《公共科学图书馆·生物》。2004年5月;2(5):e133。
播下新范式的种子
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摘要
近年来,RNA介导的基因沉默已成为调节基因表达的一种重要机制。一些关键发现是在植物中发现的
尽管“革命”一词在科学中不应被轻易使用,但没有其他方式来描述我们最近对RNA介导的基因沉默途径的认识和理解的激增。RNA介导的基因沉默的核心是一种双链RNA(dsRNA),它被Dicer酶切成微小的RNA。微小的RNA与各种沉默效应物复合体相关,并通过碱基配对连接到同源靶序列(RNA或DNA)。根据效应物复合物的蛋白质组成和靶序列的性质,结果可能是mRNA降解、翻译抑制或基因组修饰,所有这些都沉默了基因表达(). RNA介导的基因沉默途径存在于植物、动物和许多真菌中,在发育、染色体结构和病毒抗性中具有重要作用。尽管机制细节仍在研究中,但RNA-介导的沉默已经为研究基因功能提供了强有力的工具,并催生了一个旨在开发新型RNA-治疗人类疾病的新兴产业(罗宾逊2004).
RNA介导的沉默来源于dsRNA Dicer裂解的短RNA被纳入多蛋白效应复合物,如RISC和RITS(RNA诱导TGS的启动)(Verdel等人,2004年)靶向mRNA降解(RNAi/PTGS)、翻译抑制或TGS和基因组修饰。ARGONAUTE(AGO)蛋白质(该名称来源于一种植物突变体[Bohmert等人,1998年])结合短RNA并将其“引导”到适当的效应复合物(Carmell等人,2002年). siRNA来源于完美的RNA双链,可以通过ssRNA模板上的RDR活性产生;miRNAs来源于植物和动物基因组基因间区域编码的不完美RNA发夹。功能显示在底部。除了在转基因沉默中的作用外,TGS和RNAi/PTGS都控制称为转座子的基因组寄生虫(弗拉维尔1994;Plasterk 2002年). 基因组修饰(DNA和组蛋白甲基化)可能被短RNA靶向,短RNA与DNA或从靶基因合成的新生RNA碱基配对(格雷瓦尔和摩押2003). 靶核酸显示为蓝色,短RNA显示为红色,蛋白质和酶复合物显示为椭圆形。
1998年,在线虫中发现RNA介导的基因沉默后,许多生物学家首次了解到这一点秀丽隐杆线虫(Fire等人,1998年),称为RNA干扰(RNAi)的过程,其中dsRNA触发序列特异性mRNA降解。然而,RNA介导的沉默的根源可以追溯到15年前,当时少数植物实验室偶然发现转基因植物基因沉默的奇怪案例。为了突出植物科学家对该领域的许多开创性贡献,我们在此就植物中RNA介导的基因沉默的起源和历史提供个人观点。
早期沉默现象
从20世纪80年代末开始,从事转基因植物研究的生物学家们发现自己面临着一系列意料之外的基因沉默现象(马丁森和理查兹1995). 最有趣的是,沉默似乎是由DNA或RNA序列相互作用触发的,这种相互作用可能发生在两个共享序列同源性的单独转基因之间,或发生在转基因和同源植物基因之间。一些早期的例子提供了两种RNA介导的基因沉默的原型,这两种类型的基因沉默是今天公认的。在一种类型中,沉默源于mRNA合成的阻滞(转录基因沉默[TGS]);在第二种类型中,沉默是由mRNA降解引起的(转录后基因沉默[PTGS])().
当两种不同的转基因复合物按顺序导入烟草基因组时,TGS被发现。每个复合物编码不同的蛋白质,但包含相同的基因调控区(启动子)。出乎意料的是,第一个自身稳定活跃的转基因复合物经常在第二个复合物的存在下沉默(). 沉默转基因的启动子获得DNA甲基化,这是一种经常与沉默相关的基因组修饰。当转基因复合物在后代中相互分离时,沉默和甲基化被逆转,这表明共同启动子区域之间的相互作用触发沉默和甲基化合(Matzke等人,1989年;Park等人,1996年).
