跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
《公共科学图书馆·生物》。2004年5月；2（5）：e110。
2004年5月11日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pbio.0020110
预防性维修识别码：项目经理406388
PMID：15138496

Mre11将线性DNA片段组装成DNA损伤信号复合物

文森佐·科斯坦佐，1 坦尼亚·鲍尔，2 马克斯·戈特斯曼，三和让·戈蒂埃1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

Mre11/Rad50/Nbs1复合物（MRN）对于抑制DNA复制过程中双链断裂（DSB）的产生至关重要。MRN也在对DNA损伤产生的DSB的反应中发挥作用。中的低形态突变Mre11型（导致共济失调-扩张样疾病[ATLD]）和共济失调/扩张样突变的突变(自动取款机)该基因导致处理受损DNA的缺陷以及类似的临床和细胞表型。使用爪蟾鸡蛋提取物，我们设计了一个简单的检测来确定Mre11的生物化学。MRN是有效激活DSBs诱导的DNA损伤反应所必需的。我们分离出一种高分子量DNA损伤信号复合物，包括MRN、受损DNA分子和激活的ATM。络合物的形成部分依赖于锌2+并且需要一个完整的Mre11 C末端结构域，该结构域在一些ATLD患者中被删除。在复制过程中，ATLD截断仍然可以扮演Mre11的角色。我们的工作证明了Mre11在组装DNA损伤信号中心中的作用，这让人想起辐射诱导的病灶。它还为共济失调-扩张症（a-T）和ATLD之间的相似性提供了分子解释。

细胞对DNA双链断裂的缺陷反应与几种癌前病变有关。特定缺陷影响大蛋白复合物的形成，该复合物涉及几个关键蛋白质

介绍

细胞对DNA损伤的反应需要协调激活细胞周期检查点和DNA修复(Zhou和Elledge 2000). 未能阻止S期进入以响应受损的DNA或修复DNA会导致基因组不稳定，这是癌细胞的特征。DNA双链断裂（DSB）对细胞尤其有害；如果没有修复，DSB会产生非整倍体和染色体易位。DSB激活一个信号通路网络，将损伤的感知和修复与细胞周期阻滞相协调。DSB触发的主要信号通路涉及共济失调-扩张-突变（ATM）蛋白激酶(周和Elledge 2000). ATM是一种与PI3激酶家族相关的丝氨酸-苏氨酸激酶。DSB通过促进自身磷酸化激活ATM(Bakkenist和Kastan 2003). 激活的ATM磷酸化参与DNA修复、细胞周期阻滞和凋亡的蛋白质底物。

通过ATM磷酸化Nbs1对S相检查点至关重要(Gatei等人，2000年;Lim等人，2000年;Zhao等人，2000年). Nbs1与Mre11和Rad50（MRN）形成三聚体复合物，这是通过同源重组修复DSB所需的(哈伯1998;D'Mours和Jackson 2002;Symington 2003年). 这三种蛋白质对脊椎动物胚胎发育和细胞生长也至关重要(Luo等人，1999年;Yamaguchi-Iwai等人，1999年;Zhu等人，2001年). MRN防止DNA复制过程中DSB的积累(Costanzo等人，2001年).

隐性遗传疾病共济失调-扩张症（A-T）患者的ATM功能有缺陷。A-T的特征是小脑变性、免疫缺陷、辐射敏感性、染色体不稳定和易患癌症(Gatti等人，2001年).

低形态突变Mre11型和编号1分别引起A-T样疾病（ATLD）和奈梅亨破裂综合征（NBS）(Digweed等人，1999年;Stewart等人，1999年;Tauchi等人，2002年). A-T和ATLD的临床表现难以区分。NBS患者表现出A-T和ATLD症状，此外还有小头畸形和精神缺陷(Tauchi等人，2002年). 这三种疾病都有相似的细胞表型。突变细胞对DSBs没有适当的反应，并表现出染色体异常、对电离辐射过敏、抗辐射DNA合成和S期检查点缺陷(Shiloh和Kastan 2001). 这些相似性强烈表明ATM和MRN在一个共同的信号通路中发挥作用。然而，这些蛋白质之间的分子联系尚待确定。

Mre11结合DNA，是一种3′-5′核酸外切酶和一种内切酶，可切割发夹状DNA结构(Paull and Gellert 1999年). Rad50属于染色体结构维持蛋白（SMC）家族。Rad50包含由长线圈域分隔的C端和N端Walker A和B域(de Jager等人，2001年;Hopfner等人，2002年). 线圈结构域的分子内组装将Walker A和B基序结合在一起，生成功能性核苷酸结合模块。位于Rad50螺旋线圈底部的锌结合基序（CXXC）或“锌钩”通过四个半胱氨酸残基与锌离子的配位调节Rad50二聚化(Hopfner等人，2002年).

Rad50二聚体与两个Mre11分子结合，形成具有增强核酸酶活性的稳定四聚体复合物(Trujillo和Sung 2001). 扫描力显微镜显示hRad50/hMre11复合物系链线性双链DNA分子(de Jager等人，2001年). 基于这些观察结果，提出了一个模型，其中Mre11/Rad50复合物桥接断裂的DNA末端或姐妹染色单体（van den Bosch 2003）。

在酵母菌和哺乳动物细胞中，DSB刺激形成被称为辐射诱导焦点（IRIF）的特定核结构。IRIF被认为起源于DSB部位的染色质修饰，如H2AX磷酸化，随后是信号和修复因子的补充。MRN定位于DSB，与H2AX磷酸化无关，对IRIF的形成和对DNA损伤的后续反应至关重要(Petrini和Stracker 2003). 因此，有突变的细胞Mre11型或编号1有效地形成IRIF。在携带缺陷Mre11型，ATM激活被禁止。此外，ATM无法定位到缺少功能MRN的小区中的DSB站点(Uziel等人，2003年). 综上所述，这些结果表明MRN在DNA损伤部位的功能性信号复合物组装中起着早期和重要的作用。此外，他们将MRN置于ATM上游的DNA损伤信号通路中。

无细胞提取物爪蟾卵子重述由DNA损伤触发的信号通路，并有助于揭示自动取款机和Mre11型(Costanzo等人，2000年，2001). 使用这个系统，我们在下面展示了片段DNA与蛋白质组装成富含活性ATM和MRN的大分子结构。它们的组装需要MRN而不是ATM。截断形式的Mre11型与ATLD相关的不支持DNA-蛋白质复合物组装或DSB诱导的ATM激活。这项工作提供了ATM和MRN之间的直接分子联系，可以解释a-T和ATLD之间的相似性。

