Ras和Gpa2介导酵母冗余葡萄糖信号通路的一个分支

冗余信号通路控制葡萄糖调节基因

为了分析葡萄糖添加和cAMP诱导的转录反应模式，我们使用分区聚类算法根据基因在所有32个分析样本中的行为对基因进行分组(Heyer等人，1999年). 在聚类之前，通过从每个值中减去该基因在所有实验中的平均表达并除以表达值的标准偏差，对32个样本中每个基因的表达水平进行归一化。这个过程强调每个基因在实验中的反应模式，而不是反应的绝对水平。这一过程产生了144个集群，每个集群的成员从7个到506个不等。通过层次聚类(Eisen等人，1998年)根据模式的相似性，这些簇被进一步组织成组，产生了八个主要类，在实验过程中在某些方面表现出显著的变化。这些类别包括大约50%的所有基因，总结如下表1，相应的表达式模式如所示图2。中提供了每个类别中的基因列表表S3.

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图2

簇状基因的表达模式

图表显示了下列类别（罗马数字）中基因的表达模式表1，按中所述进行了集群材料和方法。每一行代表该集群中所有基因在所示菌株和条件下的时间进程（1小时内间隔20分钟）中的平均表达水平。通过减去该基因在所有条件下的平均表达水平并除以该基因的标准偏差，对所有32种检测条件下每个基因的绝对强度值进行标准化。因此，表达式值(年-轴单位）表示为在整个实验组中每个时间点与每个基因平均表达值的标准偏差。误差条表示集群中所有基因在指定时间点的表达值的标准偏差。

缩写：Wt+Glu，向菌株Y2864添加葡萄糖；Wt+Gal，向菌株Y2864添加半乳糖；RAS2系统*+Gal，向菌株Y2866添加半乳糖；通用程序A2*+Gal，向菌株Y2876添加半乳糖；tpk-w公司+向菌株Y2872添加葡萄糖。

表1

葡萄糖反应和Ras激活对基因簇的功能富集

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按照材料和方法中的描述，对来自32个实验的基因表达数据进行聚类，这些数据代表了五个菌株的时间进程数据。显示了每个超簇（类）中的基因数量，以及菌株Y2864（野生型[WT]）、Y2866（Ras*）、Y876（Gpa2*）和Y2872中该组成员的表达模式(tpk-w公司)添加葡萄糖（Glu）或半乳糖（Gal）后表明（I，诱导；R，抑制；-，无变化）。在功能关联下参与所示过程的基因在所示类别中富集。该类别和基因组中存在的功能类别中的基因数量以及−log₁₀P表示富集是随机的。使用SGD网站中的基因本体论（GO）术语查找器确定功能富集和logP值(http://www.yeastgenome.org/)

一般来说，添加葡萄糖会使基因的表达发生快速变化，而这些变化保持不变，或者在以后的时间会回到初始状态。我们对这种行为的解释表明，在20分钟时间点看到的初始反应通常代表基因对添加葡萄糖引发的信号的反应。随后与初始反应的偏差表示信号传递过程的适应或细胞代谢变化导致的表达的重新调整。相反，响应Ras2或Gpa2的激活的基因表达通常显示出20分钟的滞后，随后在实验的剩余时间内表达单调变化。这与预期一致，即只有在转录和翻译新的激活蛋白后才能看到Ras2或Gpa2的诱导作用。此外，由于在这些条件下，代谢没有发生显著变化，因此表达的变化完全是由于信号通路的激活。这强化了细胞对葡萄糖的初始反应是一种信号反应的概念，因为在Ras2或Gpa2激活后，这种单调变化的模式通常与这些基因对葡萄糖添加的初始反应相匹配。

如果由葡萄糖和Ras2活化诱导的基因仅通过Ras2–Gpa2–cAMP途径由葡萄糖调节，那么我们预计葡萄糖诱导的转录改变将在tpk-w公司应变。这是受葡萄糖影响的基因子集（II类和VI类）的情况，表明存在仅依赖于Ras信号通路的葡萄糖信号通路。相反，野生型和tpk-w公司但不受Ras2或Gpa2激活的影响，表明存在Ras2非依赖性葡萄糖信号通路（III类）。然而，绝大多数对葡萄糖有反应的基因都受到Ras2激活的影响，并且在tpk-w公司背景（I类和V类）。这表明大多数葡萄糖应答基因受冗余路径调节，其中一个需要Ras2，另一个（s）是Ras2独立的。因此，葡萄糖添加的主要转录反应在Ras2激活之前发散，但在基因激活之前收敛。这将在讨论中进一步阐述。

