播下新范式的种子

摘要

虽然“革命”一词在科学中不应被轻描淡写地使用，但我们对RNA-介导的基因沉默途径的认识和理解最近发生了爆炸，没有其他方式可以描述这一现象。RNA介导的基因沉默的核心是一种双链RNA（dsRNA），它被Dicer酶切成微小的RNA。微小的RNA与各种沉默效应物复合体相关，并通过碱基配对连接到同源靶序列（RNA或DNA）。根据效应物复合物的蛋白质组成和靶序列的性质，结果可能是mRNA降解、翻译抑制或基因组修饰，所有这些都沉默了基因表达(图1). RNA介导的基因沉默途径存在于植物、动物和许多真菌中，在发育、染色体结构和病毒抗性中发挥着重要作用。尽管机制细节仍在研究中，但RNA-介导的沉默已经为研究基因功能提供了强有力的工具，并催生了一个旨在开发新型RNA-治疗人类疾病的新兴产业(罗宾逊2004).

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图1

RNA介导的沉默

来源于dsRNA Dicer裂解的短RNA被纳入多蛋白效应复合物，如RISC和RITS（RNA诱导TGS的启动）(Verdel等人，2004年)靶向mRNA降解（RNAi/PTGS）、翻译抑制或TGS和基因组修饰。ARGONAUTE（AGO）蛋白质（该名称来源于一种植物突变体[Bohmert等人，1998年])结合短RNA并将其“引导”到适当的效应复合物(Carmell等人，2002年). siRNA来源于完美的RNA双链，可以通过ssRNA模板上的RDR活性产生；miRNA来源于植物和动物基因组基因间区域编码的不完美RNA发夹。功能显示在底部。除了在转基因沉默中的作用外，TGS和RNAi/PTGS都控制称为转座子的基因组寄生虫(Flavell 1994年;Plasterk 2002年). 基因组修饰（DNA和组蛋白甲基化）可能被短RNA靶向，短RNA与DNA或从靶基因合成的新生RNA碱基配对(格雷瓦尔和摩押2003). 靶核酸显示为蓝色，短RNA显示为红色，蛋白质和酶复合物显示为椭圆形。

1998年，许多生物学家在线虫中首次发现了RNA介导的基因沉默秀丽隐杆线虫(Fire等人，1998年)RNA干扰（RNAi）过程中，dsRNA触发序列特异性mRNA降解。然而，RNA介导的沉默的根源可以追溯到15年前，当时少数植物实验室偶然发现转基因植物基因沉默的奇怪案例。为了突出植物科学家对该领域的许多开创性贡献，我们在此就植物中RNA介导的基因沉默的起源和历史提供个人观点。

早期沉默现象

从20世纪80年代末开始，从事转基因植物研究的生物学家们发现自己面临着一系列意料之外的基因沉默现象(马丁森和理查兹1995). 最有趣的是，沉默似乎是由DNA或RNA序列相互作用触发的，这种相互作用可能发生在两个共享序列同源性的单独转基因之间，或发生在转基因和同源植物基因之间。一些早期的例子提供了两种目前公认的RNA介导的基因沉默的原型。在一种类型中，沉默源于mRNA合成的阻滞（转录基因沉默[TGS]）；在第二种类型中，沉默是由mRNA降解引起的（转录后基因沉默[PTGS]）(图1).

当两种不同的转基因复合物按顺序导入烟草基因组时，TGS被发现。每个复合物编码不同的蛋白质，但包含相同的基因调控区（启动子）。出乎意料的是，第一个自身稳定活跃的转基因复合物经常在第二个复合物的存在下沉默(图2). 沉默转基因的启动子获得DNA甲基化，这是一种经常与沉默相关的基因组修饰。当转基因复合物在后代中相互分离时，沉默和甲基化被逆转，这表明共同启动子区域之间的相互作用触发沉默和甲基化合(Matzke等人1989;Park等人，1996年).

