NB001和加巴喷丁对肠易激综合征引起的行为焦虑和自发性疼痛的影响

酵母多糖诱导的内脏疼痛行为

Fos免疫组织化学染色显示，在酵母多糖诱导的结肠炎中，与疼痛和情绪处理相关的大脑区域被激活。接下来，我们测量了行为反应，以证实内脏疼痛是由成年小鼠结肠内注射酵母多糖引起的[41，47，48]. 如前所述，被定义为内脏疼痛相关行为的小鼠姿势包括在没有其他梳理行为的情况下舔腹部、全身伸展、腹部紧贴地面或收缩腹壁，使其呈弓形姿势1-2秒（腹部收缩）[49]. 为了评估酵母多糖诱导内脏疼痛的时间进程，12只小鼠被分为酵母多糖和盐处理组（每组6只小鼠）。连续三天结肠内注射酵母多糖或生理盐水后（图2A） ，然后在第1、7、14和28天测试小鼠的内脏疼痛行为（图2B） ●●●●。我们发现，与盐处理的小鼠相比，酵母聚糖处理的小鼠在第一天表现出明显的内脏疼痛相关行为（酵母聚糖：27.7±1.6；与。生理盐水：3.2±1.1；P（P） < 0.001; 重复测量方差分析事后（post-hoc）与LSD试验的比较；图2C） ●●●●。腹部、内脏疼痛相关行为持续很长时间（酵母多糖：第7天：25.3±2.1；第14天：26.8±2.1；第28天：26.0±2.2；与。生理盐水：第7天：3.5±0.9；第14天：3.7±0.9；第28天：3.3±0.7；P（P） < 0.001; 重复测量方差分析，然后是事后（post-hoc）与LSD试验的比较；图2B-C）。在酵母聚糖处理的小鼠中，时间点内与疼痛相关的行为数量没有差异(F类_{(3, 20)} = 0.25,P（P） = 0.86; 单向方差分析；图2C） 提示结肠内注射酵母多糖可引起稳定的慢性内脏疼痛。因此，我们的数据表明，结肠内注射酵母多糖可以诱导小鼠明显且持续的内脏疼痛行为。

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图2

酵母聚糖处理小鼠的行为试验。（A）将0.1 ml酵母聚糖（30 mg/ml）或生理盐水通过与PE管相连的针头经肛门注入小鼠结肠。（B）在连续三天注射后，在第1、7、14和28天对酵母多糖和盐处理的小鼠进行行为测试（每组6只小鼠）。（C）与生理盐水处理的小鼠（每组n=6只小鼠）相比，酵母多糖处理的小鼠在第1、7、14和28天观察到的疼痛行为数量显著增加。*表示酵母多糖和盐处理小鼠之间的显著差异。“Before”指定小鼠在生理盐水或酵母多糖结肠内治疗之前。

酵母聚糖治疗小鼠的自发性疼痛增加

为了进一步探讨酵母多糖治疗小鼠的自发性疼痛，我们采用野外试验进行了实验。为了避免习惯化效应，每个测试日都使用独立组。因此，每只老鼠只在野外测试一次。在野外试验中，自发活动和行进距离都是自动测量的。自发活动包括垂直（仰卧）、走动（水平活动）、刻板（无运动，但存在重复、不变的行为，如梳妆和摇头）和跳跃（逃避潜伏期）行为。有趣的是，与盐处理组相比，酵母聚糖处理的小鼠在第1天的所有四种行为的计数都显著降低。这些减少在第7天、第14天和第28天保持不变（n=6只小鼠/组，每个测试日，双向方差分析，然后是事后（post-hoc）与LSD试验的比较；表1，图三A） ●●●●。第1天、第7天、第14天和第28天组之间没有显著差异（垂直：F类_{(3, 40)} = 2.57,P（P） = 0.07; 非卧床：F类_{(3, 40)} = 2.41,P（P） = 0.08; 刻板印象：F类_{(3, 40)} = 2.21,P（P） = 0.10; 跳转：F类_{(3, 40)} = 0.14,P（P） = 0.94; 双向方差分析，后跟事后（post-hoc）与LSD测试的比较；表1，图三A） ●●●●。作为比较，盐处理小鼠（每个时间点6只）和幼稚小鼠（6只）之间没有显著差异。我们对5分钟的行为数据进行的分析表明，与盐处理小鼠相比，酵母多糖处理小鼠在30分钟测试时间内的计数持续下降（图三B） ●●●●。