结果

DNA双链断裂反应的快速测定

将片段DNA添加到爪蟾鸡蛋提取物触发ATM信号通路(Costanzo等人，2000年). 我们之前通过测量DNA片段处理的提取物中依赖ATM的DNA复制块来证明这种反应(Costanzo等人，2000年). 我们现在描述了一种快速检测DSB反应性蛋白激酶激活的方法，并评估ATM和相关蛋白激酶的作用。组蛋白H2AX是DSB活化蛋白激酶的一种特性良好的底物，在体内通过ATM和共济失调-扩张相关蛋白（ATR）在丝氨酸139处磷酸化(Rogakou等人，1998年;缅甸等，2001年;Costanzo等人，2001年;Ward和Chen 2001). 我们使用小鼠H2AX的C末端肽（PAVGKKAS公司134质量保证S公司139QEY）作为报告底物来监测对DSBs的反应。该肽包含ATM或ATR的两个假定SQ磷酸化位点：丝氨酸134和139。为了测试DSB激活的激酶的特异性，我们合成了四种肽：丝氨酸134（S134A）、丝氨酸139（S139A）和丝氨酸134和139（S234A/S139A。

间期提取物与片段DNA孵育30分钟显著增强H2AX肽的磷酸化(图1A） ●●●●。添加片段DNA后5分钟即可检测到磷酸化H2AX肽（数据未显示）。S134A肽被磷酸化至与野生型肽相当的水平，而S139A和S134/139A肽未被修饰。因此，无细胞提取物中S139对DSB的磷酸化反应模拟了体内情况(Rogakou等人，1998年;缅甸等，2001年;Costanzo等人，2001年;Ward和Chen 2001).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pbio.0020110.g001.jpg
对DSB的响应需要功能MRN，Mre11–ATLD将基本和非基本Mre11功能分开

（A） 对DSB反应的蛋白激酶活性非洲爪蟾鸡蛋提取物通过加入32来自γ的P-32在存在（加DSB）或不存在（减DSB）片段DNA的情况下，将P-ATP转化为H2AX衍生肽。标签：野生型，含有丝氨酸134和丝氨酸139的H2AX底物肽；S134A，H2AX底物肽，丝氨酸134替换为丙氨酸；S139A，H2AX底物肽，丝氨酸139替换为丙氨酸；S134A/S139A，将两种丝氨酸替换为丙氨酸的H2AX底物肽。

（B） 与线性DNA以50 ng/μl（相当于4.5×10）孵育的提取物10用H2AX肽在缓冲液（对照）、ATM中和抗体（ATM Ab）、ATR中和抗体（ATR Ab），ATM和ATR中性抗体（ATM/ATR Abs），Ku70耗尽提取物（ATM/ATR Abs；Ku耗尽）中的ATM和ATMR中和抗体，5 mM咖啡因（咖啡因）存在下测定breaks/μl）。

（C） 在0、5、10、25和50 ng/μl线性DNA存在的情况下，在对照提取物（填充钻石）、模拟缺失提取物（开放钻石）、Mre11-缺失提取物（开口方块）、添加500 nM重组MRN（填充方块）、，或补充500 nM MRN-ATLD1/2（填充三角形）的Mre11-缺失提取物。

（D） 通过TUNEL法监测DNA复制过程中DSB的积累。从对照提取物（条纹）、Mre11缺失提取物（圆点）、补充MRN（钻石）的Mre11耗尽提取物、补充MRN-ATLD1/2（灰色）或模拟缺失提取物（白色）中分离复制后细胞核。

接下来，我们监测了特定DNA损伤反应信号通路被抑制的提取物中H2AX肽的磷酸化。X-ATM和X-ATR中和抗体分别用于消除ATM和ATR依赖性信号。我们之前证明，这些抗体完全抑制提取物中ATM和ATR依赖的检查点(Costanzo等人，2000年，2003). 经X-ATM或X-ATR抗体处理的提取物中H2AX肽磷酸化显著降低。抑制ATR和ATM进一步将H2AX肽磷酸化降低至对照水平的20%(图1B、 第4列）。通过消耗Ku70抑制DNA-PK并没有进一步降低ATM/ATR抑制提取物中H2AX肽的磷酸化。最后，咖啡因完全消除了H2AX肽磷酸化(图1B、 第6列）。我们得出结论，DSB在粗提物中诱导的大多数H2AX磷酸化都依赖于ATM和ATR。

ATM激活需要功能MRN

使用携带低形态突变的细胞进行实验编号1或Mre11型(Carney等人，1998年;Varon等人，1998年;Stewart等人，1999年;Petrini和Stracker 2003)表明MRN在感应DSB触发的信号方面也起作用。然而，因为Mre11型和编号1是必需基因(Yamaguchi-Iwai等人，1999年;Zhu等人，2001年;Tauchi等人，2002年)Mre11总失活对DNA损伤反应的影响尚不明确。我们询问在我们的系统中是否需要MRN来进行H2AX肽磷酸化的DSB依赖性激活。我们之前已经确定Mre11可以从提取物中定量耗尽(Costanzo等人，2001年).图1C表明，Mre11提取物的消耗消除了对含有DSB的DNA的反应(图1C、 开放方块）。重组人MRN恢复了Mre11-缺失提取物中的DNA损伤反应(图1C、 填充方块）。

ATLD是一种以DNA损伤反应失败为特征的综合征，由Mre11的低形态突变引起(Stewart等人，1999年). 与野生型蛋白质相比，MRN含有一个突变的Mre11，该突变缺乏C末端DNA结合域（MRN-ATLD1/2）(Stewart等人，1999年;Lee等人，2003年)没有恢复Mre11-耗尽提取物的活性(图1C、 填充三角形）。

在较高的片段DNA浓度（大于或等于100 ng/μl）下，H2AX肽磷酸化部分独立于ATM和Mre11。这种磷酸化对香兰素敏感，香兰素是DNA-PK的一种特异性抑制剂(杜兰特和卡兰2003)和至Ku损耗（数据未显示）。

与它在DSB检查点反应中的不活动性相比，MRN-ATLD1/2可以实现MRN在防止DNA复制过程中断裂累积方面的基本功能。图1D显示了检测DNA末端的TUNEL分析。正如我们之前报告的那样(Costanzo等人，2001年)，Mre11-缺失提取物中复制的染色体DNA积累了DSB。将纯化的重组MRN添加到耗尽的提取物中，可以在很大程度上防止DNA断裂。MRN-ATLD1/2在支持正常DNA复制方面与野生型MRN一样有效。