Ras和Gpa2信号仅通过PKA

为了评估PKA介导Ras2激活对转录的影响程度，我们检测了Ras2活化后的表达模式tpk-w公司与Tpk中的细胞相比⁺细胞。对于那些Ras2通过PKA诱导或抑制的基因tpk-w公司人们预计突变会消除这种反应。在图3我们绘制了添加半乳糖后60分钟每个基因表达的变化镀锌10第页-RAS2系统 ^第19版 tpk-w公司菌株与添加半乳糖60分钟后每个基因表达的变化镀锌10第页-RAS2系统 ^第19版应变。很明显，几乎所有的基因都不能对Ras2的激活做出反应tpk-w公司背景。在本实验中，789个基因（在分析的4037个基因中）的表达在向镀锌10第页-RAS2系统 ^第19版菌株中只有16（2%）也通过激活Ras2表达增加tpk-w公司背景。类似地，在野生型背景下Ras2激活后，1121个基因的表达减少了2倍以上，其中只有5个（0.5%）基因在tpk-w公司背景。使用cDNA微阵列和候选基因的直接Northern印迹分析重复这些实验，未能证实在tpk-w公司背景（未显示数据）。因此，我们得出结论，Ras2激活的整个转录反应是通过PKA介导的。

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图3

Ras和Gpa2仅通过PKA影响转录

Y2873菌株基因的（顶部）诱导率（60分钟时的mRNA水平/0分钟时的m2水平）(年-轴）与菌株Y2866中相同基因的诱导比（60分钟时的mRNA水平/0分钟时的m RNA水平）。值以日志形式显示₂.

（底部）应变Y2897的相似分析(年-轴）与应变Y2876。

Gpa2活化的结果相似。如上所述，Gpa2激活的反应不如Ras2激活的反应强烈，如图3，Gpa2诱导反应的衰减tpk-w公司拉伤不像Ras2那样明显。在这项实验中，444个基因的表达在野生型背景下因Gpa2激活而增加2倍或更多，其中75个（17%）也在tpk-w公司背景。同样，在表达减少2倍或更多的831个基因中，24个（3%）也在tpk-w公司背景。然而，使用cDNA微阵列对该实验进行多次重复，未能发现Gpa2在转录中持续改变的任何基因tpk-w公司背景。因此，与Ras一样，绝大多数（如果不是全部）Gpa2-responsive基因仅通过PKA调节。

有效的葡萄糖反应需要Gpr1

GPR1级编码一种结构上与七跨膜相关的蛋白质，即G蛋白偶联受体，生化和遗传证据均表明，该蛋白质调节Gpa2活性以响应葡萄糖(Xue等人，1998;Kraakman等人，1999年;Lorenz等人，2000年). 因此，为了评估Gpr1在细胞对葡萄糖的转录反应中的作用，我们检测了等基因的全球转录模式GPR1级和gpr1型将葡萄糖添加到甘油生长细胞后，每隔20分钟进行菌株培养。此外，为了评估通过PKA处理Gpr1介导的信号的程度，我们对同基因进行了类似的时间进程实验GPR1总分-w和gpr1 tpk-w菌株。全套数据可在表S2在这两个实验中，我们发现，在gpr1型相对于GPR1级应变。例如，对于那些在添加葡萄糖后其表达变化超过50%的基因GPR1 TPK系列应变，平均诱导或抑制比gpr1型应变约为GPR1级应变。标准化数据的K-means聚类证实了这一观点(图4). 例如，簇1包含470个与核糖体生物合成相关的高度富集基因，在GPR1 TPK系列添加葡萄糖后产生菌株，但在gpr1 TPK1应变。簇8中的基因也观察到类似的结果，簇4和簇6中的基因诱导在gpr1型应变与GPR1级应变。因此，这些结果与Gpr1参与葡萄糖信号传导的假设一致，但不是该信号传导的唯一介质。

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图4

Gpr1缺失会降低葡萄糖反应

图表显示了在向指示菌株添加葡萄糖后，基于基因表达的时间过程变化（1小时内20分钟的间隔）的基因簇表达模式(GPR1级，2009年2月；gpr1型，Y3159；GPR1总分-w，Y2857；gpr1 tpk-w，Y3077）。对于聚类，通过减去该基因在所有条件下的平均表达水平并除以该基因的标准偏差，对所有12种检测条件下每个基因的绝对强度值进行标准化，但绘制的表达值(年-轴单位）表示表达式绝对强度的平均值（转换为对数₂)在指定的时间点集群中的所有基因。误差条表示集群中所有基因在指定时间点的表达值的标准偏差。每个簇和任何高富集功能组（包括第页值）。

来自tpk-w公司菌株提示Gpr1可能影响多种葡萄糖信号通路。如果Gpr1启动的信号仅通过PKA传递，那么葡萄糖添加到gpr1 tpk-w应变基本上与GPR1总分-w应变。而表达模式之间的相关性gpr1 tpk-w和GPR1总分-w(第页=0.73）高于gpr1 TPK和GPR1 TPK系列(第页=0.65）gpr1 tpk-w和GPR1 tpk-w，正如聚类分析所强调的，它们相似但显著不同（尤其是在聚类2、4、6和7中）。因此，这些结果可能表明Gpr1影响PKA依赖性和PKA非依赖性信号通路。或者gpr1基因和GPR1级在实验开始时，菌株可能会对葡萄糖产生不同的反应。这个问题可以通过适当的条件等位基因来解决GPR1级和第三方物流.