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图3

酵母多糖处理小鼠在开阔地中的行为评估。（A）在第1天、第7天、第14天和第28天，与注射盐的小鼠相比，酵母多糖处理的小鼠的垂直、移动、定型和跳跃行为计数减少（每组6只小鼠，每个测试日）。*表示酵母多糖和盐处理小鼠之间的显著差异。（B）在第1天、第7天、第14天和第28天，酵母多糖处理小鼠（每个测试日6只）和盐处理小鼠（24只）的垂直、动态、定型和跳跃计数超过30分钟。（C）典型的痕迹显示，酵母多糖和盐处理过的小鼠在旷野试验中运动了30分钟。（D）在第1天、第7天、第14天和第28天，Zymosan处理的小鼠比生理盐水处理的小鼠行进的距离明显更短（每组n=6只小鼠，每个测试日）。*表示酵母多糖和盐处理小鼠之间的显著差异。（E）与盐处理小鼠（n=24只）相比，酵母聚糖处理小鼠在旷野试验30分钟的第一个5分钟内，在第1、7、14和28天（每个试验日6只小鼠）在中心区的行走距离显著缩短。*表示与经盐处理的小鼠存在显著差异。

除四种主要行为计数外，酵母多糖处理小鼠在野外的总旅行距离也显著缩短了1天(F类_{(1, 40)} = 4.83,P（P） < 0.05), 7 (F类_{(1, 40)} = 10.56,P（P） < 0.01), 14 (F类_{(1, 40)} = 15.75,P（P） < 0.001）和28(F类_{(1, 40)} = 17.97,P（P） < 0.001）（n=6只小鼠/组，每个测试日，双向方差分析，然后事后（post-hoc）与LSD试验的比较；图三D） ●●●●。第1天、第7天、第14天和第28天组的减少幅度相似(F类_{(3, 40)} = 0.83,P（P）=================================================================================================================0.49; 双向方差分析；图三D） ●●●●。这些结果一致表明，野外测试中的行为变化可以用来预测自发性疼痛的程度。

酵母糖诱导的焦虑样行为

在旷野测试开始的最初几分钟内，通常通过测量中心场地的探索行为来评估旷野中的焦虑行为[37，50]. 因此，我们分析了酵母聚糖处理组在不同时间点中心区域内的旅行距离，使用了5分钟的历元。我们发现，与生理盐水处理的小鼠相比，酵母多糖处理的小鼠在试验开始的前5分钟内在中心区域内行进的距离更小（酵母多糖：第1天：3.0±0.9米，P（P） < 0.05; 第7天：2.5±0.9 m，P（P） < 0.05; 第14天：3.2±0.8 m，P（P） < 0.05; 第28天：3.1±0.8 m，P（P） < 0.05;与。生理盐水：6.9±1.1米；n=6只小鼠/组，在每个测试日，进行双向方差分析，然后进行事后（post-hoc）与Dunnett试验的比较；图三E） ●●●●。第1天、第7天、第14天和第28天组的减少幅度相似(F类_{(3, 20)} = 0.06,P（P） = 0.98; 双向方差分析；图三E） ●●●●。我们还发现，与盐处理的小鼠相比，酵母聚糖处理的小鼠在开始试验的前5分钟内在中心区域停留的时间更少（酵母聚糖：第1天：3.2±0.6s，P（P） < 0.001; 第7天：2.7±0.5秒，P（P） < 0.001; 第14天：3.5±0.5秒，P（P） < 0.001; 第28天：3.1±0.6秒，P（P） < 0.001;与。生理盐水：8.9±0.9s；n=6只小鼠/组，在每个测试日，进行双向方差分析，然后进行事后（post-hoc）与Dunnett的测试进行比较）。这些发现表明，酵母聚糖处理的小鼠可能比盐处理的小鼠经历更多的焦虑。