这些结果表明，激活DSB信号通路需要MRN，而Mre11的C末端区域在这一激活中起着关键作用。

线性DNA片段触发依赖Mre11的大DNA-蛋白质复合物组装

扫描力显微镜数据(de Jager等人，2001年)表明Mre11–Rad50优先与断裂的DNA末端结合，这意味着与线性DNA的直接相互作用对MRN功能至关重要。为了研究Mre11和受损DNA之间的相互作用，间期提取物与32P标记的1 kb线性双链DNA分子，应用于BioGel A15m柱。这种大孔凝胶过滤树脂包括大多数蛋白质和小DNA片段，但不包括大于1.5×10的蛋白质-DNA复合物7kDa（Yuzakhov等人，1999年）。当放射标记DNA的浓度为50 ng/μl（相当于4.5×1010ends/μl）在无提取物的情况下用于柱(图2A） 或在孵育前使用提取物（数据未显示），在包含的体积内恢复所有放射性。相反，当片段DNA在色谱前与提取物孵育时，放射性标记的DNA分解成两个峰(图2B） ●●●●。大部分DNA仍在包含的体积中回收（20–30部分）。然而，在排除的体积中出现了一个单独的DNA峰，相当于总DNA负载的3%-5%（馏分9-12）。相反，标记的双链环状质粒DNA在孵育后并没有组装成DNA-蛋白质复合物；所有标记的DNA都被回收到包含的体积中(图2C） ●●●●。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pbio.0020110.g002.jpg
DNA-蛋白质复合物组装要求

α洗脱曲线-32从BioGel A15m色谱柱中P-dATP-标记1 kb线性DNA。装填后，收集1-31组分，并在闪烁计数器中计算放射性。

（A–E）完整的洗脱曲线。（A） 仅线性DNA。（B） 线性DNA在22°C的提取物中孵育2小时。（C） α-32P-dATP-标记的圆形质粒在22°C的提取物中培养2 h。（D） 线性DNA在加载前立即用1 mg/ml蛋白酶K处理的提取物培养。（E） 线性DNA在Mre11-缺失提取物中培养。

（F和G）排除体积（分数6-14）。（F） 在以下提取物中培养的线性DNA：Mre11-缺失提取物（开放三角形）、补充500 nM MRN（填充三角形）的Mre11--缺失提取物、补充500 nM MRN-ATLD1/2（开放方形）的Mr11-缺失萃取物或补充MRN的对照提取物（填充方形）。（G） 线性DNA在以下提取物中培养：对照提取物（填充圆圈）、用5 mM咖啡因处理的提取物（开放圆圈）和用100μM TPEN处理的提取物。

排除体积中的峰值代表在提取物中组装的大型DNA-蛋白质复合物，因为在色谱前用蛋白酶K处理提取物即可消除该复合物(图2D） ●●●●。注意，洗脱缓冲液中含有洗涤剂，排除了可能的膜聚集。

为了确定Mre11是否在组装DNA-蛋白质复合物中发挥作用，我们将标记的DNA培养在Mre11缺失的提取物中(图2E） ●●●●。在没有Mre11的情况下，排除的体积中几乎没有放射性标签。将重组人MRN添加到耗尽的提取物中，恢复了高分子量DNA-蛋白质复合物的峰值(图2F、 填充的三角形）。因此，我们得出结论，DNA-蛋白质复合物的组装需要Mre11。此外，在未完全提取液中添加MRN会增加排除体积中的DNA数量(图2F、 填充的方块），表明MRN在这些提取物中的限制。MRN-ATLD1/2不能恢复Mre11缺失提取物中DNA-蛋白质复合物的形成(图2F、 开口正方形），表明复杂装配需要完整的Mre11 C端子域。

Rad50蛋白通过Zn形成分子内线圈相互作用和分子间相互作用2+-四个半胱氨酸残基配位的螯合铰链区锌钩(Hopfner等人，2002年). 添加TPEN，一种锌专用螯合剂2+(Shumaker等人，1998年)，部分抑制DNA-蛋白质复合物的形成(图2G、 打开圆圈）。最后，咖啡因显著降低了排除峰中标记DNA的数量，但没有消除(图2G、 打开钻石）。这表明DNA-蛋白质复合物的组装部分独立于ATM/ATR。

MRN复合物是捆绑线性DNA分子的DNA-蛋白质复合物的一部分

先前的实验确定Mre11是组装DNA-蛋白质复合物所必需的。为了证明Mre11是这些复合物的组成部分，我们从色谱组分10和25中免疫沉淀Mre11，并测量32沉淀的P-DNA含量。我们在片段10中发现与MRN相关的标记DNA(图3A） 但不在分数25中，尽管该分数同时包含Mre11（参见图4A） 和32P-DNA。正如预期的那样，去除Mre11-的提取物层析后，排除组分的免疫沉淀物不包含标记的DNA。当将对照提取物中免疫沉淀的Mre11添加到Mre11贫化的提取物中时，我们再次在级分10中发现MRN–DNA复合物，但在级分25中没有发现(图3A） ●●●●。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pbio.0020110.g003.jpg
Mre11系带DSB-含DNA

（A） 对照组和处理过的提取物与α-32P-dATP标记DNA片段并加载到BioGel A15柱上。收集组分10和25，并与针对Mre11的多克隆抗体或蛋白A珠单独孵育。收集和清洗珠子，并在闪烁计数器中计算放射性。所示为对照提取物（条纹）、Mre11缺失提取物（圆点）或补充了从提取物中免疫沉淀的Mre11的Mre11-缺失提取物（钻石），以及单独用珠子培养的提取物（黑色）。

（B） 生物素化DNA片段与α混合-32P-dATP标记DNA片段并与各种提取物孵育。然后将提取物加载到BioGel A15柱上。收集组分10和25，并用链霉亲和素磁珠培养。收集和清洗珠子，并在闪烁计数器中计算放射性。显示的是对照提取物（条纹）、Mre11贫化提取物（点）、补充有500nM MRN的Mre11贫化提取物（菱形）和链亲和素珠（黑色）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pbio.0020110.g004.jpg
DNA-蛋白质复合物是含有活性Mre11和ATM的信号中心

（A） 洗脱组分的Western blot分析。分数显示在底部。在用片段化（加上DSB）或不带片段化DNA（减去DSB）培养的提取物层析后收集部分。对部分样品进行SDS-PAGE处理，并用抗Mre11、ATM和磷酸化ATM的多克隆抗体进行印迹。

（B） 分数10和25中ATM和ATR激酶的活性。将提取物与DNA片段孵育并应用于BioGel A15m柱。在缓冲液（浅灰色）、ATM中和抗体（检查）、ATR中和抗体（深灰色）、300μM香草醛（条纹）或5 mM咖啡因（黑色）存在的情况下，对对照提取物的组分10和组分25进行H2AX活性测定。

（C） 组分10和总提取物中ATM和ATR激酶的活性。对照提取物或补充有500 nM重组MRN的提取物与DSB孵育并加载到BioGel A15m柱上。在缓冲液（浅灰色）、ATM中和抗体（检查）、ATR中和抗体（深灰色）或5 mM咖啡因（黑色）存在的情况下，对总对照提取物和组分10的H2AX活性进行分析。