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图2

转基因植物中基因沉默的早期例子

TGS：通常情况下，当两个分别携带编码卡那霉素（kan）或潮霉素（hyg）抗性的单独转基因的植物杂交时，50%的后代对单个抗生素具有抗性，25%的后代对两者的组合具有抗性（顶部）。在沉默的情况下，KAN标记的表达在HYG标记的存在下被抑制，如只有25%的KAN抗性和无双重抗性（中间）所示。PTGS：野生型矮牵牛（左下）通过编码色素蛋白的转基因转化，由于转基因和同源内源植物基因的共同抑制，可能导致色素（白色区域）损失。（左侧和中间的照片由Jan Kooter提供，右侧的照片由Natalie Doetsch和Rich Jorgensen提供。）

PTGS以两种方式被发现。其中一项涉及评估反义抑制的实验，这是当时选择性沉默植物基因表达的一种有希望的方法。理论上，转基因编码的反义RNA应该与植物基因的互补mRNA碱基配对，阻止其翻译成蛋白质。虽然对照组的“感觉”转基因RNA不能与mRNA碱基配对，因此不应诱导沉默，但它们常常令人费解地这样做(Smith等人，1990年). 在另一种类型的实验中，通过过表达编码参与色素合成的蛋白质的转基因来增强矮牵牛花的着色，结果却导致了部分或完全的颜色损失(图2). 这是由于转基因和同源植物基因的协同沉默（“抑制”）所致(Napoli等人，1990年;Van der Krol等人，1990年)，后来证明发生在转录后水平(De Carvalho等人，1992年;Van Blokland等人，1994年)在丝状真菌中观察到一种相关的现象，称为镇静剂粗糙脉孢菌(Romano和Macino 1992). 与TGS相似，PTGS通常与转基因序列的DNA甲基化有关(Ingelbrecht等人，1994年).

20世纪90年代初出现了两篇有影响力的论文。一篇报道称，在转基因烟草中发现了RNA定向DNA甲基化(Wassenegger等人，1994年). 这是RNA诱导DNA修饰的最早证明，我们将回到下面的过程。第二项研究表明，植物RNA病毒可能是PTGS的启动子和靶点。表达编码截短病毒外壳蛋白的转基因植物对相应的病毒产生抗性，这种状态是通过病毒RNA和转基因mRNA的相互降解实现的(Lindbo等人，1993年). 除了在RNA病毒耐药性和PTGS之间建立联系外，本研究还包括一个显著的PTGS预测模型，该模型具有RNA-依赖性RNA聚合酶（RDR）、小RNA和dsRNA的特征，所有这些后来都被发现对RNAi很重要。PTGS随后于1997年被证明可以保护植物免受病毒感染(Covey等人，1997年;Ratcliff等人，1997年). 因此，转基因PTGS利用了先前存在的抗病毒自然机制。

概括一下：到1998年，即报告RNAi的那一年，科学家们已经记录了序列特异性RNA降解（PTGS）、触发TGS的序列特异性DNA甲基化和RNA-定向DNA甲基化。他们还提出了涉及dsRNA的PTGS模型(Lindbo等人，1993年;Metzlaff等人，1997年)、小RNA和RDR(Lindbo等人，1993年).

RNA干扰

RNAi是在旨在比较单链RNA（反义或有义）与其dsRNA杂交体的沉默活性的实验中发现的。虽然在给蠕虫注射单链后仅实现了靶基因的边缘沉默，注射正反义混合物导致有效和特异的沉默(Fire等人，1998年). 这明确指出dsRNA是沉默的触发因素。不久之后，dsRNA被证明可以在其他生物体（包括植物）中引发基因沉默(Waterhouse等人，1998年). 事实上，在对蠕虫、植物和神经孢子菌属确定了各自沉默途径中的常见成分(Denli和Hannon 2003年). 这包括上述RDR，它可以从ssRNA模板合成dsRNA（见图1). PTGS现在被认为是RNAi的植物等效物。

RNAi的发现确立了dsRNA沉默的要求，但其机制的细节仍不清楚。1999年，研究PTGS的植物科学家在转基因植物中检测到与沉默的靶基因相对应的小RNA（约25个核苷酸长）时提供了一条重要线索(汉密尔顿和鲍尔科姆1999). 他们认为小RNA为沉默提供了至关重要的特异性决定因素。与此相一致果蝇属该系统证明，从切割长dsRNA得到的21–23个核苷酸“短干扰”RNA（siRNAs）可以引导mRNA切割(Zamore等人，2000年;Elbashir等人，2001年); 已鉴定的RISC（RNA诱导沉默复合物），一种与小RNA相关并执行靶mRNA切割的核酸酶(Hammond等人，2000年); 并鉴定了Dicer，一种将dsRNA切割成短RNA的酶(Bernstein等人2001)（请参见图1).