Ras、Gpa2和葡萄糖在物质积累中的诱导基因以及在呼吸和线粒体功能中的抑制基因

我们以两种不同但相关的方式探讨了葡萄糖和Ras2调节基因的性质。首先，我们询问了那些被注释为执行相关功能的基因在一组实验中的平均表现。第二，我们已经确定了在任何共表达基因簇中，执行共同功能的基因是否显著过度表达。这两种方法给出的结果基本相同。

在图5，我们给出了与指示功能相关的所有基因的平均表达水平（由慕尼黑蛋白质序列信息中心[MIPS]程序注释）相对于野生型菌株时间0的表达水平。显而易见，葡萄糖和Ras2或Gpa2的激活上调了翻译所需的基因。这包括RNA聚合酶I和III亚单位、细胞质tRNA合成酶、rRNA和tRNA加工酶、翻译起始因子的基因，以及核糖体蛋白（程度稍轻）的基因。类似地，这些功能类别的基因在那些簇中高度富集，在这些簇中，葡萄糖添加到野生型或tpk-w公司细胞或激活Ras2或Gpa2后（参见表1). 因此，葡萄糖添加后转录重组的主要部分是为了增强翻译机制。然而，令人惊讶的是，这不仅是由新陈代谢增加引起的，至少部分是由对信号电路的直接反应引起的，而信号电路至少部分由Ras2介导。

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图5

葡萄糖和Ras诱导的表达变化的功能分析

按右侧所列功能类别分组的基因在1小时内的平均表达水平以颜色表示（红色，诱导；绿色，抑制；黄色，不变）。数值与添加葡萄糖前菌株Y2864的表达水平有关。功能分类目录从MIPS获得，网址为http://mips.gsf.de/proj/yeast/CYGD/db/index.html。使用矢量大小比进行功能群分析(Kuruvilla等人，2002年). 计算机源代码派生自http://www-schreiber.chem.harvard.edu.菌株：Y2864（WT）、Y2872（tpk-w），Y2866年（RAS2*），2873日元（RAS2*tpk-w），2876日元（GPA2*），2897日元（GPA2*tpk-w）.

另一方面，参与氧化呼吸的基因，包括TCA循环的组成部分、氧化磷酸化装置和泛醌（CoQ）合成，以及葡萄糖异生所需的所有基因，都受到葡萄糖添加和Ras或Gpa2激活的显著下调。这些基因的功能类别在这类共表达基因中显著过度表达，这些共表达基因在所有测试条件下均下调（V类）。因此，Ras2依赖性和Ras2非依赖性抑制途径冗余地调节与从呼吸转化为发酵相关的重组。

几组基因似乎仅通过PKA依赖性途径受葡萄糖调节。这些基因在野生型菌株中被Ras2或Gpa2和葡萄糖抑制，但在tpk-w公司菌株（VI类），包括参与碳水化合物储存（海藻糖和糖原）和在很大程度上参与泛醌合成的菌株。许多基因表现出葡萄糖以完全依赖Ras2的方式诱导，包括参与核糖体生物生成的基因。

反过来，许多基因表现出葡萄糖以完全依赖Ras的方式诱导。如中所述图2与其他诱导类中基因的表达模式不同，III类成员的表达在添加葡萄糖后单调增加，而其他诱导类的基因表达在添加糖后最初快速增加，随后立即稳定或降低。这可能表明，这些基因因葡萄糖添加引起的代谢变化或生长加速而上调。参与DNA复制的基因在这一类别中的富集与这一假设相一致。

Ras和Gpa信号仅通过PKA

我们使用上位性分析来确定葡萄糖信号通路Ras2和Gpa2分支的功能拓扑。也就是说，我们研究了在缺乏cAMP反应PKA的背景下激活Ras2或Gpa2的转录结果。由于这个实验的读数是细胞的整个转录组，我们可以确定是否有任何基因是由Ras以不依赖PKA的方式调控的，而无需事先知道该基因可能是什么。我们的结果表明，Ras2和Gpa2的所有转录效应都是由PKA介导的。先前的研究表明，在某些菌株中，Ras2可以激活丝状生长MAP激酶途径(Mosch等人，1996年,1999). 我们的结果清楚地表明，在所述条件下生长的受试菌株中，Ras和MAP激酶途径之间不存在这种联系。此外，对二倍体∑1278菌株进行的相同上位性实验产生了相同的结果（数据未显示）。因此，虽然Ras对酵母细胞具有PKA非依赖性效应，但Ras的所有转录效应都是通过PKA进行的。

