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《公共科学图书馆·生物》。2004年5月；2（5）：e92。
2004年5月11日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pbio.0020092
预防性维修识别码：项目经理406387
PMID：15138495

神经诱导爪蟾：通过Chordin、Noggin、β-连环蛋白和Cerberus对外胚层和内胚层信号的需求

黑田博树,1 奥利弗·威塞利,1和E.M.德罗伯茨通讯作者1
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摘要

诱导中枢神经系统分化的信号来源是脊椎动物胚胎学中一个长期存在的问题。这里我们展示一下爪蟾神经诱导在囊胚期开始的时间比之前想象的要早，需要两个不同的信号中心的联合活动。一个是著名的Nieuwkoop中心，位于背植物细胞中，表达Nodal-related内胚层诱导因子。另一个是囊胚科尔丁-和诺金-表达（BCNE）中心，位于包含前瞻性神经外胚层和Spemann组织者前体细胞的动物背侧细胞中。这两个中心都位于早期β-连环蛋白信号的下游。分子分析表明，BCNE中心与Nieuwkoop中心不同，Nieuwkuop中心表达分泌蛋白Cerberus（Cer）。我们发现，未接触中胚层基质的移植囊胚背侧动物帽细胞在盐水中培养时，可以表达明确的神经标记物，并在组织学上分化为中枢神经系统组织。移植实验表明，BCNE区域是大脑形成所必需的，尽管在腹侧移植时它缺乏CNS诱导活性。细胞测序研究表明，BCNE细胞产生大脑和视网膜的很大一部分，在胚胎的更后部产生底板和脊索。用反义吗啉寡核苷酸（MO）进行的功能丧失实验表明，在无中胚层的情况下形成的中枢神经系统爪蟾胚胎（通过注射Cerberus-短[证书]mRNA）所需的Chd、Noggin及其上游调节因子β-连环蛋白。当背部边缘区外植体阻止中胚层退化时，外胚层形成的前神经组织来源于BCNE细胞，对Chd有完全的需求。通过注射变更吗啉寡核苷酸(变更-MO）转化为预期的神经外胚层和驼鹿吗啉寡核苷酸(证书-MO）在8细胞期进入前瞻性内胚层，我们表明这两层在中枢神经系统形成中协同作用。研究结果提出了一个神经诱导模型爪蟾其中，早期囊胚β-连环蛋白信号通过Spemann组织者发出的内中胚层信号使潜在的神经外胚层易受神经诱导。

对神经诱导早期事件的新见解，这些事件使某些细胞能够对Spemann组织者发出的信号作出反应

介绍

脊椎动物的发育是一系列细胞-细胞相互作用的结果，在这些相互作用中，细胞群诱导其邻居获得新的细胞分化命运。这一过程被称为胚胎诱导，最初是由来自大脑的视小泡在外胚层表面诱导晶状体(斯佩曼1901;刘易斯1904). 随后的研究表明，表面外胚层本身也起着重要作用（由格兰杰1992). 从透镜感应的分析来看，斯佩曼（1938）)提出了双重保证机制(doppelte Sicherung公司)可以通过两层细胞之间的相互作用来解释脊椎动物发育的稳健性。晶状体诱导是次级胚胎诱导的一个例子。大多数实验胚胎学家集中研究神经板的诱导，这被认为是初级胚胎诱导(斯佩曼1938;萨克森和托沃宁1962;哈兰德2000;吉尔伯特2001;斯特恩2002). 在经典的器官移植实验中，Spemann和Mangold（1924年)证明背唇中胚层足以诱导外胚层中完整中枢神经系统（CNS）的分化。斯佩曼在他的书中用了整整一章来讨论在神经板诱导的情况下是否存在双重保证机制（斯佩曼1938)并得出结论，证据支持潜在中胚层的作用，但不支持预期的神经外胚层。