RNAi/PTGS最初是在涉及转基因、注射RNA或病毒的实验中检测到的。RNAi机器是否也产生用于宿主基因调节的小RNA？令人惊讶的是，新发现的siRNAs与几个“小时间”RNA的大小相同，最初于1993年被确定为蠕虫发育时间的重要调节器(Lee等人，1993年;Reinhart等人，2000年). 2001年，当英勇的克隆工作发掘出数十个长度为21–25个核苷酸的天然小RNA时，一切都走到了一起，首先是从蠕虫和苍蝇，然后是从植物和哺乳动物中(赖2003;巴特尔2004). 与siRNAs类似，天然小RNA，也称为microRNAs（miRNAs），来源于dsRNA前体的Dicer处理，并被纳入RISC(Denli和Hannon 2003年). 在许多情况下，miRNAs通过与靶mRNAs的3′端碱基配对和抑制翻译来实现沉默（参见图1). miRNA现在被认为是植物和动物发育的关键调节因子。确定目标基因和全方位的行动是密集研究的领域(赖2003;巴特尔2004).

直到2002年，RNAi/PTGS和miRNA是RNA介导的基因沉默研究最活跃的方面。然而，下一个重大进展突然将注意力转向了RNA引导的基因组修改。到2001年，从事RNA-定向DNA甲基化和TGS研究的植物科学家已经证明了对加工成短RNA的dsRNAs的需求，加强了与PTGS的机械联系(Mette等人，2000年;Sijen等人，2001年). 这确立了RNA引导的基因组修改的原则，但这一过程的普遍性尚不确定，因为并非所有生物体都将其DNA甲基化。随着2002年在裂变酵母中发现RNA诱导的异染色质组装体，人们广泛接受了这一说法(霍尔等人，2002年;Volpe等人，2002年). 这种沉默途径利用Dicer和其他RNAi成分产生的短RNA来指导DNA相关蛋白（组蛋白）的甲基化，从而产生浓缩的、转录沉默的染色体区域（异染色质）（见图1). 该途径的靶点包括着丝粒，着丝粒对正常染色体分离至关重要。在植物中发现了依赖RNAi的异染色质途径(Zilberman等人，2003年)和果蝇属(Pal-Badra等人，2004年)并且可能代表了创建浓缩、沉默染色体域的一般方法。

植物的更多经验

植物科学家可以在RNA介导的基因沉默方面创造其他“第一”。系统性沉默是指沉默信号（短RNA或dsRNA）从一个细胞移动到另一个细胞，并通过血管系统诱导远处的沉默，1997年首次在植物中发现(Palauqui等人，1997年;Voinnet和Baulcombe 1997年)后来变成了蠕虫(Fire等人，1998年)，虽然尚未加入果蝇属或哺乳动物。1998年，植物病毒学家发现了通过解除基于PTGS的抗病毒防御机制来抑制沉默的病毒蛋白(Anandalakshmi等人，1998年;Béclin等人，1998年;Brigneti等人，1998年;Kasschau和Carrington 1998年). 其中之一是tombusvirus的p19蛋白，它作为一个大小选择性的卡尺，从沉默机器中隔离短RNA(Vargason等人，2003年). 最近的一项研究表明，动物病毒编码RNA介导沉默的抑制因子(Li等人，2004年).

虽然RNA-介导的基因沉默途径在进化上是保守的，但在不同的生物体中有不同的表达。例如，植物拟南芥与哺乳动物和蠕虫不同，它们的基因组只编码一个Dicer蛋白(Schauer等人，2002年). RDR系列也在拟南芥以包括至少三个活动成员。一个重要的目标是确定家庭成员的个人职能。以前的研究拟南芥已经证明DCL1是加工对植物发育重要的miRNA前体所必需的(Park等人，2002年;Reinhart等人，2002年)，但不适用于RNAi中活跃的siRNAs(Finnegan等人，2003年). 论文作者谢等人（2004）在本期PLoS生物学描述了DCL2、DCL3和RDR2的不同功能。核型小分子DCL3与RDR2作用产生短RNA，引起DNA和组蛋白修饰；DCL2在细胞浆中产生抗病毒防御活性的短RNA。这项研究很好地说明了RNA沉默成分如何在植物中多样化以执行特殊功能。

分子生物学家通过识别小RNA作为基因沉默剂，在整个细胞的多个水平上发挥作用，创造了真核基因调控的新范式。植物科学家在RNA介导的沉默研究中发挥了重要作用。他们成功的工具是早期能够生产大量转基因植物，这显示了丰富多样的基因沉默现象，易于分析。农业生物技术产业鼓励寻找稳定转基因表达的方法，并使用转基因方法调节植物基因表达和基因工程病毒抗性。如牵牛花共抑制实验所示，非必需的植物色素提供了显著的视觉标记，生动地揭示了基因沉默。基因沉默研究的历史再次表明，植物为阐明一般生物学原理提供了杰出的实验系统。

致谢

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脚注

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