为了进一步评估焦虑相关行为的变化，我们使用了高架加号迷宫和明暗盒测试。高架加号迷宫是基于一种焦虑因子，例如一个无保护的高架区域，焦虑水平由进入厌恶区域的次数和在厌恶区域花费的时间长度表示[51]. 亮/暗盒是基于啮齿动物天生对明亮区域的厌恶，以及啮齿动物对压力或焦虑的自发探索行为[52]. 首先，我们发现与盐处理小鼠相比，第1天组小鼠在高架正迷宫的开放臂中花费的时间显著减少(F类_（1，40） = 22.63,P（P） < 0.001; n=6只小鼠/组，在每个测试日，进行双向方差分析，然后进行事后（post-hoc）与LSD试验的比较；图4A） 这表明酵母多糖治疗可以引起小鼠焦虑。为了确定焦虑是否持久，我们测量了其他时间点的反应。我们发现，酵母聚糖处理的小鼠在第7天在高架加号迷宫的开放臂中花费的时间更少(F类_{(1, 40)} = 47.09,P（P） < 0.001），14(F类_{(1, 40)} = 35.12,P（P） < 0.001）和28(F类_{(1, 40)} = 35.12,P（P） < 0.001）（n=6只小鼠/组，每个测试日，双向方差分析，然后事后（post-hoc）与LSD试验的比较；图4A） ●●●●。第1天、第7天、第14天和第28天组之间没有差异(F类_{(3, 40)} = 0.74,P（P） = 0.53; 双向方差分析；图4A） ●●●●。数据表明，酵母聚糖处理的小鼠表现出持续至少4周的长期焦虑。相比之下，酵母聚糖处理的小鼠和盐处理的小鼠之间的总交叉次数没有差异(F类_(1,40) = 1.36,P（P） = 0.25; 双向方差分析；图4B） 表明酵母聚糖处理的小鼠在开放臂中的活性降低不是由于活性低下。

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图4

酵母聚糖处理小鼠焦虑的行为评估。（A）在第1天、第7天、第14天和第28天，与经盐处理的小鼠相比，经酵母多糖处理的小鼠在高架正迷宫中表现出明显的焦虑样行为增加（n=6只小鼠/组，每个测试日）。*表示酵母多糖和盐处理小鼠之间的显著差异。（B）在试验日，酵母多糖和盐处理的小鼠之间的高架正迷宫总交叉次数（开放+闭合）无统计学差异(P（P） = 0.25）。（C）在第1天、第7天、第14天和第28天，与经盐处理的小鼠相比，经酵母多糖处理的小鼠在明/暗箱中表现出焦虑样行为的显著增加（n=6只小鼠/组，每个测试日）。*表示酵母多糖和盐处理小鼠之间的显著差异。（D）在光/暗盒测试中，在小鼠第一次离开暗盒之前，酵母多糖处理的小鼠和盐水处理的小鼠之间没有观察到统计上的显著差异(P（P） = 0.89）。

最后，我们在明暗盒测试中检查了行为反应。我们发现，与经盐处理的小鼠相比，第1天组小鼠在灯箱中的时间明显减少(F类_{(1, 40)} = 6.03,P（P） < 0.05; n=6只小鼠/组，在每个测试日，进行双向方差分析，然后进行事后（post-hoc）与LSD试验的比较；图4C） ●●●●。我们还使用明暗盒对不同时间点的小鼠进行了检查，以评估酵母多糖诱导的焦虑样行为的时间进程。酵母多糖处理的小鼠在第7天在灯箱中的时间更少(F类_{(1, 40)} = 15.83,P（P） < 0.001), 14 (F类_{(1, 40)} = 12.44,P（P） < 0.01）和28(F类_{(1, 40)} = 9.81,P（P） < 0.01）（n=6只小鼠/组，每个测试日，双向方差分析，然后事后（post-hoc）与LSD试验的比较；图4C） ●●●●。第1天、第7天、第14天和第28天组之间没有显著差异(F类_{(3, 40)} = 0.42，P（P） = 0.74; 双向方差分析；图4C） ●●●●。与高架正迷宫一样，酵母聚糖处理的小鼠在明暗箱中也表现出焦虑样行为，这些行为持续了至少4周。在这些组中，动物离开黑盒子的时间没有显著差异(F类_{(1, 40)}==============================================================================0.02,P（P） = 0.89; 双向方差分析；图4D） ，表明在结肠内注射酵母多糖不会影响啮齿动物的探索倾向和对环境的厌恶特性之间的冲突。

NB001和加巴喷丁减轻酵母多糖引起的内脏疼痛

我们以前的研究表明，AC1有助于大脑和脊髓中与慢性疼痛相关的神经元可塑性[18，19，33，34，53，54]. NB001对AC1的药理抑制在神经病理性疼痛和炎性疼痛动物模型中具有镇痛作用[37]. 然而，尚未研究NB001对IBS的影响。加巴喷丁是一种常用的抗惊厥药，对内脏痛觉过敏也有镇痛作用[42-44，55，56]. 因此，我们决定研究NB001和加巴喷丁对酵母多糖治疗小鼠内脏疼痛的影响。为了避免药物的持续作用和相互作用，在所有测试日均使用独立组。行为测试前45分钟，将NB001（3 mg/kg）或加巴喷丁（30 mg/kg）腹腔注射到酵母聚糖处理的小鼠体内。