在中胚层或外胚层受损的实验基础上，提出了原肠胚外胚层在神经板形成中的作用(戈特勒1925)并得到了一些后续支持(莱曼1928). 然而，对外胚层在神经板形成中可能起的作用的进一步考虑受到了在axolotl胚胎中进行的一项极具影响力的外原肠形成实验的阻碍(霍特弗雷特1933)防止内胚层退化，整个外胚层分化为表皮。由于在这些胚胎中没有中枢神经系统组织的痕迹，这项实验被解释为一种证据，表明潜在的内胚层在神经板诱导中起着重要作用，而预期的神经外胚层没有(霍特弗雷特1933;斯佩曼1938). 关于外胚层本身是否在神经板形成中起作用的争论一直持续到今天。背缘区移植(Keller和Danilchik 1988年;凯勒1991)，中枢神经系统分化可能发生在没有潜在中胚层的情况下。有人提出，在这些Keller外植体中，神经组织诱导是由原肠胚中胚层组织者在外胚层平面扩散的“平面”信号引起的(Ruiz i Altaba 1992年,1993;Doniach等人，1992年;波兹南斯基和凯勒1997)（请参见图6A） ●●●●。然而，平面神经诱导信号的存在一直存在争议，凯勒外植体中的神经诱导被认为是由外胚层和中胚层在原肠胚早期短暂接触产生的“垂直”信号引起的(Nieuwkoop和Koster 1995). 因此，尽管在两栖类神经诱导方面进行了数十年的研究，但一个核心问题仍未得到解答：在缺乏中胚层基质的情况下，假定的神经板材料的分化潜能是什么？这就是这里要解决的问题。

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Keller移植体的前神经诱导需要Chd

（A） 神经诱导中提出的垂直和平面信号（根据Ruiz i Altaba 1993）。

（B） Keller外植体制备和内中胚层会聚延伸延伸示意图(凯勒1991).

（C） Keller外植体的神经和中胚层区域包含BCNE细胞的后代（蓝色），标记为64细胞期的卵裂球注射。

（D） 的表达式其他2和克罗克斯20在Keller外植体中(n个= 7).

（E） 注入17 ng变更-生产订单完全冻结其他2和克罗克斯20神经区域的表达，而其他2在前内皮层没有受到影响(n个= 10).

（F） 分化神经元标记N-微管蛋白在凯勒外植体中表达(n个= 8).

（G） 部分抑制N-微管蛋白通过注入变更-生产任务单(n个= 7).

（H和I）变更-MO在Keller外植体中。缩写：SC，脊髓；CG，水泥压盖；表皮，表皮。

（J） RT-PCR分析变更-Keller外植体中的MO；注入（正）或不注入（负）的样品变更-显示MO。车道1，全胚胎；2–7道，凯勒三明治。注意神经标记的表达国家癌症管理局和N-微管蛋白在凯勒三明治中，通过联合注射200 pg的dnFGF受体4a而取消(dnFGF4a型)mRNA和17 ng变更-MO（车道5）。注射600 pg证书mRNA消除中胚层，但不影响BCNE的形成，在本试验中不影响神经诱导（第6条线）。

最近的两项技术进步使我们重新研究了神经诱导爪蟾首先，现在可以通过微注射完全抑制中胚层的形成Cerberus-短款(证书)mRNA，一种对结节相关中胚层诱导物特异的分泌性拮抗剂(Agius等人，2000年). 有趣的是，爪蟾缺乏中胚层的胚胎仍然发育出中枢神经系统，包括独眼(Wessely等人，2001年). 这令人惊讶，因为这样的无中胚层胚胎没有表达多种Spemann组织者标记，例如科尔丁(变更),诺金(诺格)、和Goosecoid公司原肠胚期背内胚层。其次，随着反义吗啉寡聚物（MO）的问世，一场技术革命发生了，MO允许在爪蟾(Heasman等人，2000年). 现在可以将两栖动物实验胚胎学的工具与单个基因的作用研究相结合，例如分泌性骨形态发生蛋白（BMP）拮抗剂Chd(Oelgeschläger等人，2003年)或其上游调节因子β-连环蛋白(Heasman等人，2000年)，在实验操作的胚胎中。

在整个胚胎中注射变更-MO是一种中枢神经系统，虽然体积较小，但仍在发育。然而，当移植到宿主胚胎腹侧时，因Chd而耗尽的Spemann组织者失去了所有神经诱导活性(Oelgeschläger等人，2003年). 令人惊讶的是，当类似的缺乏Chd的移植物放在背侧时，外胚层细胞失去了对神经板的贡献能力(Oelgeschläger等人，2003年). 这表明外胚层自身可能存在Chd对神经板形成的细胞自主需求。在囊胚期，BMP拮抗剂变更和诺格在我们最初指定为“前组织者中心”的区域的动物背部帽和边缘区表达(Wessely等人，2001年). 这组细胞构成囊胚科尔丁-和诺金-表达（BCNE）区域，包含预期的神经外胚层细胞和Spemann组织者前体。BCNE区域也表达爪蟾节点相关3（Xnr3），一种具有神经诱导特性的分泌因子，在早期高水平表达爪蟾胚胎(Haramoto等人，2004年;Wessely等人，2004年). 表达的早期阶段变更和诺格在BCNE细胞中，β-连环蛋白的背侧积累对其进行调节，而随后在Spemann组织者内中胚层中同样的基因的表达需要额外的结节相关信号，这些信号可以被证书(Wessely等人，2001年).