我们得出结论，MRN是DNA-蛋白质复合物的组成部分。

为了证明线性DNA分子与DNA-蛋白质复合物相连，我们将提取物与两组片段DNA孵育。相同序列的DNA分子32P标记或生物素化。正如预期的那样，放射性洗脱曲线与用单一种DNA分子观察到的曲线相同（数据未显示）。用聚乙二醇沉淀排除体积的分数10和包含体积的分数25，并用链霉亲和素磁珠亲和纯化生物素化DNA分子。这次化验的结果清楚地表明32在第10组分中，P-DNA与生物素化DNA相关，但在第25组分中不相关(图3B、 第1列和第5列）。正如预期的那样，这种关联依赖于Mre11。在缺乏Mre11的提取物中被废除，在补充有重组MRN的缺乏Mre11-的提取物中恢复(图3B、 第2列和第3列）。

含有Mre11的DNA-蛋白质复合物是信号中心

接下来，我们寻找DNA-蛋白质复合物和蛋白激酶激活之间的分子联系。我们监测了Mre11和ATM在上述色谱馏分中的分布和修饰。对对照提取物或与片段DNA孵育的提取物进行色谱分析，并对排除体积的分数9-12和包含体积的分数25-28进行聚乙二醇沉淀和处理，以进行Western blotting。在未经处理的对照提取物中，Mre11和ATM仅在包含的体积中回收。然而，在用线性DNA处理的提取物中，Mre11和ATM在包括和排除的部分中都存在(图4A、 顶部四个面板）。根据图像分析测定，相对于组分的总蛋白质含量，Mre11和ATM在排除组分中分别富集18倍和46倍。这证实了高分子量蛋白质-DNA复合物含有Mre11，并进一步证明了复合物中存在ATM。引人注目的是，DNA-蛋白质复合物中的Mre11是活性的磷酸化形式(Costanzo等人，2001年). 相反，所含馏分中的Mre11未被修改。

此外，使用能特异识别ATM活性形式的抗体（在相当于人类ATM 1981丝氨酸的丝氨酸上磷酸化；巴克尼斯和卡斯坦2003)，我们仅在排除的部分中检测到磷酸化ATM(图4A、 第三个面板）。

为了证实排除的峰富含活性ATM激酶，我们比较了组分10和25中的H2AX肽激酶活性。我们还确定了ATM、ATR和DNA-PK对该活动的相对贡献(图4B） ●●●●。ATM和ATR蛋白激酶活性被上述特异性中和抗体抑制。DNA-PK活性受到香兰素的抑制，香兰素是一种DNA-PK-的特异性抑制剂（Durant和Karran 2003）。组分10中的大多数H2AX激酶活性是由ATM引起的，在较小程度上是由ATR引起的(图4B） ●●●●。香兰素对激酶活性影响不大，表明DNA-PK在该组分中的贡献较小。相反，组分25中的激酶活性对香兰素敏感，但对ATM或ATR中和抗体不敏感(图4B） ●●●●。

为了进一步证明MRN–DNA复合物的形成直接促进ATM激活，我们用重组MRN补充提取物，并比较了总提取物和分数10中H2AX肽的磷酸化。被ATM抗体抑制的H2AX激酶在组分10中的比例显著高于总提取物中的比例（将第1和第2列与第9和第10列进行比较图4C） ●●●●。在层析之前，将提取物与重组MRN复合物孵育，将组分10中的H2AX激酶活性提高80%（与图4C） ●●●●。增加的激酶活性被抗ATM抗体完全消除(图4C、 第2列和第6列）。

讨论

ATM激活需要MRN复合体

MRN复合体的三个组成部分Mre11、Rad50和Nbs1至关重要。携带这些蛋白失活突变的小鼠胚胎或鸡细胞是不可行的(Luo等人，1999年;Yamaguchi-Iwai等人，1999年;Zhu等人，2001年). 这使得对MRN及其交互伙伴的研究难以接近。虽然ATM激活和MRN之间的联系早已为人所知(彼得里尼2000)据我们所知，联系这两个因素的确切机制尚未阐明。然而，使用无细胞爪蟾鸡蛋提取物，可以使生化必需的基因产物失活。我们先前确定Mre11及其相关蛋白伙伴的缺失会导致DNA复制过程中DSB的形成(Costanzo等人，2001年). 我们使用了类似的策略来关联MRN失活和ATM功能。

我们提供了几条证据，表明ATM激活需要MRN。DSB引起的G1-S检查点需要蛋白激酶的顺序激活，包括ATM(周和Elledge 2000). 我们表明，从我们的提取物中去除Mre11可以消除DSB依赖的H2AX肽磷酸化，这是级联的读数。ATM是这些提取物中H2AX磷酸化的主要贡献者。我们的数据强烈表明，MRN专门激活ATM。在提取物中孵育的片段DNA形成包括MRN和ATM的高分子量DNA-蛋白质复合物。在组分10的复合体中，75%的H2AX激酶活性被ATM抗体抑制。此外，将重组MRN添加到提取物中增加了复合物的产量和相关的H2AX激酶活性。增强的活动完全依赖于ATM。

ATR还显著促进了用含有DSB的DNA处理的提取物中H2AX的磷酸化。然而，ATM的激活时间早于ATR（数据未显示）。ATR激活可能由DSB加工成单链DNA（ssDNA）触发(邹和Elledge 2003)。我们之前证明ssDNA特异性刺激ATR(Costanzo等人，2003年). 由于Mre11缺失完全阻止H2AX磷酸化，我们建议Mre11既调节来自DSB的ATM依赖性早期信号，也可能通过其DNA外核溶解活性调节ATR的延迟信号。咖啡因完全抑制H2AX激酶，而ATM/ATR抗体联合治疗仅抑制80%的H2AX激酶。这可能是由额外的激酶如ATX引起的(亚伯拉罕2001). 另外，针对ATM和ATR的中和抗体可能不会100%抑制各自激酶对H2AX的活性。

MRN系带线性DNA分子和组装DNA损伤信号复合物

我们认为MRN与线性DNA相互作用，形成DNA-蛋白质复合物，诱导负责G1-S检查点的磷酸化级联反应。MRN在体外与线性DNA分子组装(de Jager等人，2001年). 我们已经从与片段DNA孵育的提取物中分离出DNA-蛋白质复合物，作为尺寸柱中的排除部分。这些复合物需要Mre11进行组装，包含线性DNA，并且在Mre11和ATM中高度富集。用Mre11抗体进行的免疫沉淀研究表明，在排除的体积中存在三重复合物（Mre11–ATM–片段DNA），但在空隙体积中不存在（数据未显示）。