转基因植物中基因沉默的早期例子TGS:通常情况下,当两株分别含有编码卡那霉素(kan)或潮霉素(hygromycin)抗性的转基因植物杂交时,50%的后代对个别抗生素具有抗性,25%的后代对两者的组合具有抗性(上图)。在沉默的情况下,KAN标记的表达在HYG标记的存在下被抑制,如只有25%的KAN抗性和无双重抗性(中间)所示。PTGS:野生型矮牵牛(左下)通过编码色素蛋白的转基因转化,由于转基因和同源内源植物基因的共同抑制,可能导致色素(白色区域)损失。(左侧和中间的照片由Jan Kooter提供,右侧的照片由Natalie Doetsch和Rich Jorgensen提供。)
PTGS以两种方式被发现。其中一项涉及评估反义抑制的实验,这是当时选择性沉默植物基因表达的一种有希望的方法。理论上,转基因编码的反义RNA应该与植物基因的互补mRNA碱基配对,防止其转化为蛋白质。虽然对照组的“感觉”转基因RNA不能与mRNA碱基配对,因此不应诱导沉默,但它们常常令人费解地这样做(Smith等人,1990年). 在另一种类型的实验中,通过过度表达编码与色素合成有关的蛋白质的转基因来增强矮牵牛花的花色,结果导致部分或完全失色(). 这是由于转基因和同源植物基因的协同沉默(“抑制”)所致(Napoli等人,1990年;Van der Krol等人,1990年),后来证明发生在转录后水平(De Carvalho等人,1992年;Van Blokland等人,1994年)在丝状真菌中观察到一种相关的现象,称为镇静剂粗糙脉孢菌(Romano和Macino 1992). 与TGS相似,PTGS通常与转基因序列的DNA甲基化有关(Ingelbrecht等人,1994年).
20世纪90年代初出现了两篇有影响力的论文。一篇报道称,在转基因烟草中发现了RNA定向DNA甲基化(Wassenegger等人,1994年). 这是RNA诱导DNA修饰的最早证明,我们将回到下面的过程。第二项研究表明,植物RNA病毒可能是PTGS的启动子和靶点。表达编码截短病毒外壳蛋白的转基因植物对相应的病毒产生抗性,这种状态是通过病毒RNA和转基因mRNA的相互降解实现的(Lindbo等人,1993年). 除了在RNA病毒耐药性和PTGS之间建立联系外,本研究还包括一个显著的PTGS预测模型,该模型具有RNA-依赖性RNA聚合酶(RDR)、小RNA和dsRNA的特征,所有这些后来都被发现对RNAi很重要。PTGS随后于1997年被证明可以保护植物免受病毒感染(Covey等人,1997年;Ratcliff等人,1997年). 因此,转基因PTGS利用了先前存在的抗病毒自然机制。
概括一下:到1998年,即报告RNAi的那一年,科学家们已经记录了序列特异性RNA降解(PTGS)、触发TGS的序列特异性DNA甲基化和RNA-定向DNA甲基化。他们还提出了涉及dsRNA的PTGS模型(Lindbo等人,1993年;Metzlaff等人,1997年)、小RNA和RDR(Lindbo等人,1993年).
RNA干扰
RNAi是在比较单链RNA(ssRNAs)(反义或正义)及其dsRNA杂交产物的沉默活性的实验中发现的。虽然用单链向蠕虫注射后,目标基因只能实现边际沉默,注射正反义混合物导致有效和特异的沉默(Fire等人,1998年). 这明确指出dsRNA是沉默的触发因素。不久之后,dsRNA被证明可以在其他生物体(包括植物)中引发基因沉默(Waterhouse等人,1998年). 事实上,在对蠕虫、植物和神经孢子菌属确定了各自沉默途径中的常见成分(Denli和Hannon 2003年). 这包括前面提到的RDR,它可以从ssRNA模板合成dsRNA(参见). PTGS现在被认为是RNAi的植物等效物。
RNAi的发现确立了dsRNA沉默的要求,但其机制的细节仍不清楚。1999年,研究PTGS的植物科学家在转基因植物中检测到与沉默靶基因相对应的小RNA(约25个核苷酸长)时,提供了一条关键线索(Hamilton和Baulcombe 1999). 他们认为小RNA为沉默提供了至关重要的特异性决定因素。与此相一致的是果蝇属该系统证明,从切割长dsRNA得到的21–23个核苷酸“短干扰”RNA(siRNAs)可以引导mRNA切割(Zamore等人,2000年;Elbashir等人,2001年); 已鉴定的RISC(RNA诱导沉默复合物),一种与小RNA相关并执行靶mRNA切割的核酸酶(Hammond等人,2000年); 并鉴定了Dicer,一种将dsRNA切割成短RNA的酶(Bernstein等人,2001年)(请参见).
