管。为了确定一个成熟的胶质母细胞瘤中存在的未成熟血管的比例，对多形性胶质母细胞癌的病理标本进行了α-SMA阳性血管比例分析。图中显示了一个具有代表性的字段。​图2，2图中显示了高密度的肾小球样血管（多形性胶质母细胞瘤的标志）和附近较小的血管。大多数血管缺乏α-SMA阳性的内皮周细胞。在所检查的胶质母细胞瘤标本中，平均不到四分之一大于毛细血管的肿瘤血管与α-SMA阳性细胞相关。多形性胶质母细胞瘤中存在大量未成熟血管，与正常大脑形成鲜明对比，正常大脑中大多数血管被α-SMA阳性细胞覆盖（图。​（图22c（c）). 多形性胶质母细胞瘤是一种生长速度快、血管生成性强的肿瘤。因此，可以认为，该肿瘤中未成熟血管的比例很高，这反映了肿瘤生长和新生血管的速度非常高，而生长缓慢的肿瘤可能只包含很少一部分未成熟血管。

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图2

多形性胶质母细胞瘤的大多数血管是未成熟的。(一和b条)抗vWF染色的多形性胶质母细胞瘤连续切片(一)和抗α-SMA(b条)仅显示少量α-SMA阳性血管(箭头). (c（c）)对4例胶质母细胞瘤标本进行α-vWF和α-SMA连续染色。对大于毛细血管的血管进行评分（每个样本在58到212之间），并显示α-SMA阳性血管的百分比（平均19%；SEM=8.3%）。为了进行比较，还评估了正常成人大脑（大鼠）的血管α-SMA阳性血管的百分比（六个高倍视野的平均值为95%；SEM=3%）。vWF（vWF），von Willebrand因子。

为了代表生长缓慢的肿瘤，我们分析了前列腺癌根治术标本。血管计数选择的区域集中在显示明确癌症证据的区域（如专业病理学家所示），还包括正常腺体和增生腺体。平均而言，只有约40%的大于毛细血管的血管含有α-SMA阳性细胞。因此，即使在含有大量正常组织的区域，几乎一半的血管都是未成熟的。有趣的是，健康的前列腺也含有大量未成熟血管（见图。​图44e（电子）).

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图4

前列腺癌的雄激素清除治疗导致选择性闭塞未成熟血管。对手术切除前列腺组织的邻近切片进行vWF免疫染色(一和c（c）)或对于α-SMA(b条和d日)以检查单个血管是否被内皮周细胞覆盖。未经治疗的肿瘤就是一个例子(一和b条) (黑色箭头指向未覆盖的容器和蓝色箭头指向覆盖的血管）和接受雄激素清除治疗的肿瘤(c（c）和d日) (黑色箭头指向有盖的容器）。柱状图中显示了10名不同患者的数据(e（电子）)：5例来自未经治疗的对照肿瘤(阴影条)五个来自治疗过的肿瘤(实心钢筋). 为了随机化处理和免疫组织化学检测过程中的实验可变性，将一对肿瘤（每个肿瘤包含一个对照肿瘤和一个相同Gleason分级的雄激素清除肿瘤，患者年龄匹配）嵌入一个单独的块中，并在同一张幻灯片上进行共同分析。管腔化血管的总数取决于切片中肿瘤的数量，如下所示：肿瘤1（140）、2（63）、3（25）、4（19）、5（98）、6（122）、7（158）、8（143）、9（170）、10（397）。小鼠前列腺被用作正常前列腺血管成熟的对照。平均而言，未经治疗的肿瘤含有38%的α-SMA阳性血管（SEM=3.5%）；雄激素清除肿瘤有79%的α-SMA阳性血管（SEM=3.3%）。

前列腺癌的雄激素清除治疗导致VEGF丢失和选择性闭塞未成熟血管。

最近在动物模型中的研究表明，雄激素缺乏可能导致血管退行性变，再加上VEGF受雄激素调节的发现，促使我们研究人类前列腺癌中的雄激素清除治疗是否可能导致依赖VEGF生存的未成熟血管选择性闭塞。