我们认为，这些复合物的形成是导致G1–S检查点的激酶级联反应的关键步骤。有几条证据支持这一观点：（1）Mre11缺失的提取物不会形成复合物，也不会激活ATM以响应DSB。（2） Mre11在DNA-蛋白质复合物中的浓度是18倍，并且被严重磷酸化。我们之前确定Mre11的磷酸化与核酸酶活性增加相关(Costanzo等人，2001年). （3） ATM在复合物中富集46倍，并在丝氨酸1981上磷酸化(Bakkenist和Kastan 2003). 因此，激活的ATM仅在DNA-蛋白质复合物中检测到。

ATM，可能还有ATR，参与复合物的组装。用咖啡因（ATM和ATR的抑制剂）对提取物进行预处理，可显著降低复合物的产率。

一些H2AX激酶活性与DNA-蛋白质复合物无关。该活动主要由DNA-PK负责。

MRN成分Mre11和Nbs1均被磷酸化以响应DSB。Nbs1磷酸化依赖于ATM(Gatei等人，2000年;Lim等人，2000年;Zhao等人，2000年). 一旦在信号复合体内被招募和激活，ATM可能磷酸化Nbs1和Mre11，从而稳定复合体并增强信号活性。DNA–MRN复合物如何启动导致ATM激活的级联事件？关键步骤之一可能是使ATM与“染色质化”DNA片段接近。事实上，之前已经表明ATM与DSB有亲和力(Andegeko等人，2001年;Uziel等人2003). ATM在DSB位点的富集与体内观察到的染色质侧翼DSB上H2AX的局部磷酸化一致(van den Bosch等人，2003年).

我们以前的工作表明，在高剂量的DNA片段（100 ng/μl，相当于9×1010breaks/μl），依赖ATM的检查点不需要Mre11功能(Costanzo等人，2001年). 我们还确定100 ng/μl线性DNA的H2AX磷酸化部分与Mre11无关（数据未显示）。这可能是由于ATM在这种剂量的线性DNA的质量作用下激活以及DNA-PK的激活（数据未显示）。

A-T和ATLD相似性的分子基础

将MRN和ATM置于共同信号通路中的有力论据来自A-T、NBS和ATLD的临床和细胞表型之间的相似性(Digweed等人，1999年;Stewart等人，1999年;Tauchi等人，2002年).Uziel等人（2003）)最近显示，ATM对DSB的响应在携带缺陷Mre11的ATLD细胞中受损。在我们的工作完成后，其他研究使用Mre11或Nbs1缺陷细胞得出了类似的结论(Carson等人，2003年;Mochan等人，2003年;Theunissen等人，2003年). 我们的数据提供了一个生化框架来解释他们的观察结果。

ATLD1/2突变产生一个截短的Mre11，该Mre11缺乏部分DNA-结合域，与生存能力兼容。因此，突变不能消除Mre11的基本作用，尽管突变体Mre11在受损的DNA反应中是有缺陷的。我们能够使用简单的生化读数来分离两个Mre11反应。MRN-ATLD1/2不能激活ATM或形成DNA-蛋白质复合物来响应DSB。然而，它可以防止染色体DNA复制过程中DSB的积累。我们推测MRN-ATLD1/2降低了对受损DNA的亲和力，导致与片段DNA的不稳定相互作用，并且无法激活ATM。

Mre11在DNA复制过程中的基本功能与其激活ATM的能力有什么区别？我们认为，MRN在DNA复制期间以及可能在减数分裂重组期间与染色质的关联不同于其与片段DNA的关联。与这一假设相一致，洗涤剂提取表明Mre11的染色质结合在复制染色质和γ辐照染色质之间存在差异(Mirzoeva和Petrini 2003). 我们之前证明了在正常DNA复制过程中Mre11与染色质的关联。可以设想，MRN复合物在完整染色质上形成的方式与其他SMC蛋白质（如凝集素）类似，并且可能涉及与凝集素的相互作用(Kim等人，2002年). 这些复合物可以在复制和重组期间执行MRN的基本功能，不需要完整的Mre11 C末端结构域。这与ATLD突变细胞的生存能力和重组能力一致。

相反，含有DSB的受损DNA的系链需要Mre11 C末端DNA结合域。未能与断裂的DNA相互作用将解释A-T和ATLD的各种表型。

或者，Mre11的C末端截短可能削弱MRN复合体内或MRN与其他蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用。这个想法是由Mre11晶体结构提出的，它表明C末端结构域非常接近蛋白质-蛋白质相互作用所需的疏水区域(Hopfner等人，2001年). 截短的Mre11可能无法形成稳定MRN-DNA复合物所需的蛋白质-蛋白质相互作用。

MRN–DNA复合物和IRIF

上述信号复合物令人想起哺乳动物细胞中观察到的IRIF(Maser等人，1997年). 事实上，Mre11是DNA损伤后最先定位于IRIF的蛋白质之一(Petrini和Stracker 2003). 此外，ATLD患者的细胞无法建立病灶(Stewart等人，1999年)与MRN-ATLD1/2不能支持提取物中DNA-蛋白质复合物的形成一致。回想一下，在哺乳动物细胞中形成病灶和激活DNA损伤反应的能力是密切相关的(Stewart等人，1999年，2003;Goldberg等人，2003年).

体内IRIF的形成与提取物中信号结构的组装有一些相似之处。两者都需要（1）完整的Mre11蛋白，并且可能需要Mre11与DNA结合，以及（2）IRIF的形成独立于(Mirzoeva和Petrini 2001)，但被ATM稳定，可能通过Mre11和/或Nbs1的磷酸化(Gatei等人，2000年;Lim等人，2000年;Wu等人，2000年;Zhao等人，2000年;Costanzo等人，2001年;Lukas等人，2003年).