在本研究中，我们分析了神经诱导的机制爪蟾通过胚胎剪贴和分子功能丧失实验。我们发现BCNE中心包含许多假定的前中枢神经系统。功能丧失研究表明，囊胚表达的基因产物，如Chd、Nog和β-连环蛋白，是在没有潜在内胚层的情况下进行神经诱导所必需的。细胞测序研究表明，BCNE中心本身产生大脑、脊索和底板。移植实验表明，BCNE中心是脑形成所必需的爪蟾胚胎。8细胞阶段的微注射实验，其中变更-将MO注射到动物背部证书-MO进入背植物胚裂球，证实来自预期神经外胚层和潜在内胚层的分泌信号是中枢神经系统前部发育所必需的。研究结果支持了一种双重保证机制，即斯佩曼（1938）)用于透镜感应。

结果

BCNE中心有别于Nieuwkoop中心

初始不对称爪蟾发育是由精子进入引发的皮层旋转引起的，被认为是重新分配“背侧决定因素”，从而稳定胚胎背侧的β-儿茶素蛋白(图1A） （在中审查Gerhart等人，1991年;Harland和Gerhart 1997年;De Robertis等人，2000年). 在囊胚期，位于背植物细胞的Nieuwkoop中心分泌中胚层诱导信号，如Xnr1、Xnr2、Xnr 4、XnR 5、，和Xnr6号机组诱导上覆中胚层细胞中原肠胚Spemann组织者的形成(Agius等人，2000年;Takahashi等人，2000年). Nieuwkoop中心在早期文献中也被称为“囊胚组织者”(Gerhart等人，1991年). BCNE区域在动物背侧和边缘区域发育。囊胚期（受精后7小时）的原位杂交分析表明，神经诱导分泌因子Chd、Nog、，和Xnr3号机组在包括大约45个区域的动物帽中表达o个囊胚腔底部上方以及背缘区的弧度(图1B–1D） ●●●●。在原肠胚阶段，相同的基因在更多的植物区表达，在位于边缘区背内中胚层的Spemann组织者中（例如。，图2E） ●●●●。

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两个信号中心共存于爪蟾布拉斯图拉

（A） 1细胞期和早期囊胚之间的早期事件图。

（B–D）表达Chd、Nog、，和Xnr3号机组中囊胚转变后（受精后7小时）的转录本。将胚胎作为整体杂交，在室温下在甲醇中储存1个月以提高对比度，并用剃须刀片切片。