我们发现，在酵母多糖治疗后1天，NB001降低了动物的内脏疼痛行为（NB001:21.0±1.8，生理盐水：27.0±2.0，P（P） < 0.05; n=6只小鼠/组，在每个测试日，进行双向方差分析，然后进行事后（post-hoc）与Dunnett试验的比较；图5). 在其他时间点也观察到NB001的抑制作用（第7天，NB001：19.7±2.4，生理盐水：26.7±1.8，P（P） < 0.01; 第14天，NB001：18.0±1.6，生理盐水：26.5±1.4，P（P） < 0.01; 第28天，NB001：19.0±1.8，生理盐水：28.2±1.8，P（P） < 0.001; n=6只小鼠/组，在每个测试日，进行双向方差分析，然后进行事后（post-hoc）与Dunnett试验的比较；图5). 各试验日内，NB001对酵母菌素诱发内脏疼痛的影响无显著差异(F类_{(3, 20)} = 0.43,P（P） = 0.73; 单因素方差分析；图5). 我们还估计了NB001的最大可能抑制（MPI）（见方法）。NB001对内脏疼痛行为的平均MPI约为30.5%。

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图5

NB001和加巴喷丁对酵母多糖治疗和幼稚小鼠内脏疼痛行为的影响。直方图显示，注射NB001（3 mg/kg，n=6只小鼠）或加巴喷丁（30 mg/kg，n=6只鼠）后，与注射盐水的小鼠（n=6两只小鼠）相比，酵母聚糖处理的小鼠在第1、7、14和28天观察到的内脏疼痛行为数显著减少。*表示与生理盐水相比存在显著差异-注射小鼠。在服用NB001、加巴喷丁或生理盐水的幼稚小鼠中，内脏疼痛行为的数量没有观察到显著差异（每组n=6只小鼠；P（P） = 0.87). 注射IP后45分钟测量内脏疼痛。

接下来，我们研究了加巴喷丁对酵母多糖治疗小鼠内脏疼痛的影响。我们发现加巴喷丁注射液也能减少内脏疼痛行为（第1天：19.8±1.7，P（P） < 0.01; 第7天：20.3±1.4，P（P） < 0.05; 第14天：19.2±1.7，P（P） < 0.01; 第28天：20.0±1.4，P（P） < 0.01; 与盐水注射组相比，n=6只小鼠/组/试验日，双向方差分析事后（post-hoc）与Dunnett试验的比较；图5). 加巴喷丁在每个测试日内对酵母多糖诱导的内脏疼痛的影响没有显著差异(F类_{(3, 20)} = 0.09,P（P） = 0.96; 单因素方差分析；图5). 加巴喷丁对内脏疼痛行为的平均MPI为28.6%。

NB001和加巴喷丁减轻酵母多糖诱导的自发性疼痛

为了进一步评估NB001和加巴喷丁的疗效，采用旷场试验测量自发性疼痛。在野外试验前45分钟，将NB001注射到酵母聚糖处理的小鼠体内，在第1天、第7天、第14天和第28天增加了自发活动（n=6只小鼠/组，每个试验日，双向方差分析，然后是事后（post-hoc）与Dunnett试验的比较；表2，图6A） ●●●●。有趣的是，NB001对动物的动态计数产生了超过50%的MPI，尤其是在第1天和第14天（第1天：103.7%；第7天：81.6%；第14天：94.7%；第28天：79.9%）。相比之下，NB001对其他自发活动计数的平均MPI小于40%（垂直：30.3%；定型：39.2%；跳跃：34.5%）。因此，动态计数可能是预测药物对自发性内脏疼痛的镇痛效果的最敏感参数。