为了证明人类前列腺中的VEGF确实被雄激素清除疗法下调，就地用VEGF特异性探针进行杂交分析。在未经处理的标本中，发现VEGF在正常、增生和癌变腺体的分泌上皮中大量表达。示例如图所示。​图3三a；它描述了正常腺体和前列腺上皮内瘤变（PIN）分泌上皮中VEGF的表达。通过比较未经治疗患者和术前数周接受雄激素清除治疗患者的根治性前列腺切除标本，证实雄激素对VEGF的调节作用。在同一张幻灯片上共混合的8对等级和年龄匹配的配对中，有8对在雄激素去除标本中观察到VEGF表达显著降低（对于一个典型的例子，对比图。​图3，三,c（c）和e（电子）具有b条和d日). 将相邻片段与另一已知在雄激素衍生后前列腺中下调的基因中性内肽酶24.11杂交(29)显示这两个基因在同一细胞中共存，并且在没有雄激素的情况下协调下调（数据未显示）。虽然对手术切除的人类肿瘤的回顾性分析缺乏证据证明雄激素消融和VEGF下调之间的因果关系，与动物模型中的情况相似(26)与这个命题一致。

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图3

雄激素清除治疗降低前列腺VEGF mRNA表达。(一)现场高倍镜下显示肿瘤前列腺标本与VEGF特异性探针的杂交。注意VEGF在异常的腺上皮中大量表达。(b条–e（电子）)低倍放大显示VEGF表达的整体变化就地未经处理的等级匹配样本的杂交(b条，亮场；d日（暗场）或前列腺切除术前接受雄激素清除治疗(c（c），亮场；e（电子），暗场）。在同一张幻灯片上对各部分进行了合并。注意雄激素清除治疗导致VEGF表达显著降低。

为了确定VEGF的丢失是否导致了不成熟前列腺血管的选择性清除，在未经治疗的肿瘤和接受雄激素清除治疗数周的肿瘤中，测定了α-SMA阳性细胞覆盖的血管比例。如图所示。​图44以下是两种类型血管评分的示例：vWF-阳性/α-SMA-阴性血管（图中用黑色箭头突出显示）。​图4，4,一和b条)vWF-阳性/α-SMA阳性（图中用黑色箭头突出显示）的类似大小的血管。​图4，4,c（c）和d日). 对每个肿瘤标本的几个高功率场中的每种类型的血管进行量化，可以为每个肿瘤指定血管成熟指数。据预计，未成熟血管的优先脆弱性，以及由此产生的选择性闭塞，将导致血管成熟指数增加。事实上，未经治疗的肿瘤仅包含38%的包膜血管，而雄激素清除治疗开始后8-12周切除的肿瘤包含79%的包衣血管，这表明成熟血管对这种治疗更难治疗（图。​（图44e（电子）).

与就地细胞凋亡（TUNEL）分析，这些病理标本为观察血管退行性变的中间阶段提供了机会。在未经治疗的肿瘤中，TUNEL阳性的内皮细胞很少被检测到，凋亡细胞更常在腺上皮中检测到（推测反映了这些细胞的正常周转）（图。​（图55一). 相反，雄激素消融后经常检测到内皮细胞凋亡（图。​（图55b条). 信息最丰富的是α-SMA阳性血管与α-SMA阴性血管并存的切片。引人注目的是，在这些情况下，发生凋亡的内皮细胞主要存在于α-SMA阴性血管中（图。​（图55c（c）). 这些结果提供了确凿的证据，证明雄激素缺乏引发的VEGF损失的后果是选择性闭塞未成熟前列腺血管。

