斑马鱼中许多核糖体蛋白基因是癌基因

多种癌症导致RP突变株的早期死亡率

上述实验鉴定了6个高死亡率的RP突变株系。虽然有些鱼类的死亡率可能是由肿瘤严重的鱼类引起的，因此在它们死亡之前就被从鱼缸中取出，但许多鱼类只是消失了，或者被发现死亡，并且病情严重，无法进行组织学分析。为了确定这些系的早期死亡率是否完全是由于致命的癌症，如果是，是由于zMPNSTs还是其他肿瘤类型，我们使用早期死亡率高的肿瘤hi10系的鱼进行了两个实验。在一个实验中，我们每周筛选hi10杂合子及其野生型兄弟姐妹，以寻找健康不良或外部可见生长的证据，从而在患病鱼类死亡或消失之前捕获所有患病鱼类。将患病的鱼处死，并进行组织学检查，所有22个月龄时看起来仍然健康的鱼也一样。结果如所示图3只有RP杂合子带鱼显示出早期死亡率，正如预期的那样，这是由癌症引起的。令人惊讶的是，在15个月大时发现的肿瘤中，两个是zMPNST，一个是视网膜母细胞瘤，三个是淋巴瘤，这些肿瘤类型与zMPNSTs一样，在我们的对照人群中很少出现。在老年鱼中检测到的肿瘤主要是zMPNST。到实验结束时（22个月），所有非携带者同胞对照组均显示健康，分步切片仅在13条鱼中检测到一条携带肿瘤的鱼，频率与对照组相当。这些结果支持hi10细胞系中观察到的早期死亡率是致命肿瘤的结果这一结论，并揭示这些包括zMPNSTs以及其他肿瘤类型。

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图3

hi10杂合子的肿瘤出现率

一组28条hi10鱼类和13条非携带者兄弟姐妹在22个月内观察到健康不良或外部可见肿瘤的出现。将有症状的个体处死、固定并切片进行组织学分析。该图表示了一段时间内剩余鱼的百分比，并对每一条移除的鱼进行了诊断。三条被标记为“死亡”的鱼在固定前死亡，组织损伤过大，无法确定诊断。此外，在实验过程中，有七条带鱼（尽管没有非带鱼）因未知原因而死亡；虽然它们很可能会死亡，但保守地说，它们已从图表中的鱼类总数中删除。在22个月时，还对剩余的外部健康鱼类（4/21携带者，13/13非携带者）进行了组织学检查，并显示了这些鱼类的状态。

在第二个实验中，我们进一步证明了hi10系鱼类易患多种肿瘤，在该实验中我们切割了hi10杂合子及其非携带者同胞对照（特别包括任何患病或生长的鱼类以及表面上健康的鱼类）在8至14个月龄之间大约每隔6周。如所示表2，我们在hi10携带者鱼中发现了明显可见和隐匿的zMPNST和其他肿瘤类型。因此，hi10株系（以及其他可能的高死亡率RP株系）易患多种肿瘤类型，尽管特别容易发展为zMPNST，尤其是在以后的时间点。

表2

hi10鱼类和非携带者同胞的肿瘤发生

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^一每个时间点的一条鱼都有两个肿瘤

携带者：起始种群为70条鱼；在实验过程中损失了七条鱼。非携带者：起始种群为92条鱼；在实验过程中丢失了三条鱼；研究结束时（14个月），32只外部健康的鱼未进行组织学检查