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图6

NB001和加巴喷丁对旷野自发性疼痛和焦虑样行为的影响。（A）与盐水注射相比，注射NB001或加巴喷丁后第1天、第7天、第14天和第28天酵母多糖处理小鼠的垂直、移动、定型和跳跃行为计数增加（每组6只小鼠，每个测试日）。*表示与生理盐水相比存在显著差异-注射小鼠。（B）与盐水注射相比，注射NB001或加巴喷丁后第1天、第7天、第14天和第28天酵母多糖处理小鼠的行走距离增加（n=6只小鼠/组，每个测试日）。*表示与生理盐水相比存在显著差异-注射小鼠。（C）与盐水注射相比，加巴喷丁注射显著增加了酵母多糖处理小鼠在第1天、第7天、第14天和第28天30分钟试验期的前5分钟内在中心区的移动距离（每组6只小鼠，每个试验日）。*表示与生理盐水相比存在显著差异-注射小鼠。在试验日注射NB001或生理盐水的酵母聚糖处理小鼠之间未观察到显著差异(P（P） = 0.63).（D）有代表性的痕迹显示，在第28天的30分钟测试期内，在野外注射NB001、加巴喷丁或生理盐水的酵母聚糖处理小鼠的运动。在每个实验中，IP注射后45分钟开始进行行为测试。

与生理盐水注射组相比，在酵母多糖处理的小鼠中注射加巴喷丁后第1、7、14和28天的自发活动也增加（n=6只/组，每个测试日，双向方差分析，然后是事后（post-hoc）与Dunnett试验的比较；表2，图6A） ●●●●。与NB001类似，加巴喷丁对动物的动态计数产生超过50%的MPI，尤其是在第1天和第14天（第1天：93.5%；第7天：69.3%；第14天：90.4%；第28天：86.4%）。加巴喷丁对其他自发活动计数的平均MPI小于40%（垂直：31.3%；定型：36.9%；跳跃：36.8%）。NB001和加巴喷丁在测试剂量下产生的抑制作用相似（垂直：P（P） = 0.80；非卧床：P（P） = 0.79; 刻板印象：P（P） = 0.99; 跳跃：P（P） = 0.75; 双向方差分析，后跟事后（post-hoc）与LSD试验的比较；表2，图6A） ●●●●。

与生理盐水组相比，NB001（第1天，P（P） < 0.05; 第7天，P（P） < 0.05; 第14天，P（P） < 0.01; 第28天，P（P） < 0.01; n=6只小鼠/组，在每个测试日，进行双向方差分析，然后进行事后（post-hoc）与Dunnett试验的比较；图6B） 或加巴喷丁（第1天，P（P） < 0.05; 第7天，P（P） < 0.05; 第14天，P（P） < 0.01; 第28天，P（P） < 0.05; n=6只小鼠/组，在每个测试日，进行双向方差分析，然后进行事后（post-hoc）与Dunnett试验的比较；图6B） ●●●●。这两种药物对酵母多糖治疗小鼠的总行程产生超过50%的MPI，尤其是在第1天（第1天，NB001：78.8%，加巴喷丁：83.5%；第7天，NB001:60.4%，加巴佩丁：51.6%；第14天，NB000:59.5%，加巴彭丁：56.3%；第28天，NB002:59.2%，加巴彭：61.7%）。

酵母多糖诱导结肠炎后，Fos蛋白在大脑中高水平表达

连续冠状切片分析显示，酵母多糖处理小鼠的PFC、ACC、岛叶皮层、杏仁核、PAG、PBN和孤束核中Fos蛋白水平升高。在这些大脑区域中，PFC、ACC、岛叶皮层、杏仁核和PAG参与疼痛信息和情绪反应的处理[18]，PBN的外侧区参与一般内脏输入的处理[57]孤束核的内侧部和连合部是迷走神经传入纤维的主要靶点[58]. 我们的观察结果表明，酵母多糖诱导的结肠炎在小鼠中引起明显的伤害性反应。一些与情绪处理相关的脑区Fos蛋白水平升高表明，在酵母多糖诱导结肠炎后，小鼠可能会出现情绪障碍。