RNAi/PTGS最初是在涉及转基因、注射RNA或病毒的实验中检测到的。RNAi机器是否也产生用于宿主基因调节的小RNA?令人惊讶的是,新发现的siRNAs与几个“小时间”RNA的大小相同,最初于1993年被确定为蠕虫发育时间的重要调节器(Lee等人,1993年;Reinhart等人,2000年). 2001年,当英勇的克隆工作发掘出数十个长度为21–25个核苷酸的天然小RNA时,一切都走到了一起,首先是从蠕虫和苍蝇,然后是从植物和哺乳动物中(赖2003;巴特尔2004). 与siRNAs类似,天然小RNA,也称为microRNAs(miRNAs),来源于dsRNA前体的Dicer处理,并被纳入RISC(Denli和Hannon 2003年). 在许多情况下,miRNAs通过与靶mRNAs的3′端碱基配对和抑制翻译来实现沉默(参见). miRNAs现在被认为是植物和动物发育的关键调节因子。确定目标基因和全方位的行动是密集研究的领域(赖2003;巴特尔2004).
直到2002年,RNAi/PTGS和miRNAs都是RNA介导的基因沉默研究的热点。然而,下一个重大进展突然将注意力转向了RNA引导的基因组修改。到2001年,从事RNA-定向DNA甲基化和TGS研究的植物科学家已经证明了对加工成短RNA的dsRNAs的需求,加强了与PTGS的机械联系(Mette等人,2000年;Sijen等人2001). 这确立了RNA引导的基因组修改的原则,但这一过程的普遍性尚不确定,因为并非所有生物体都将其DNA甲基化。随着2002年在裂变酵母中发现RNA诱导的异染色质组装体,人们广泛接受了这一说法(霍尔等人,2002年;Volpe等人,2002年). 这种沉默途径利用Dicer和其他RNAi成分产生的短RNA来指导DNA相关蛋白(组蛋白)的甲基化,从而产生浓缩的、转录沉默的染色体区域(异染色质)(见). 该途径的靶点包括着丝粒,着丝粒对正常染色体分离至关重要。在植物中发现了依赖RNAi的异染色质途径(Zilberman等人,2003年)和果蝇属(Pal-Badra等人,2004年)并且可能代表了创建浓缩、沉默染色体域的一般方法。
致谢
我们感谢沃纳·奥夫萨茨对手稿的评论。我们实验室关于RNA介导的基因沉默的工作得到了奥地利Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung(授予P-15611-B07)和欧盟(合同HPRN-CT-2002-00257)的支持。
缩写
安大略美术馆 | 阿戈纳特 |
DCL公司 | 类Dicer |
双链核糖核酸 | 双链RNA |
微小RNA | 微小RNA |
PTGS公司 | 转录后基因沉默 |
印度存托凭证 | 依赖RNA的RNA聚合酶 |
RISC公司 | RNA诱导沉默复合物 |
RITS公司 | RNA诱导的转录基因沉默起始 |
RNA干扰 | RNA干扰 |
小干扰RNA | 短干扰RNA |
ssRNA | 单链RNA |
TGS公司 | 转录基因沉默 |
工具书类
- Anandalakshmi R、Pruss G、Ge X、Marathe R、Mallory A等。植物基因沉默的病毒抑制剂。美国国家科学院院刊。1998;95:13079–13084. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Bartel博士。微RNA:基因组学,生物发生,机制和功能。细胞。2004;116:281–297.[公共医学][谷歌学者]
- Béclin C、BerthoméR、Palauqui J、Tepfer M、Vaucheret H。CMV对烟草或拟南芥植物的感染可抵消非病毒(反式)基因的系统转录后沉默。病毒学。1998;252:313–317.[公共医学][谷歌学者]
- Bernstein E,Caudy A,Hammond S,Hannon G.二元酸核糖核酸酶在RNA干扰起始步骤中的作用。自然。2001;409:363–366.[公共医学][谷歌学者]
- Bohmert K、Camus I、Bellini C、Bouchez D、Caboche M等。AGO1定义了控制叶片发育的拟南芥新基因座。EMBO J。1998;7:170–180. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Brigneti G,Voinnet O,Li W-X,Ji L-H,Ding S-W,等.烟草转基因沉默的病毒致病性决定因素.EMBO J。1998;17:6739–6746. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 已缩回
- Carmell M,Xuan Z,Zhang M,Hannon G。Argonaute家族:涉及RNAi、发育控制、干细胞维持和肿瘤发生的触须。基因开发。2002;16:2733–3742.[公共医学][谷歌学者]
- Covey S、Al-Kaff N、Lángara A、Turner D。植物通过基因沉默对抗感染。自然。1997;385:781–782. [谷歌学者]
- De Carvalho F、Gheyson G、Kushnir S、van Montagu M、InzéD等。纯合植物中β-1,3-葡聚糖酶转基因表达的抑制。EMBO J。1992;11:2595–2602. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Denni A,Hannon G.RNAi:一个不断增长的难题。生物化学科学趋势。2003;28:196–201.[公共医学][谷歌学者]