如所示图5我们的数据表明，MRN在类IRIF结构中集中并定位DNA片段和信号蛋白，如ATM。MRN可能是组装这些结构的速率限制，尽管Mre11可以从DNA-蛋白质复合物中分离出来。最近有报道称，断裂染色体的末端通过磷酸化H2AX定位到细胞核中的离散点(Aten等人，2004年). 这些结构的形成需要功能性MRN。我们认为这些是我们在体外观察到的MRN依赖结构的体内对应物。我们已经证明，DNA-蛋白质复合物对于DNA损伤检查点至关重要。现在的挑战是剖析组装路径并确定这些信号中心组织中的速率限制步骤。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pbio.0020110.g005.jpg
DNA损伤信号复合物依赖Mre11-组装的示意图

MRN促进含有富含活性ATM分子的线性DNA片段的DNA-蛋白质结构的组装。这些活性信号复合物类似于IRIF，因为它们是DNA损伤反应的形态学和功能单元。

材料和方法

爪蟾鸡蛋提取物

根据Costanzo等人（2001年). 对于激酶分析，用100 mg/μl环己酰亚胺补充提取物，并用0.4 mM CaCl释放到间期2。

DNA模板

为了制备含有DSB的DNA片段，我们使用限制性内切酶消化的pBR322质粒产生不同类型的末端（3′-外悬、5′-外垂和钝端）。这些DNA片段在我们的分析中表现相同（数据未显示）。对于中所示的实验图1我们用HaeII消化DNA。

使用互补于5570和6584位点的22个nt引物，在M13 ssDNA模板上通过PCR获得用于大小分级实验的1 kb DNA片段(de Jager等人，2001年). 这个32通过添加α获得P标记片段-32PCR中的P-dATP（10 mCi/μl）。生物素化的1 kb片段是在M13 ssDNA模板上通过PCR获得的，使用一个与5570位互补的22 nt引物和一个与6584位互补的22nt引物，生物素化在三个胸苷残基上（美国德克萨斯州伍德兰市Sigma-Genosys）。

激酶测定

间期卵子提取物与DNA片段、DNA片段和ATM中和抗体、ATR中和抗体或5 mM咖啡因在22°C下孵育30分钟。将提取物（2μl）与20μl EB激酶缓冲液（20 mM HEPES[PH7.5]，50 mM NaCl，10 mM MgCl）混合21 mM DTT、1 mM NaF、1 mM-Na三VO（旁白）4和10 mM MnCl2)补充0.5 mg/ml组蛋白H2AX肽（Sigma-Genosys）、50μM ATP和1μlγ-32P-ATP，10 mCi/μl（大于3000 Ci/mmol）。样品在30°C下培养20分钟，用20μl 50%的乙酸停止反应，并在p81磷纤维素滤纸上进行标记（美国纽约普莱西德湖Upstate Biotechnology）。过滤器风干，并在10%乙酸中清洗三次。放射性在闪烁计数器中定量。

对于分级提取物的激酶测定，将50纳克/μl的1kb DNA片段在22°C的相间提取物中孵育2小时。将提取物加载到上浆柱上，收集250μl级分。将组分补充9%PEG-6000，在冰上培养15分钟，并在微型离心机中以4°C的最大速度旋转10分钟。将颗粒重新悬浮在20μl EB缓冲液中，并使用组蛋白H2AX肽底物对2μl进行分析，包括或不包括ATM中和抗体、ATR中和抗体、300μM香草醛、，或5 mM咖啡因。

鸡蛋提取物分馏

将间期卵子提取物（200μl）与或不与50 ng/μl的32P标记的1 kb DNA片段在22°C下持续2小时。然后将它们与一体积的缓冲液A混合，加载到15×300 mm的柱上，柱上预先填充有BioGel A15m树脂（Bio-Rad，Hercules，California，United States），之前在4°C下与缓冲液A平衡。提取液为模拟缺失、Mre11缺失或Mre11耗尽，补充500 nM MRN或500 nM MRI-ATLD1/2。对照提取物在37°C下用500 nM MRN和100μM TPEN或5 mM咖啡因或1 mg/ml蛋白酶K处理。装载样品后，15 ml缓冲液A（100 mM KCl，40 mM HEPES[PH8.0]，0.05%吐温-20，10 mM MgCl2，1 mM三磷酸腺苷、1 mM DTT、1 mM-NaF、1 mM/Na三VO（旁白）4leupeptin、pepstatin和抑肽酶抑制剂）轻轻涂抹在柱上。我们收集了大约300μl的31个组分，并在闪烁计数器中测量了放射性。对于对照提取物中圆形质粒的洗脱图谱，一个1.8kb的质粒衍生自pUC19，其SspI–SapI区域缺失(Ristic等人，2001年)已使用。在α-32P-dCTP，结扎并在提取物中培养。收集部分后，在闪烁计数器中计算放射性。

与Mre11结合的DNA片段沉淀

我们孵育200μl对照、Mre11缺失或Mre11耗尽提取物，补充从提取物中沉淀的Mre11，50 ng/μl32P标记的1 kb DNA片段。将样品应用于BioGel A15m分级柱，并收集馏分。空泡体积峰分数10和包含的体积峰分数25与50μl针对Mre11的特异性多克隆抗体在4°C下孵育过夜，抗体预结合到蛋白A–Sepharose珠或珠。用缓冲液A清洗珠子，并在闪烁计数器中计算放射性。

生物素化DNA下拉

我们培养了200μl对照、Mre11-缺失或Mre11--缺失提取物，补充了50 ng/μl的500 nM MRN32P标记的1 kb DNA片段和50 ng/μl生物素化1 kb片段在22°C下保持2小时。将样品应用于BioGel A15m上浆柱，并收集级分。空隙体积峰值分数10和包含体积峰值分数25与千碱-BINDER动态珠（挪威奥斯陆Dynal Biotech）或模拟蛋白A动态珠（Dynal Biotech）孵育，并根据试剂盒方案分离DNA片段。用缓冲液A清洗结合在珠子上的生物素化DNA片段，并在闪烁计数器中计算放射性。

重组Mre11/Rad50/Nbs1蛋白质类

根据公布的方案，从杆状病毒感染的细胞中纯化人MRN和MRN-ATLD1/2(Paull and Gellert 1998年). 除非另有规定，否则以500 nM的浓度使用重组三聚体复合物。

X（X）-Mre11复合损耗/Ku损耗

对于X-Mre11复合物的去除，50μl的间期提取物与25μl的蛋白A-Sepharose珠与50μl免疫前血清或50μl X-Mre11-抗血清在4°C下孵育60分钟。为了去除Ku70/80，将50μl间期提取物与25μl蛋白A–Sepharose珠与50μl Ku抗血清（美国新泽西州普林斯顿市科文斯）在4°C下孵育60分钟。

标记法

TUNEL分析根据Costanzo等人（2001年).