结肠内注射酵母多糖致慢性内脏疼痛

先前的研究表明，用酵母多糖进行结肠内治疗可以产生一种慢性结肠超敏反应模型，该模型涉及短暂的低水平炎症[40，41，47]. 因此，酵母多糖能够在啮齿类动物中产生内脏超敏反应。酵母菌多糖诱导的内脏疼痛是研究内脏超敏反应（包括人类IBS）潜在机制的合适模型，因为它缺乏相关的结肠病理学。在本研究中，酵母聚糖处理的小鼠出现了典型的慢性内脏疼痛行为，如在没有其他梳理行为的情况下舔腹部、全身伸展、腹部紧贴地面和收缩腹壁，这与先前的研究一致。我们还观察到，在野外测试时，酵母多糖处理的小鼠的行走、垂直、定型和跳跃计数以及行走距离都会长期减少。这些结果表明，酵母多糖引起的腹部内脏疼痛影响小鼠的自发反应和行为意向。IBS患者也出现了类似的活动减少现象[59，60]. 因此，结肠内注射酵母多糖引起的自发性内脏疼痛可以通过野外自发活动的减少来测量。此外，野外测试中自发活动的测量可用于预测实验性IBS疗法减轻自发性内脏疼痛的能力。

酵母多糖处理的小鼠表现出持续的焦虑样行为

IBS与焦虑、压力和抑郁等心理障碍的共同发病率很高[11-15]. 我们证明，与盐处理的小鼠相比，酵母聚糖处理的小鼠经历了更多的焦虑，这是通过旷野测试中的旅行距离和在中心区花费的时间以及高架迷宫和光/暗盒测试来测量的。因此，内脏伤害性刺激被解释为在酵母多糖处理的小鼠中引起内感受性焦虑。先前的人类和动物研究也表明，炎症性疼痛、慢性肌肉骨骼疼痛或神经性疼痛可能会诱发焦虑样行为[61-67]; 但请看[68]. 此外，最近的研究表明肠道微生物群的失调与IBS的发病机制有关[69]. 已知共生菌会影响多种复杂行为，包括社交、情绪和焦虑行为，并有助于小鼠和人类的大脑发育和功能[70，71]. 因此，用酵母多糖进行结肠内治疗可能会导致肠道生物失调并导致焦虑。

NB001对酵母聚糖处理小鼠的影响

AC1通过钙-钙调蛋白（CaM-）依赖性方式激活。它作用于谷氨酸NMDA受体的下游，有助于皮层和脊髓中与慢性疼痛相关的神经元可塑性[18，19，33，34，53，54]. 在本研究中，AC1抑制剂NB001对结肠内注射酵母多糖引起的内脏疼痛具有明显的镇痛作用。因为NB001对正常小鼠的运动功能没有影响[37]，我们推测NB001通过减轻自发性内脏疼痛来增加酵母聚糖处理小鼠的自发性行为。我们的数据表明，AC1信号通路在结肠内注射酵母多糖引起的内脏疼痛的处理中起着重要作用。根据MPI，动态计数可能是预测药物对自发性内脏疼痛的镇痛作用的最敏感参数。

NB001没有抑制酵母聚糖处理小鼠的焦虑样行为，这与我们之前的发现一致，即NB001对正常小鼠的焦虑状行为没有影响[37]. 我们认为疼痛会导致皮层可塑性，大脑可能会对来自外围的持续输入做出“化塑性”反应[18，72]. 因此，本研究中持续的有害内脏刺激能够导致长期的疼痛相关情绪障碍，在本例中为焦虑。此外，尽管疼痛相关焦虑与疼痛相关，但越来越多的证据表明，疼痛相关焦虑和疼痛感知无关[73]; 这一发现为我们的观察提供了一种解释，即NB001不能通过减轻小鼠内脏疼痛来缓解酵母多糖诱导的焦虑，加巴喷丁可以通过一种与镇痛无关的机制来减少焦虑行为。还需要更多的研究来找到其他方法来减轻疼痛引起的焦虑。

酵母多糖诱导的动物结肠炎

如前所述，动物结肠炎是由酵母多糖引起的[41，47，48]. 小鼠通过吸入异氟醚（1-3%，或根据需要）麻醉。手术期间，使用加热垫将体温维持在37°C。在眼睛上涂上润滑油膏（人造泪液）。通过22-规格、24-mm长的不锈钢喂食针，将0.1 ml酵母多糖悬浮液（30 mg/ml生理盐水；源自酿酒酵母；西格玛，圣路易斯，密苏里州）经腹注入小鼠结肠，持续2分钟。对对照组小鼠进行类似的程序，不同之处在于经阴道给予0.1ml生理盐水。连续三天每天服用酵母多糖或生理盐水。