- Elbashir S、Lendecel W、Tuschl T。RNA干扰由21和22核苷酸RNA介导。基因开发。2001;15:188–200. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Finnegan EJ,Margis R,Waterhouse P.拟南芥CARPEL FACTORY(DICER-LIKE1)突变体中转录后基因沉默未受到影响,该突变体是果蝇DICER-1的同源物.当前生物量。2003;13:236–240.[公共医学][谷歌学者]
- Fire A,Xu S,Montgomery M,Kostas S,Driver S,et al.秀丽隐杆线虫双链RNA的有效和特异性遗传干扰.自然。1998;391:806–811.[公共医学][谷歌学者]
- Flavell RB(襟翼RB)。特定序列重复导致植物基因表达失活。美国国家科学院院刊。1994;91:3490–3496. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Grewal SIS,Moazed D.异染色质和基因表达的表观遗传控制。科学。2003;301:798–802.[公共医学][谷歌学者]
- Hall I、Shankaranarayana G、Noma K-I、Ayoub N、Cohen A等。异色结构域的建立和维护。科学。2002;297:2232–2237.[公共医学][谷歌学者]
- Hamilton AJ,Baulcombe DC公司。植物转录后基因沉默中的一种小反义RNA。科学。1999;286:950–952.[公共医学][谷歌学者]
- Hammond S,Bernstein E,Beach D,Hannon G。一种RNA-定向核酸酶在果蝇细胞中介导转录后基因沉默。自然。2000;404:293–296.[公共医学][谷歌学者]
- Ingelbrecht I,van Houdt H,Montagu M,Depicker A.烟草中报告转基因的转录后沉默与DNA甲基化相关。美国国家科学院院刊。1994;91:10502–10506. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Kasschau K,Carrington J.植物病毒的防御策略:转录后基因沉默的抑制。细胞。1998;95:461–470.[公共医学][谷歌学者]
- 赖EC。microRNAs:基因组中的小片段表达了自己的观点。当前生物量。2003;13(增刊):R925–R936。[公共医学][谷歌学者]
- Lee R、Feinbaum R、Ambros V.秀丽线虫异慢性基因线-4编码具有反义互补性的小RNA第14行.细胞。1993;75:843–854.[公共医学][谷歌学者]
- Li W,Li H,Lu R,Li F,Dus M,等。流感和痘苗病毒的干扰素拮抗蛋白是RNA沉默的抑制物。美国国家科学院院刊。2004;101:1350–1355. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Lindbo J,Silva-Rosales L,Proebsting W,Dougherty W。转基因植物中高度特异性抗病毒状态的诱导:基因表达调控和病毒抗性的意义。植物细胞。1993;5:1749–1759. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- 马萨诸塞州理查兹马丁森。真核生物中的DNA甲基化。当前操作基因开发。1995;5:234–242.[公共医学][谷歌学者]
- Matzke M,Primig M,Trnovsky J,Matzke A.顺序转化植物中标记基因的可逆甲基化和失活。EMBO J。1989;8:643–649. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Mette MF、Aufsatz W、van der Winden J、Matzke M和Matzke A.双链RNA引发的转录基因沉默和启动子甲基化。EMBO J。2000;19:5194–5201. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Metzlaff M,O'Dell M,Cluster P,Flavell R.RNA介导的RNA降解和矮牵牛查尔酮合酶A沉默。细胞。1997;88:845–854.[公共医学][谷歌学者]
- Napoli C,Lemieux C,Jorgensen R.将嵌合查尔酮合成酶基因导入矮牵牛会导致同源基因的可逆共抑制在trans中.植物细胞。1990;2:279–289. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Palauqui J,Elmayan T,Pollien J,Vaucheret H.系统获得性沉默:转基因特异性转录后沉默通过从沉默的砧木移植到非沉默的接穗来传递。EMBO J。1997;16:4738–4745. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Pal-Badra M、Leibovitch B、Gandhi S、Rao M、Bhadra U等。果蝇的异色沉默和HP1定位依赖于RNAi机制。科学。2004;303:669–672.[公共医学][谷歌学者]