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图5

雄激素消融后内皮细胞凋亡。TUNEL分析用于检测未治疗前列腺和激素消融4周后的凋亡细胞。(一)未经治疗的前列腺显示凋亡细胞核(红色)在腺体中，但不在血管中(箭头). (b条)雄激素去除标本，突出显示两条血管和几个TUNEL阳性内皮细胞。注意TUNEL-positive的存在(黑色箭头)和TUNEL阴性(红箭)在同一条血管中。一和b条在同一显微镜载玻片上一起处理，以控制组织化学变化。(c（c）)隧道(绿色荧光)和α-SMA染色(红色荧光)显示出一条裸露的血管(箭头)含有许多凋亡的内皮细胞，而邻近的血管被覆盖(箭头)没有。红细胞的红色自体荧光有助于识别这些血管的管腔。在检测到一个或多个TUNEL阳性内皮细胞的血管中，85%为α-SMA阴性。雄激素清除肿瘤中，每条血管中TUNEL阳性内皮细胞的平均数量是其3.1倍。隧道，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记。

讨论

已经证实，阻断血管生成可以防止动物肿瘤生长。此外，抗血管生成药物血管抑制素和内皮抑制素已被证明不仅可以阻止肿瘤生长，而且可以通过未知的机制导致异种移植癌模型中的肿瘤退化(11). 我们在这里表明，未成熟血管对VEGF的依赖性可以被用来减少现有的肿瘤血管系统，从而减少依赖性组织质量。利用内皮周细胞的募集作为血管成熟的标志，我们在这项研究中表明，成熟的人类肿瘤含有相当大比例的未成熟血管。在有条件表达VEGF的胶质瘤模型中，我们发现虽然只有一小部分血管对VEGF提取敏感，但会导致大量出血和坏死(27). 事实上，这些血管是一个封闭的功能网络的一部分，这可能是出血和肿瘤细胞死亡的主要原因。

在初始神经丛形成后的一段时间内保持血管修剪的选择，通常起到调节血管密度以匹配氧气供应的生理作用。因此，高氧是发育性血管退化的生理触发因素，当其导致VEGF的下调超过维持未成熟血管所需的水平时，这些血管就会退化。这种调节的一个重要因素是周细胞的获得稳定了血管系统，防止了由于组织氧的短暂波动而导致的有害血管退化。这项研究表明，通过高氧以外的手段，即激素剥夺来抑制VEGF的产生，也会导致未成熟血管的退化。

VEGF在人类前列腺的分泌上皮中大量表达，其产生需要雄激素的持续刺激。VEGF在前列腺中的生理作用尚不清楚，靶细胞也可能包括内皮细胞以外的细胞。然而，就血管系统而言，很明显，VEGF是维持前列腺血管稳态所必需的，前列腺本质上具有相对较高的内皮细胞周转率（1%-2%）(30)并维持了高比例的未成熟血管（图。​（图44e（电子）). 后一项发现可能是前列腺血管系统非常容易受到雄激素消融治疗的原因，并可以部分解释动物去势后前列腺肿瘤和正常腺体数量减少的原因(23). 抗VEGF抗体已被证明可以阻止前列腺异种移植物的肿瘤生长(7)利诺米可通过同时去势和下调VEGF来增强抗血管生成治疗(31). 考虑到内皮细胞和肿瘤细胞间多种生长和存活因子介导的旁分泌效应，肿瘤血管系统的完整性受损会对肿瘤细胞的生存能力产生强烈影响，这并不奇怪(32).

这些结果还表明，特定肿瘤的血管成熟指数可能预测抗VEGF治疗在减轻肿瘤质量方面的效率。另一方面，血管直径似乎与VEGF提取的易损性/难治性无关，因为C6胶质瘤系统中VEGF阻断后存活的血管与VEGF停用前存在的血管在大小上没有显著差异。事实上，正常脑血管和胶质母细胞瘤血管的成熟指数有很大差异（图。​（图22c（c）)提示这种人类肿瘤可能对抗VEGF作用有良好的反应。

我们之前已经证明VEGF依赖性肿瘤血管的退化是通过内皮细胞分离发生的(27). 似乎在内皮周细胞促进更持久的粘附模式之前，VEGF可能是维持细胞与临时细胞外基质粘附的积极方式。因此，VEGF的丢失也可能影响调节内皮细胞与临时基质粘附的分子的表达或活性。αV/β3和αV/(33,34).

致谢

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