免疫组织化学染色

第7天，对酵母聚糖处理的小鼠和盐水处理的小鼠进行深度麻醉，并灌注50 ml 0.9%生理盐水，然后灌注100 ml含有4%（w/v）多聚甲醛的0.1 M PB。灌注后立即取出大脑，置于含30%（w/v）蔗糖的0.1 M PB中，在4°C下过夜，并在冷冻切片机上切割成25μM厚的连续前额切片（Kryostat 1720；德国曼海姆莱茨）。按顺序收集切片，分为2个系列，并用0.01 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）清洗。将切片与小鼠抗Fos抗血清（1:500；Abcam，Cambridge，MA，USA）在含有5%（v/v）正常驴血清（NDS）、0.3%（v/v）Triton X-100、0.05%（w/v）NaN的PBS中孵育_三和0.25%（w/v）卡拉胶（PBS-NDS，pH 7.4）在4°C下过夜。

接下来，清洗切片，然后在室温（约22°C）下用生物素化抗鼠IgG（1:200，Millipore Corporation，USA）孵育2小时。然后在PBS中清洗切片（3×10分钟），并在亲和素-生物素复合物（美国向量实验室公司ABC试剂盒）中培养30分钟。在亲和素-生物素复合物中孵育后，再次清洗切片（3×10 min），并与0.05 M Tris–HCl缓冲液（pH 7.6）反应，该缓冲液含有0.04%二氨基苯扎定四氢氯化物（DAB）（日本熊本市道津市）和0.003%H₂哦₂用于可视化Fos；Fos阳性细胞核呈深棕色。再次清洗切片（取出DAB溶液后立即清洗一次，然后3×10分钟），然后安装在涂有明胶的玻璃载玻片上，让其风干过夜。切片在不断增加的乙醇浓度中脱水，清理干净，并盖上盖玻片，以进行光学显微镜检查（AHBT3；日本东京奥林巴斯）。

Fos表达的量化

大脑区域Fos-ir神经元的计数表示为每节神经元的平均数量。我们将分析局限于PFC、ACC、岛叶皮层、杏仁核、PAG、NTS和PBN，因为酵母多糖处理小鼠大脑中的大多数免疫标记神经元都位于这些区域。根据每个脑区至少6个切片中阳性染色细胞的计数，估计给定脑区中标记神经元的数量。为了避免对一个神经元进行多次计数，用于计数的部分之间至少间隔100μm。细胞计数的差异通过未配对的吨-测试以检查组之间的交互。计数由一名对治疗情况一无所知的研究人员进行。

行为测试

内脏疼痛行为计数：内脏疼痛的行为，如Laird所述[49]包括在没有其他梳理行为的情况下舔腹部、全身伸展、腹部紧贴地面、或收缩腹壁，以弓形姿势保持1-2秒（腹部收缩）。记录10分钟内内脏疼痛行为的总数。

开阔地：将小鼠置于一个新的开阔地（43.2×43.2×30.5 cm）^三; Med Associates，St.Albans，Vermont）在一个昏暗的隔离室内（露天场地中心<50勒克斯），配有风扇。活动监测系统（佛蒙特州圣奥尔本市Med Associates的活动监测系统）用于记录水平运动活动。简单地说，该系统使用成对的光束来检测运动（光束数量：16；光束间距：2.5 cm；区域数量：X:17，Y:17）。将每只动物放在开阔场地的中心，测量30分钟的活动。中心区由从（4，4）到（13，13）的区域定义。

高架+迷宫：高架+迷宫（Med Associates，St.Albans，Vermont）由两个彼此对齐的张开臂组成，垂直于两个彼此对齐的闭合臂[82]. 迷宫距离地面70厘米。在每次测试中，将单个动物放在中心广场上，头部朝向一只闭合的手臂。记录5分钟内进入每只手臂的次数和花费的时间。

明/暗盒：本研究中使用的明/暗盒子是Kim之前描述的明/暗盒的改进版本等。[23]. 该仪器包括一个矩形有机玻璃盒（44×8.5×25 cm^三)分为大小相等的明暗隔间，隔间由一扇门隔开。灯箱由放置在灯箱上方30厘米处的60-W台灯（400勒克斯）照明。每只动物被放置在黑暗的隔间中，并被允许进行20个部分的探索，然后打开光隔间的门。记录动物离开暗箱的时间和在光箱中度过的时间，持续10分钟。

在进行行为测试之前，将小鼠在观察室中驯化30分钟。行为测试由一名对治疗情况一无所知的研究人员在上午9:00至下午12:00进行。

药物注射

在行为测试之前，给小鼠注射NB001 3 mg/kg或加巴喷丁（Tocris Bioscience）30 mg/kg IP。