蛋白质印迹

我们将2μl样品的间期卵子提取物与50 ng/μl DNA片段、DNA片段和5 mM咖啡因在22°C下孵育30分钟，或与50 ng/μl循环质粒孵育，从BioGel A15m柱中回收2μl样本，并用9%PEG沉淀（参见图3A） 在加载缓冲液中稀释，煮沸3分钟，在6%或10%的SDS-PAGE上电泳，转移到硝化纤维素中，并用针对爪蟾自动取款机，爪蟾自动标签阅读器，爪蟾Mre11，人类ATM的磷丝氨酸1981（Rockland Immunochemicals，Gilbertsville，Pennsylvania，United States）和磷酸化ATM/ATR SQ底物（New England Biolabs，Beverly，Massachusetts，Uniteds）。

致谢

我们要感谢K.Cimprich博士提供的X-ATR抗体，L.Symington博士阅读了手稿，以及Gautier实验室的成员提供的有益建议。这项工作得到了美国癌症协会拨款RSG CCG-103367、美国国立卫生研究院拨款（CA95866和CA92245）以及美国国立癌症研究所与JG签订的合同N01-CN-25111的支持。

缩写

A-T公司共济失调扩张
ATLD公司共济失调毛细血管扩张样疾病
自动取款机共济失调扩张症突变
心房颤动共济失调-扩张相关
DSB公司双绞线断裂
IRIF公司辐射诱导焦点
物料需求编号Mre11/Rad50/Nbs1复合物
MRN-ATLD1/2包含截断Mre11的Mre11/Rad50/Nbs1复合体
国家统计局综合征如奈梅亨破损综合症
SMC公司染色体的结构维持
ssDNA单链DNA

笔记

更正说明：

由于标记错误，整个实验中使用的DNA片段的大小报告不正确（报告为1 kb）。DNA片段的实际大小为131 bp。该片段对应于从核苷酸5656到核苷酸5787的M13 DNA序列。碎片大小的差异并不影响本文的任何结论。更正日期：2004年6月14日