（E） 中胚泡9期早期基因标记的RT-PCR分析。如图所示，通过对囊胚区域的解剖，制备了六个样本。

（F） 囊胚基因表达总结。BCNE中心表示Chd、Nog、Siamois、，和Xnr3、，而Nieuwkoop中心表示Xnr2、Xnr6、，和证书。

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BCNE中心对前脑和中线结构的贡献

（A） 使用生物素-右旋糖酐（BDA）标记的移植物对BCNE中心进行谱系追踪的方法。

（B） 第9期新近移植的BCNE的矢状面切片。

（C）变更mRNA在第9期表达。

（D） BCNE 10.5期后代。

（E）变更10.5期mRNA表达。

（F） BCNE中心11期后代。

（G） 神经板14期BCNE后代的背视图。

（H） 移植BCNE区细胞核双重染色lacZ公司在第14阶段，用浅红色的表皮细胞角蛋白（epi）探针检测宿主的mRNA和表皮外胚层。

（一） 第16阶段主干水平的横截面。缩写：fp，楼板；不，脊索。

（J–L）第40阶段的横截面。缩写：fp，楼板；hb，后脑；他，心；le，透镜；mb，中脑；不，脊索；ov，耳囊；视网膜。

（M） 用CMV-GFP转基因胚胎的BCNE移植物移植6天胚胎的背视图。缩写：br，brain；fp，地板；on，视神经；op，嗅觉板。

（N） 4d侧视图显示标记的视网膜和大脑。缩写：br，brain。

问题是两个不同的信号中心是否共存于爪蟾囊胚。为了解决这个问题，具有强烈背腹极性的早期囊胚(克莱因1987)被切割成六块碎片，如所示图1E.结果表明，尽管存在一些重叠，但该区域表达变更和诺格包括动物帽，而Nieuwkoop中心区域表示Xnr2号机组和Xnr6号机组有一个更适合植物生长的地方（参见图1E） ●●●●。Xnr3号机组在片段3和片段4中观察到表达，表明重叠程度较高（参见图1E） ●●●●。此外，结果显示同源盒基因Siamois公司在BCNE区域表达，尽管据报道其在发育后期的表达更多是植物性的(Lemaire等人，1995年). 我们还发现Cerberus（Cer），原肠胚前内胚层表达的一个基因(Bouwmeester等人，1996年)是Nieuwkoop中心的一个组成部分。我们得出结论，囊胚中存在两个不同的信号中心（参见图1F） ●●●●。BCNE中心表达的动物越多变更、编号、Xnr3、，和Siamois公司，而Nieuwkoop中心表示Xnr2、Xnr6、，和证书。

BCNE区域的细胞谱系

绘制囊胚的命运变更-和诺格-在正常发育过程中表达细胞，我们在第9期早期将谱系标记的BCNE区域同位素移植到宿主囊胚中(图2A） ●●●●。这些含有谱系示踪剂生物素-右旋糖酐胺（BDA）的移植物标记了变更-囊胚表达区（比较图2B和​和2C）。2C） ●●●●。几个小时后，在原肠胚早期（10.5期），在组织者内胚层和预期神经外胚层中都发现了背盖动物后代(图2D） ●●●●。我们注意到在原肠胚早期变更mRNA在组织者内胚层中表达，但在预期的神经外胚层中不再检测到(图2E） ●●●●。在原肠中段11期，移植组织在组织者内胚层和预期神经外胚层中拉长，两层保持紧密并列(图2F） ●●●●。在神经板阶段，即第14阶段，在前神经板的宽区域和更靠后的中线的窄条纹中发现BCNE中心后代(图2G） ●●●●。使用细胞核双重染色lacZ公司mRNA作为谱系示踪剂结合表皮细胞角蛋白标记物证实BCNE细胞产生前神经板(图2H） ●●●●。在组织切片中，躯干区中线染色与底板和脊索相对应(图2一） ●●●●。在蝌蚪期（40期），BCNE后代对大脑和视网膜的大部分（但不是晶状体和耳囊）以及躯干尾部的背中线结构有贡献(图2J–2五十） ●●●●。这种血统可以追溯到蝌蚪的摄食阶段(图2M和​和2N）2N） 巨细胞病毒-绿色荧光蛋白转基因胚胎背盖移植的研究(Marsh Armstrong等人，1999年). 这些结果表明囊胚变更-表达细胞产生大脑的大部分，并在树干区域产生底板和脊索爪蟾胚胎。

背侧动物帽被指定形成中枢神经系统

在胚胎学中，对细胞是否被指定形成特定组织的测试是将其与胚胎的其余部分分离培养。从注射了证书mRNA在第26期表达多种神经分子标记，而动物或腹壁移植体没有表达(图3A和​和3B）。三B） ●●●●。证书需要抑制中胚层形成；当制备相同的外植体时证书mRNA注射，检测到边缘区的中胚层污染（数据未显示）。神经分化也可以在缺乏证书mRNA，以避免中胚层污染。如所示图3C、 切下BCNE区域上半部分的小外植体，将其夹在一起，并在盐水中培养3天。夹心程序允许这些小外植物在培养中长时间存活。背侧BCNE外植体分化为组织型CNS，包括灰质和白质(图3D） 而类似的腹外胚层外植体分化为表皮(图3E） ●●●●。这些结果表明，背侧动物帽细胞已被指定在囊胚期形成中枢神经系统。

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Blastula Dorsal动物帽被指定形成中枢神经系统

（A） 实验图显示胚胎注射证书在囊胚处解剖动物帽的三个区域的mRNA，培养至26期，并进行RT-PCR处理。在这些样品中，外植体的尺寸为0.3 mm×0.3 mm。缩写：A，动物杆；D、 背区；五、 腹部动物帽。