大量信息表明，与Ras2一样，激活的Gpa2刺激腺苷酸环化酶，导致细胞cAMP水平升高(Kubler等人，1997年;洛伦茨和海特曼1997)尽管最近的证据表明Gpa2可能直接激活PKA（J.P.Hirsch，个人通信）。迄今为止的遗传上位性数据表明，为了激活PKA，Ras2和Gpa2蛋白在冗余的平行通路中发挥作用，而不是在同一通路中的顺序步骤中(Xue等人，1998). 然而，PKA的激活是否是Gpa2的唯一活性尚不清楚。我们的结果表明，与Ras2一样，Gpa2的所有转录效应都是由PKA介导的。与这一结论一致，我们没有检测到任何一组基因的表达因Gpa2的激活而改变，也没有类似地因Ras2的激活而改变。我们确实注意到，Gpa2激活后的转录反应强度约为Ras激活后的一半，这表明虽然这两种蛋白质的功能相似，但它们在数量上具有不同的影响。

细胞生长

细胞在YEPD平板上划线，并在30°C下生长2–3天。新鲜菌落接种到添加3%甘油作为唯一碳源的合成完全培养基（SC）中。细胞在30°C下生长，并在200 rpm下摇晃至OD₆₀₀0.25（出芽指数，约20%），此时取一等分细胞作为时间0对照。然后在剩余培养物中添加2%的葡萄糖或半乳糖，并在添加糖后20、40和60分钟收集等分（40 ml）的细胞。将细胞与100 ml预冷冻水混合，并在4°C下以2500 rpm离心3分钟，快速旋转。

RNA分离、标记和杂交

细胞颗粒在TRI试剂（美国俄亥俄州辛辛那提市分子研究中心）中通过玻璃珠旋转3分钟进行溶解。在室温下培养5分钟后，每1 ml TRI试剂添加0.2 ml三氯甲烷，并与匀浆充分混合。在4°C下以14000 rpm离心15 min后，去除上层水相并用等量异丙醇沉淀。RNA颗粒用75%乙醇洗涤，空气干燥，并溶解在水中。mRNA从总RNA中用寡特克斯进行纯化（美国加利福尼亚州巴伦西亚的齐亚根）。

使用HPLC-纯化的T7-（dT）从mRNA合成第一链cDNA₂₄引物（Genset，San Diego，California，United States）和SuperScript II RT（Invitrogen）。利用Invitrogen的DNA连接酶（10U）、DNA聚合酶I（40U）和核糖核酸酶H（2U）合成了二级cDNA。用BioArray HighYield RNA转录物标记试剂盒（Enzo Diagnostics，Farmingdale，New York，United States）制备生物素标记的cRNA，并用RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）纯化。将cRNA片段化，与对照cRNA混合物混合，并与酵母基因组S98阵列（Affymetrix，Santa Clara，California，United States）杂交16小时，在45°C的烤箱中以60 rpm的转速旋转。使用GeneChip Fluidics工作站400（Affymetrix）对探针阵列进行清洗和染色，并使用Agilent GeneArray扫描仪（Affmetrix）在570 nm处进行扫描。

对于每个实验，我们检查了多个时间点，对于重要感兴趣的样本，我们进行了三次实验。对于初始分析，我们使用MicroArray Suite 5.0软件（Affymetrix）来确定基因的杂交信号是否可靠，并在我们的分析中仅纳入那些被判断存在的测量值，这些测量值通常包括任何一个样本中90%以上的基因测量值，在所有实验中，75%以上的基因产生了可靠的值。我们还从初步分析中排除了那些在加仑1添加半乳糖的菌株（25-30个基因，取决于实验）。所有实验均归一化为相同的总信号强度。所有实验的数据都可以从表中获得S1（第一阶段）,S2系列、和第3章或在http://www.molbio.princeton.edu/labs/broach/microarrary.htm.

计算方法

我们感谢Katrin Düvel博士对手稿的深思熟虑的评论，感谢Kara Dolinski博士对GO术语查找器的帮助。YW感谢新泽西癌症委员会的博士后研究金支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）向JRB拨款CA41086、美国国家科学基金会（National Science Foundation）CAREER拨款MCB-0133750和美国国防高级研究计划局（Defense Advanced Research Projects Agency）向ST拨款N66001-02-1-8929的支持。