RP基因可能是单倍体不足的肿瘤抑制因子

脊椎动物易患癌症的显性突变可能是激活的致癌基因、隐性肿瘤抑制因子或单倍体肿瘤抑制因子(拉盖斯帕达2001). 一些证据表明，RP突变基因可能在斑马鱼中起到单倍体抑癌作用。通过RT-PCR和Northern印迹法（在某些情况下）测定，我们所有RP突变株系中的突变插入物减少或消除了RP基因的表达(图4A和数据未显示）。因此，大多数（如果不是全部）病毒插入似乎都是功能丧失突变。这表明RP基因没有突变形成激活的癌基因，而是可能起到抑癌作用。在哺乳动物中，隐性肿瘤抑制基因失活的最常见机制是在一个等位基因中获得突变（种系或体细胞），随后通过杂合性缺失（LOH）失去野生型等位基因(哈伯和哈洛1997). 因此，我们研究了野生型RP基因是否在斑马鱼肿瘤中丢失。我们从三个RP杂合突变株系hi10、hi258和hi1974中分离出正常组织和肿瘤组织，每一个都显示其各自的RP突变基因的表达减少10倍或更多(图4A） 并通过PCR检测这些样本的DNA中是否存在突变和野生型RP等位基因(图4B） ●●●●。在每一个病例中，我们都检测到野生型等位基因，反对这些肿瘤中的LOH。令人担忧的是，组织污染可能会产生误导性的LOH结果，尤其是因为鱼类的红细胞有核。因此，进行了控制PCR实验，将杂合胚胎和纯合胚胎的DNA样本以不同的比例混合。结果表明，我们的检测对野生型等位基因相对数量减少3倍的情况很敏感（数据未显示）。因此，除非肿瘤样本中含有超过33%的非肿瘤细胞，否则我们可以得出结论，野生型RP等位基因在这些肿瘤中没有丢失，因此RP基因可能不是隐性肿瘤抑制因子。在图中所示的其中一个肿瘤样本中图4在肿瘤hi10–1中，野生型等位基因似乎不仅存在，而且可能比突变等位基因的浓度更高，对同一DNA样本的Southern分析支持了这一观察结果（数据未显示）。因此，在这个特定的肿瘤中，突变的等位基因可能已经丢失，只有野生型等位基因保留。

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图4

RP基因似乎是单触性肿瘤抑制因子

（A） RP突变降低RP基因的表达量。从3倍纯合突变胚胎及其野生型同胞中制备RNA，并使用第一链cDNA的系列稀释液作为PCR模板。突变体中表达的减少可以通过野生型和PCR产物量减少的突变体之间稀释度的差异来确定。肌动蛋白对照显示，样品之间的mRNA总量相同。

（B） 在RP突变肿瘤中未观察到LOH。从同一条鱼的肿瘤（T）和正常组织（N）中制备DNA，用三个引物进行PCR，以显示插入型（突变）和野生型染色体的存在或缺失。在每种情况下，上部带为野生型染色体，下部带为插入型染色体。hi10 fish#1正常（车道1），肿瘤（车道2）；hi10 fish#2正常（3车道），肿瘤（4车道）；hi258鱼正常（第5车道），肿瘤（第6车道）；hi1974鱼正常（7号线），肿瘤（8号线）。

在小鼠中，一种肿瘤细胞系被描述为RP基因的一个拷贝被删除，而另一个拷贝发生了可能导致肿瘤发生的突变(Beck-Engeser等人，2001年). 为了排除RP突变肿瘤中野生型等位基因的点突变，从每个正常和肿瘤DNA样本中对适当RP基因的所有编码外显子及其两侧至少50 bp的内含子序列进行测序。这些肿瘤中没有任何点突变的迹象。这些样本中肿瘤细胞中野生型等位基因的明显保留，以及在肿瘤细胞DNA中野生型RP基因中未观察到点突变的事实，表明导致肿瘤发生的不是这些基因座中的第二次突变。相反，获得的数据表明，这些基因在斑马鱼中起到了单倍体抑癌作用。