（B） 动物帽片段的RT-PCR分析；注意，在没有中胚层的情况下，前脑标记物在背部碎片中表达(α-肌动蛋白)和内胚层(内皮素，Edd)差异化。缩写：A，动物杆；D、 背区；五、 腹部动物帽。

（C） 小动物帽三明治实验示意图；这些胚胎没有注射证书。在这种情况下，外植体的尺寸为0.15毫米×0.15毫米，与胚泡腔底部留有0.15毫米的间隙，以避免受到中胚层形成细胞的污染。将两个外植体的碎片夹在一起（外植体太小，无法通过卷曲愈合），并在1×Steinberg溶液中培养至第40阶段。缩写：VSW，腹面三明治；DSW，背三明治。

（D） 背侧动物帽外植体的组织切片（背侧三明治）。这些三明治分化为组织型前脑组织，包括白质和灰质（4/17）。缩写：DSW，背三明治；gm，灰质；wm，白质。

（E） 腹部动物帽三明治的组织切片。所有三明治分化为非典型表皮(n个= 20). 缩写：ae，非典型表皮；VSW，腹面三明治。

脑形成需要BCNE组织

为了测试大脑形成是否需要BCNE中心，我们首先删除了动物帽的腹侧或背侧区域。背侧区域的缺失，但腹侧动物帽的缺失，导致无头胚胎(图4A和​和4B）。4B） ●●●●。自爪蟾是研究得最好的脊椎动物胚胎之一，令人惊讶的是，此前从未报道过需要囊胚的一个区域来形成中枢神经系统。为了进一步研究，我们用不同的外胚层移植物替换了删除的片段。大脑缺损可以通过移植背侧而非腹侧的动物顶盖来挽救(图4C和​和4D）。4D） ●●●●。动物极点上的外胚乳无法救出烧毁的动物背帽(图4F） ●●●●。然而，来自氯化锂（LiCl）处理过的胚胎的类似动物极，其中β-连环蛋白稳定，BCNE基因转录激活，能够挽救头部形成(图4E） ●●●●。

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大脑形成需要背部动物帽

（A） 腹侧动物帽缺失（ΔV）产生正常胚胎。

（B–F）背侧动物帽缺失（ΔD）导致大脑前部结构丢失。背侧动物帽移植（C）和从氯化锂处理的胚胎中获得的动物杆移植（E）挽救了背侧动物冠缺失的无头表型，但腹侧动物帽植入（D）或动物杆植入（F）没有挽救。平均背前指数（DAI）为4.89（[A]n个=28），3.52（[B]n个=25），4.90（[C]n个=10），3.63（[D]n个=19），4.90（[E]n个=12）和3.50（[F]n个= 10).

（G） 将背侧动物帽移植到寄主胚胎的腹侧动物帽区域，可诱导弱次级轴（65.4%，n个= 26). 此处显示的胚胎是获得的最强轴之一。

（H） 腹部移植的BCNE活性被阻断变更-生产任务单(n个= 15).

尽管大脑发育有此要求，但移植到宿主囊胚腹侧的囊胚背侧动物帽只能形成微弱的次级轴(图4G） ●●●●。变更-MO，阻断Spemann移植物的活性(Oelgeschläger等人，2003年)，也包括灭活BCNE移植物(图4H） ●●●●。然而，与成熟的Spemann组织者的一个重要区别是，BCNE细胞移植到脊髓和肌肉的这些弱轴中进行自我分化，并且不能像Spemann组织者那样在邻近细胞中诱导中枢神经系统（数据未显示）。我们得出的结论是，动物背侧帽BCNE中心是大脑形成所必需的。然而，当移植到异位部位时，BCNE组织只有微弱的作用，不会诱导神经组织。

无中胚层的前中枢神经系统形成需要Chd和Nog

接下来我们研究了在缺乏中胚层和Spemann组织者的胚胎中形成的前中枢神经系统是否需要BCNE中枢信号。证书mRNA在4细胞期注射，BCNE区在64细胞期标记BDA(图5A；另请参阅图S1). 这些无中胚层的胚胎发育出前脑组织和显著的睫状体眼，这些都是由血统标记的BCNE细胞衍生而来的(图5B和​和5C）。5C） ●●●●。为了测试这些胚胎中是否需要Chd，我们注射了变更-2细胞阶段的MO。当Chd被击倒时，BCNE细胞发育成表皮而不是CNS(图5D和​和5E）。5E） ●●●●。大脑和眼睛的形成可以通过过度表达变更mRNA缺乏靶向区域变更-生产任务单(图5F和​和55G） ●●●●。