利益冲突。提交人声明，不存在利益冲突。

作者贡献。VC和JG构思并设计了实验。VC进行了实验。VC、MG和JG分析了数据。TP提供的试剂/材料/分析工具。VC、MG和JG撰写了这篇论文。

学术编辑：James Haber，Brandeis University

工具书类

  • Abraham RT。通过ATM和ATR激酶的细胞周期检查点信号。基因发育。2001;15:2177–2196.[公共医学][谷歌学者]
  • Andegeko Y、Moyal L、Mittelman L、Tsarfaty I、Shiloh Y等。ATM在DNA双链断裂位点的核保留。生物化学杂志。2001;276:38224–38230.[公共医学][谷歌学者]
  • Aten JA、Stap J、Krawczyk PM、van Oven CH、Hoebe RA等。受损染色体结构域聚类揭示的DNA双链断裂动力学。科学。2004;303:92–95.[公共医学][谷歌学者]
  • Bakkenist CJ、Kastan MB。DNA损伤通过分子间自磷酸化和二聚体解离激活ATM。自然。2003;421:499–506.[公共医学][谷歌学者]
  • Burma S，Chen BP，Murphy M，Kurimasa A，Chen DJ。ATM磷酸化组蛋白H2AX以响应DNA双链断裂。生物化学杂志。2001;276:42462–42467.[公共医学][谷歌学者]
  • Carney JP、Maser RS、Olivares H、Davis EM、Le Beau M等。hMre11/hRad50蛋白复合物和奈梅亨断裂综合征：双链断裂修复与细胞DNA损伤反应的联系。单元格。1998;93:477–486.[公共医学][谷歌学者]
  • Carson CT、Schwartz RA、Stracker TH、Lilley CE、Lee DV等。ATM激活和G（2）/M检查点需要Mre11复合体。EMBO J。2003;22:6610–6620. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Costanzo V、Robertson K、Ying CY、Kim E、Avvedimento E等。DNA损伤后抑制染色体DNA复制的ATM依赖性检查点的重建。分子细胞。2000年；6:649–659.[公共医学][谷歌学者]
  • Costanzo V、Robertson K、Bibikova M、Kim E、Grieco D等。Mre11蛋白复合物可防止染色体DNA复制过程中的双链断裂累积。分子细胞。2001;8:137–147.[公共医学][谷歌学者]
  • Costanzo V、Shechter D、Lupardus PJ、Cimprich KA、Gottesman M等。抑制DNA复制起始的依赖ATR和Cdc7的DNA损伤检查点。分子细胞。2003;11:203–213.[公共医学][谷歌学者]
  • D'Mours D，Jackson SP。Mre11复合体：处于DNA修复和检查点信号的十字路口。Nat Rev Mol细胞生物学。2002;三:317–327.[公共医学][谷歌学者]
  • de Jager M、van Noort J、van Gent DC、Dekker C、Kanaar R等。人类Rad50/Mre11是一种能够连接DNA末端的柔性复合物。分子细胞。2001;8：1129-1135。[公共医学][谷歌学者]
  • Digweed M，Reis A，Sperling K.奈梅亨断裂综合征：缺陷DNA双链断裂修复的后果。生物论文。1999;21:649–656.[公共医学][谷歌学者]
  • Durant S，Karran P.香兰素——一种新型DNA-PK抑制剂家族。核酸研究。2003;31:5501–5512. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gatei M、Young D、Cerosaletti KM、Desai-Mehta A、Spring K等。辐射照射下尼泊金依赖ATM的磷酸化反应。自然遗传学。2000年；25:115–119.[公共医学][谷歌学者]
  • Gatti RA、Becker-Catania S、Chun HH、Sun X、Mitui M等。共济失调-扩张症的发病机制：从罗塞塔结石中学习。《过敏免疫学临床评论》。2001;20:87–108.[公共医学][谷歌学者]
  • Goldberg M、Stucki M、Falck J、D'Amours D、Rahman D等。S期内DNA损伤检查点需要MDC1。自然。2003;421：952–956。[公共医学][谷歌学者]
  • 哈伯JE。Mre11的许多接口。单元格。1998;95:583–586.[公共医学][谷歌学者]
  • Hopfner KP、Karcher A、Craig L、Woo TT、Carney JP、Tainer JA。DNA双链断裂修复Mre11核酸酶和Rad50-ATPase的结构生物化学和相互作用结构。单元格。2001;105:473–485.[公共医学][谷歌学者]
  • Hopfner KP、Craig L、Moncalian G、Zinkel RA、Usui T等。Rad50锌钩是连接Mre11复合体进行DNA重组和修复的结构。自然。2002;418:562–566.[公共医学][谷歌学者]
  • Kim JS、Kraseva TB、LaMorte V、Taylor AM、Yokomori K。激光诱导DNA损伤中人类凝集素的特殊招募。生物化学杂志。2002;277:45149–45153.[公共医学][谷歌学者]
  • Lee JH、Ghirlando R、Bhaskara V、Hoffmeyer MR、Gu J等。Nbs1对Mre11/Rad50的调节：对核苷酸依赖性DNA结合的影响以及与共济失调样扩张症突变复合物的关联。生物化学杂志。2003;278:45171–45181.[公共医学][谷歌学者]
  • Lim DS，Kim ST，Xu B，Maser RS，Lin J，等。ATM在S期检查点通路中磷酸化p95/nbs1。自然。2000年；404:613–617.[公共医学][谷歌学者]
  • Lukas C、Falck J、Bartkova J、Bartek J、Lukas J。DNA损伤诱导的哺乳动物检查点调节器的独特时空动力学。自然细胞生物学。2003;5:255–260.[公共医学][谷歌学者]
  • Luo G、Yao MS、Bender CF、Mills M、Bladl AR等。mRad50的破坏会导致胚胎干细胞死亡、胚胎发育异常和对电离辐射的敏感性。美国国家科学院院刊。1999;96:7376–7381. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Maser RS、Monsen KJ、Nelms BE、Petrini JH。hMre11和hRad50核病灶是在DNA双链断裂的正常细胞反应期间诱导的。摩尔细胞生物学。1997;17:6087–6096. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mirzoeva OK，Petrini JH。Mre11复合物的DNA损伤依赖性核动力学。摩尔细胞生物学。2001;21:281–288. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mirzoeva OK，Petrini JH。Mre11复合物的DNA复制依赖性核动力学。摩尔癌症研究。2003;1:207–218.[公共医学][谷歌学者]
  • Mochan TA、Venere M、DiTullio RA、Halazonetis TD.53BP1和NFBD1/MDC1-Nbs1在平行相互作用的通路中发挥作用，激活共济失调-扩张突变（ATM）以应对DNA损伤。癌症研究。2003;63:8586–8591.[公共医学][谷歌学者]
  • Paull TT，Gellert M.Mre 11的3′至5′核酸外切酶活性有助于修复DNA双链断裂。分子细胞。1998;1:969–979.[公共医学][谷歌学者]
  • Paull TT，Gellert M.Nbs1通过Mre11/Rad50复合物增强ATP驱动的DNA解旋和核酸内切酶裂解。基因发育。1999;13:1276–1288. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Petrini JH公司。Mre11综合体和ATM：协作导航S阶段。当前操作细胞生物学。2000年；三:293–296.[公共医学][谷歌学者]
  • Petrini JH，Stracker TH。细胞对DNA双链断裂的反应：定义传感器和介质。趋势细胞生物学。2003;13:458–462.[公共医学][谷歌学者]
  • Ristic D，Wyman C，Paulusma C，Kanaar R。人类Rad54-DNA复合物的结构为蛋白质沿DNA的易位提供了证据。美国国家科学院院刊。2001;98:8454–8460. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rogakou EP、Pilch DR、Orr AH、Ivanova VS、Bonner WM。DNA双链断裂诱导组蛋白H2AX在丝氨酸139上磷酸化。生物化学杂志。1998;273:5858–5868.[公共医学][谷歌学者]
  • Shiloh Y，Kastan MB。ATM：基因组稳定性、神经元发育和癌症交叉途径。高级癌症研究。2001;83:209–254.[公共医学][谷歌学者]
  • Shumaker DK、Vann LR、Goldberg MW、Allen TD、Wilson KL.TPEN、a Zn2+/铁2+对Ca亲和力低的螯合剂2+，抑制层粘连组装，破坏核结构，可能在体外独立保护细胞核免受凋亡。细胞钙。1998;23:151–164.[公共医学][谷歌学者]
  • Stewart GS、Maser RS、Stankovic T、Bressan DA、Kaplan MI等。DNA双链断裂修复基因hMRE11在共济失调样扩张症患者中发生突变。单元格。1999;99:577–587.[公共医学][谷歌学者]
  • Stewart GS、Wang B、Bignell CR、Taylor AM、Elledge SJ。MDC1是哺乳动物DNA损伤检查点的中介。自然。2003;421:961–966.[公共医学][谷歌学者]
  • Symington LS。RAD52上位性群基因在同源重组和双链断裂修复中的作用。微生物分子生物学评论。2002;66:630–670. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tauchi H、Kobayashi J、Morishima K、van Gent DC、Shiraishi T等。Nbs1对高等脊椎动物细胞中同源重组的DNA修复至关重要。自然。2002;420:93–98.[公共医学][谷歌学者]
  • Theunissen JW、Kaplan MI、Hunt PA、Williams BR、Ferguson DO等。Mre11（ATLD1/ATLD1）小鼠的检查点失败和染色体不稳定性，但无淋巴腺病。分子细胞。2003;12:1511–1523.[公共医学][谷歌学者]
  • Trujillo KM，Sung P.酿酒酵母Rad50*Mre11复合物中的DNA结构特异性核酸酶活性。生物化学杂志。2001;276：35458–35464。[公共医学][谷歌学者]
  • Uziel T、Lerenthal Y、Moyal L、Andegoko Y、Mittelman L等。MRN复合体对DNA损伤激活ATM的要求。EMBO J。2003;22:5612–5621. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • van den Bosch M，Bree RT，Lowndes NF。MRN复合体：协调和介导对断裂染色体的反应。EMBO代表。2003;4:844–849. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Varon R、Vissinga C、Platzer M、Cerosaletti KM、Chrzanowska KH等。Nibrin是一种新型DNA双链断裂修复蛋白，在奈梅亨断裂综合征中发生突变。单元格。1998;93:467–476.[公共医学][谷歌学者]
  • Ward IM，Chen J.组蛋白H2AX以ATR依赖性方式磷酸化，以应对复制应激。生物化学杂志。2001;276:47759–47762.[公共医学][谷歌学者]
  • Wu X、Ranganathan V、Weisman DS、Heine WF、Ciccone DN等。奈梅亨断裂综合征蛋白的ATM磷酸化在DNA损伤反应中是必需的。自然。2000年；405:477–482.[公共医学][谷歌学者]
  • Yamaguchi-Iwai Y、Sonoda E、Sasaki MS、Morrison C、Haraguchi T等。Mre11对脊椎动物细胞染色体DNA的维持至关重要。EMBO J。1999;18:6619–6629. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yuzhakov A、Kelman Z、O'Donnell M。贸易将DNA-A三点开关置于引物从初级酶到复制DNA聚合酶的切换之下。单元格。1999;96:153–163.[公共医学][谷歌学者]
  • 赵S，翁永春，袁世生，林永泰，徐慧聪，等。共济失调-扩张症与奈梅根断裂综合征基因产物之间的功能联系。自然。2000年；405:473–477.[公共医学][谷歌学者]
  • 周BB，Elledge SJ。DNA损伤反应：透视检查点。自然。2000年；408：433–439。[公共医学][谷歌学者]
  • Zou L，Elledge SJ。通过ATRIP识别RPA-ssDNA复合物来感知DNA损伤。科学。2003;300:1542–1548.[公共医学][谷歌学者]
  • Zhu J，Petersen S，Tessarollo L，Nussenzweig A.奈梅亨破裂综合征基因NBS1的靶向破坏导致小鼠早期胚胎死亡。当前生物量。2001;11:105–109.[公共医学][谷歌学者]
文章来自PLOS生物学由以下人员提供多环芳烃