这些突变是如何导致癌症的？

这项发现发现，许多不同RP基因的突变，包括S7、S8、S15a、S18、S29、L7、L13、L23a、L35、L36、，和L36a，易患癌症表明，RP的共同功能是其在该表型中作用的基础。然而，并非所有RP基因都是癌症基因：S12、S15、L3、L24、，和液化石油气1杂合子显示正常。这就增加了这样一种可能性，即致癌RP基因可能会独立于其在核糖体中的作用而共享一些新的生物功能，并且抑制这种功能会导致肿瘤的形成。单个RP与多种生物功能有关，包括细胞周期进展、凋亡和DNA损伤反应(Ben Ishai等人，1990年;Sonenberg 1993年;Chen等人，1998年;Chen和Ioannou 1999;好时和宫本茂2000;Volarevic等人，2000年;沃拉雷维奇和托马斯2001;Lohrum等人，2003年)有人认为，它们在这些过程中的作用可能独立于它们在核糖体本身中的作用(羊毛1996;Wool等人，1996年;Soulet等人，2001年). 然而，在我们看来，可能存在如此重要但仍未检测到的功能，涉及如此多不同的RP，这似乎有点不太可能。因此，我们认为这是一种共享的、核糖体相关的功能，可以使它们成为肿瘤抑制因子。如果是这样的话，为什么这项研究中没有所有的RP基因癌症基因？目前我们只能推测。我们还没有发现任何能区分易患癌症和不易患癌症的RP基因的相关性。两者都可以属于大型或小型核糖体亚单位，所有突变体都表现出基因表达降低。可能一些RP基因的正常表达水平高于其他基因，因此它们的表达减少50%不会使它们的蛋白质水平降低到肿瘤抑制所需的临界假设阈值以下。

RP最著名的共同功能是它们在核糖体亚单位组装中的作用，因此，它们在翻译中的作用。在纯合子突变的鱼类胚胎中，RP突变减少了它们所属亚单位的rRNA数量，因此几乎可以肯定地减少了相对剩余亚单位的相应核糖体亚单位的数量。众所周知，在酵母中，这可以减少核糖体的数量，从而也可以减少蛋白质的合成量。这会如何诱发癌症？事实上，我们不知道，并且怀疑理解解释这些发现的机制将导致对生长控制的新见解。目前我们只能列出我们的推测和一些相关的观察结果。

蛋白质合成减少可能导致关键抑癌蛋白水平降低，或凋亡或分化的正调控因子水平降低，两者都可能有利于生长。核糖体数量减少可能意味着细胞试图通过制造核糖体生物生成所需的更多成分来克服缺陷，而这反过来又可能促进细胞生长。或者，核糖体数量的减少可能会改变核糖体所吸收信息的身份，类似于致癌基因对哺乳动物细胞翻译能力的调节，例如Ras公司或阿克特已知可改变多聚体mRNA的特性，改变促生长基因的翻译速率(Rajasekhar等人，2003年). 最后，也是这些可能性中最具推测性的一点是，核糖体亚单位正确组装能力的降低可能会产生一个信号，细胞将其解释为促生长。例如，具有许多发夹的多余rRNA的降解可能以RNAi的形式产生这样的信号。

我们感谢梅格·坎宁安（Meg Cunningham）和凯特·安德森（Kate Anderson）维持了鱼类的突变系，感谢汤姆·索伊（Tom Souse）、萨姆·法林顿（Sam Farrington）、克里斯·多勒（Chris Doller）和蒂姆·安吉里尼（Tim Angelini）维持了斑马鱼群体。我们感谢癌症研究组织学机构中心，特别是Alicia Caron的样品处理和切片，以及Jan Spitsbergen、Michael Schmale和Margaret McLaughlin对组织学分析的建议。我们感谢Tyler Jacks对手稿的宝贵评论，感谢Keith Cheng和Philip Sharp的有益讨论。我们感谢琼·鲁德曼（Joan Ruderman）对K.C.S的支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院国家研究资源中心（NIH）（给N.H.）、安进（给N.H）、大卫·科赫研究基金（给J.A.L.和N.H）和NIH（给麻省理工学院癌症研究中心）的资助。A.A.由福特基金会的奖学金资助，K.C.S.由NIH的奖学金资助；K.L.由NIH提供的产前培训补助金资助。