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无中胚层胚胎的中枢神经系统来源于BCNE细胞，需要Chd、Nog和β-连环蛋白

（A） 实验设计。中胚层诱导受到抑制的胚胎（通过注射600 pg证书mRNA进入植物极），并用苏木精-伊红染色或微量注射BDA谱系示踪剂标记BCNE区域。

（B和C）胚胎注射证书仅mRNA(n个= 40). 缩写：br，brain。

（D和E）胚胎注射17 ng变更-除外的生产任务单证书(n个= 21). 缩写：epi，表皮。

（F和G）17 ng变更-MO和认证证书，接着是100皮克变更mRNA与谱系示踪剂(n个= 19). 缩写：br，brain。

（H） 无中胚层胚胎中前部中枢神经系统标志物的表达需要Chd和Nog。RT-PCR分析证书mRNA注射胚胎于尾芽期26。前脑标志物(其他2)，眼睛(Rx2a（卢比）)，中后脑边界(英语2)，后脑(克罗克斯20)和水泥压盖(XAG公司)被注射变更-瞬间，诺格-MO或两者兼而有之。泛神经标志物（NCAM）和神经元标志物（N-微管蛋白）被部分抑制，后神经标志物霍克斯B9没有受到影响。α-肌动蛋白作为中胚层标志物来表明证书这些胚胎中胚层受阻ODC公司作为mRNA负载控制。The effects of the诺格-此处描述的MO可以通过全长进行救援诺格mRNA缺乏反义吗啉靶向的5′先导序列（数据未显示）。

（I和J）β-猫-MO（13.6纳克）与证书信使核糖核酸(n个= 15). 缩写：epi，表皮。

（K和L）救援β-猫-MO乘以800 pgβ-连环蛋白mRNA。缩写：br，brain。

（M和N）救援β-猫-100 pg的MO表型变更信使核糖核酸(n个= 8).

（O） β-连环蛋白引起的前神经诱导需要Chd。通过注射600 pg激活β-连环蛋白信号，在动物帽外植体中诱导神经和骨水泥腺标记物β-连环蛋白mRNA，dnGSK3号机组mRNA或LiCl处理（3-5道）。前脑标志物(Six3，Otx2)，眼睛(Rx2a（卢比）)，中后脑边界(英语2)，后脑(克罗克斯20)和水泥压盖(XAG公司)被抑制了变更-MO（6-8车道）。尽管未检测到后部神经标记物的抑制作用霍克斯B9和泛神经标记国家癌症管理局，神经元标记物N-微管蛋白被抑制。α-肌动蛋白和α-珠蛋白分别是背部和腹部中胚层标记，用于显示没有中胚层形成，以及ODC公司用作加载控制。

分子分析证实，无中胚层胚胎注射变更-MO不表达前部神经组织标志物，如Otx2、Rx2a、En2、，和克罗克斯20(图5H、 比较车道3和4）。然而，脊髓(霍克斯B9)或泛神经标记物（N微管蛋白、神经细胞粘附分子[NCAM]）仍在表达，表明只有前神经分化被变更-MO和后部神经诱导继续发生。我们还生成了Noggin反义吗啉寡核苷酸(诺格-MO）试剂，如变更-MO，抑制脑标记物(图5H、 车道5）。诺格-MO略弱于变更-MO，但即使两种吗啉结合也不能消除后部神经标记物(图5H、 车道6）。这些结果表明，缺乏中胚层和Spemann组织者的胚胎中形成的脑组织来源于BCNE细胞。在无中胚层胚胎中，前中枢神经系统的形成需要表达变更和诺格在未来的神经外胚层。

β-连环蛋白的神经诱导需要Chd

最近发现，微量注射β-连环蛋白mRNA能够诱导神经组织爪蟾动物帽(贝克等人，1999年). β-连环蛋白的稳定具有双重作用，抑制BMPs的转录(贝克等人，1999年;Leung等人，2003年)增加BMP拮抗剂的表达变更和诺格在囊胚动物帽中(Wessely等人，2001年). 接下来，我们测试了β-连环蛋白敲除对中枢神经系统分化的影响。如所示图5我和​和5J，5J、，β-猫-MO寡核苷酸(Heasman等人，2000年)阻塞组织学前脑和眼结构的形成证书无中胚层的胚胎。重要的是，前中枢神经系统的形成可以通过以下两种蛋白的过度表达来恢复β-连环蛋白或变更这些胚胎中的mRNA(图5K–5N） ●●●●。我们的结论是，在没有中胚层的情况下，大脑的形成需要早期的β-连环蛋白信号。