- Park W,Li J,Song R,Messing J,Chen X.CARPEL FACTORY(Dicer同源物)和HEN1(新蛋白)在拟南芥的microRNA代谢中起作用.当前生物量。2002;12:1484–1495. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Park Y-D、Papp I、Moscone E、Iglesias V、Vaucheret H等。启动子同源性介导的基因沉默发生在转录水平,导致甲基化和基因活性的减数遗传改变。工厂J。1996;9:183–194.[公共医学][谷歌学者]
- Plasterk R.RNA沉默:基因组的免疫系统。科学。2002;296:1263–1265.[公共医学][谷歌学者]
- Ratcliff F,Harrison B,Baulcombe D。植物中病毒防御和基因沉默之间的相似性。科学。1997;276:1558–1560.[公共医学][谷歌学者]
- Reinhart B、Slack F、Basson M、Pasquinelli A、Bettinger J等人。21核苷酸let-7RNA调节秀丽隐杆线虫的发育时间.自然。2000;403:901–906.[公共医学][谷歌学者]
- Reinhart B、Weinstein E、Rhoades M、Bartel B、Bartel.D.植物中的微RNA。基因开发。2002;16:1616–1626. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Robinson R.RNAi疗法:可能性有多大,多久?《公共科学图书馆·生物》。2004;2:e28.doi:10.1371/journal.pbio.0020028。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Romano N,Macino G.Quelling:通过同源序列转化使粗糙脉孢菌的基因表达暂时失活。摩尔微生物。1992;6:3343–3353.[公共医学][谷歌学者]
- Schauer S,Jacobsen S,Meinke D,Ray A.DICER-LIKE1:拟南芥发育中的盲人和大象。植物科学趋势。2002;7:487–491.[公共医学][谷歌学者]
- Sijen T、Vijn I、Rebocho A、van Blokland R、Roelofs D等。转录和转录后基因沉默在机制上是相关的。当前生物量。2001;11:436–440.[公共医学][谷歌学者]
- Smith C、Watson C、Bird C、Ray J、Schuch W等。截断番茄多聚半乳糖醛酸酶基因的表达抑制转基因植物中内源性基因的表达。分子遗传学。1990;224:477–481.[公共医学][谷歌学者]
- Van Blokland R,Van der Geest N,Mol J,Kooter J.转基因抑制矮牵牛查尔酮合成酶表达是RNA周转增加的结果。工厂J。1994;6:861–877. [谷歌学者]
- Van der Krol A,Mur L,Beld M,Mol JNM,Stuitje AR。矮牵牛中的类黄酮基因:添加有限数量的基因拷贝可能会导致基因表达抑制。植物细胞。1990;2:291–299. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Vargason J、Szittya G、Burgyán J、Tanaka Hall T。RNA沉默抑制物对siRNA的大小选择性识别。细胞。2003;115:799–811.[公共医学][谷歌学者]
- Verdel A,Jia S,Gerber S,Sugiyama T,Gygi S,等。RITS复合物对异染色质的RNAi介导靶向。科学。2004;303:672–676. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Voinnet O,Baulcombe D.基因沉默中的系统性沉默。自然。1997;389:553.[公共医学][谷歌学者]
- Volpe T、Kidner C、Hall I、Teng G、Grewal S等。RNA干扰对异色沉默和组蛋白H3赖氨酸-9甲基化的调节。科学。2002;297:1833–1837.[公共医学][谷歌学者]
- Wassenegger M,Heimes S,Riedel L,Sänger H.植物基因组序列的RNA定向从头甲基化。细胞。1994;76:567–576.[公共医学][谷歌学者]
- Waterhouse P、Graham M、Wang MB。同时表达正、反义RNA可以诱导植物对病毒的抗性和基因沉默。美国国家科学院院刊。1998;95:13959–13964. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Xie Z,Johansen L,Gustafson A,Kasschau K,Lellis A等。植物小RNA途径的遗传和功能多样性。公共科学图书馆生物。2004;2:e104.doi:10.1371/journal.pbio.0020104。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Zamore P,Tuschl T,Sharp P,Bartel D.RNAi:双标记RNA以21至23个核苷酸间隔指导ATP依赖的mRNA切割。细胞。2000;101:25–33.[公共医学][谷歌学者]
- Zilberman D、Cao X、Jacobsen S。阿根廷4控制局部特异性siRNA积累和DNA和组蛋白甲基化。科学。2003;299:716–719.[公共医学][谷歌学者]