为了研究动物帽外植体中β-连环蛋白的神经诱导是否需要Chdβ-连环蛋白mRNA，显性负性糖原合成酶激酶-3(dnGSK3号机组)mRNA或氯化锂。这些处理在动物帽中诱导了多种神经标记物(图5O、 车道3–5）。微量注射变更-MO抑制前部神经标记物的表达(Six3、Otx2、Rx2a、En2)但不是后部或全神经的(霍克斯B9，NCAM）(图5O、 车道6–8）。结果表明，β-连环蛋白信号的神经诱导需要其下游靶基因的表达科尔丁。

Keller移植体的前神经诱导需要Chd

是的表达式变更囊胚处负责“平面”神经诱导信号的前瞻性神经外胚层(图6A） 早期工人描述的？为了研究这一点，我们使用了凯勒三明治（Keller and Danilchick 1988；Doniach等人，1992年; Ruiz i Altaba 1992），神经组织在发育过程中不接触下胚层(图6B） ●●●●。用谱系示踪剂标记BCNE区域表明凯勒三明治中含有表达变更在前瞻性的神经外胚层中(图6C） ●●●●。Keller三明治表达前中枢神经系统基因标记(图6D和​和6F）。6F） ●●●●。然而，从注射了变更-任务单无法表达其他2或克罗克斯20在前神经外胚层，同时保留其他2内胚层的表达（比较图6D和​和6E）。6E） ●●●●。标记分化神经元的N-微管蛋白表达被变更-MO位于CNS前部，但持续存在于预期脊髓中(图6F和​和6G；6G；结果总结于图6H和​和6I）。6一） ●●●●。这些结果表明，在缺少中胚层的Keller外植体中观察到的前中枢神经系统形成需要Chd。

Keller外植体的分子分析证实脑标记物被变更-MO，而神经和脊髓标志物受影响较小(图6J、 比较车道2和3）。和以前一样，后部神经诱导不需要Chd。这种后部神经分化的起源是由于成纤维细胞生长因子（FGF）信号(Hongo等人，1999年;Pera等人，2003年)，因为它可以在注射显性阴性FGF受体4a（dnFGFR4a）mRNA的外植体中被阻断(图6J、 泳道4和5）。重要的是，当中胚层诱导被证书信使核糖核酸(图6J、 车道6），并可能被变更-生产任务单(图6J、 车道7）。自无中胚层以来证书Keller外植体缺乏内胚层Spemann组织者，其Chd的唯一来源是BCNE中心。总之，这些实验表明，在凯勒外植体中观察到的前神经诱导，即所谓的“平面”诱导，是由变更-在囊胚期位于推测的神经外胚层的表达细胞。

Chordin和Cerberus在脑诱导中的协同作用

来自内胚层的垂直信号与BCNE中心在脑分化中合作吗？内中胚层分泌具有头部模式活性的生长因子拮抗剂，如Cer、Frzb-1、Crescent、Dickkopf-1、Chd和Nog(哈兰德2000;De Robertis等人，2000年). 其中一些分泌性拮抗剂在前内胚层表达，与小鼠前内脏内胚层同源(贝丁顿和罗伯逊2000). 我们选择研究这些拮抗剂中的一种，头部诱导剂Cer，因为它在Spemann组织者的前内胚层中表达(Bouwmeester等人，1996年)在Nieuwkoop中心，但不在BCNE中心（参见图1E） ●●●●。

最近的两项研究描述了吗啉反义寡核苷酸靶向证书。在两者中，证书头部发育似乎不需要单独进行，但与其他因素共同作用时会进行配合(Hino等人，2003年;Silva等人，2003年).非洲爪蟾基因经常有假等位基因，被认为是由两个不同基因之间的杂交产生的爪蟾进化过程中的物种(Kobel和Du Pasquier 1986年). 对EST数据库的检查表明证书等位基因存在，并且已发表的吗啉酸与之分别有三个和四个错配(图7A）(Silva等人，2003年;Hino等人，2003年). 因此，我们设计了一种新的吗啉基低聚体，证书-MO，针对两者拉埃维斯X.laevis假等位基因(图7A） ●●●●。证书-MO抑制了压头的形成爪蟾胚胎，可以通过证书mRNA缺乏靶向5′-先导序列（数据未显示）。

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中的双重保证机制爪蟾需要脊索蛋白和Cerberus的神经诱导

（A） 一个新的证书-MO是对两者的补充证书假等位基因，而其他作者报道了两个MO(Hino等人，2003年;Silva等人，2003年)只匹配一个等位基因，分别与其他等位基因有三个或四个不匹配。这个证书-本研究中使用的MO抑制完整胚胎中头部的形成（数据未显示），而其他两个则没有(Hino等人，2003年;Silva等人，2003年).

（B） 在8细胞期微注射背动物（FDA，绿色）和背植物（TRDA，红色）胚泡的32细胞和早期原肠胚（10.5期）的实验程序和细胞系。

（C和D）未注射胚胎。

（E和F）Dorsal-animal注射液，含8.5 ng变更-MO单独部分抑制头部形成；CNS前部可见绿色荧光。

（G和H）Dorsal-vegetal注射液，含17 ng证书-MO也部分抑制脑形成；前中胚层可见红色荧光。

（I和J）注入8.5 ng变更-MO背-动物和17 ng证书-MO背侧植物金属阻断了大脑的形成，但没有阻断脊髓和体节（组织学切片未显示）。

为了测试Cer和Chd是否合作，我们瞄准了证书-MO至背内胚层和变更-MO至8细胞期背神经外胚层(图7B） ●●●●。在使用的剂量下，微量注射变更-MO或证书-MO单独导致前部中枢神经系统部分减少(图7C–7H） ●●●●。然而，当神经外胚层和内胚层祖细胞被注射变更-MO和证书-MO分别表示未发生脑分化(图7我和​和7J）。7J） ●●●●。在组织切片中，这些胚胎缺乏大脑结构，但仍发育有脊髓、体节和脊索（数据未显示）。结果表明，大脑的形成需要不同细胞层中不同因子的部分重叠。预期神经外胚层需要Chd使细胞易形成前中枢神经系统，并与包括Cer在内的潜在内胚层的垂直信号协同作用(图8).

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BCNE和Nieuwkoop中心大脑形成的双重保证模型

布拉斯图拉变更-和诺格-表达细胞位于动物背部区域，而Nieuwkoop中心位于植物背部区域。在原肠胚，来自Nieuwkoop中心的前内胚层与预期的前中枢神经系统紧密并列。参见文本进行讨论。

讨论

此处的结果与以下CNS发展过程中的事件顺序一致爪蟾.卵子早期皮层旋转触发的背侧β-连环蛋白信号(Gerhart等人，1991年;De Robertis等人，2000年)在囊胚期诱导位于动物背部区域的一组细胞中表达抗BMP分子，如Chd和Nog（参见图8). 背侧前瞻性神经外胚层已经被指定在囊胚处形成中枢神经系统（参见图3). 值得注意的是，移植研究表明，BCNE中心是体内脑形成所必需的（参见图4). 这些背侧动物帽细胞在发育过程中的正常命运是产生前中枢神经系统、底板和脊索（参见图2). 我们注意到，我们以前的术语“预组织者”(Wessely等人，2001年)有些不足。由于BCNE移植物在移植后不能在邻近细胞中诱导中枢神经系统，因此缺乏组织者活性。

Nieuwkoop中心与BCNE中心在同一阶段出现，但在更多的植物细胞中（参见图8). Nieuwkoop中心表达分泌因子，如中胚层诱导Xnrs公司和证书在以后的发育过程中，形成了位于前中枢神经系统下方的内胚层（参见图8). 通过抑制假定神经外胚层中的Chd和内中胚层基质中的Cer（参见图7)，我们能够提供证据，证明不同胚层分泌的不同生长因子拮抗剂的部分重叠功能在中枢神经系统形成中相互作用。

神经诱导始于Blastula

在囊胚期，BCNE区域的基因表达会导致预期脑组织本身的神经倾向。当预期的神经外胚层移植到囊胚上并在没有中胚层的情况下培养时，它可以发育成组织型神经组织（参见图3D） ●●●●。一旦Nieuwkoop中心在背部中胚层诱导Spemann组织者，内胚层分泌生长因子拮抗剂混合物。这些Spemann组织者分子需要Nodal-related信号才能在原肠胚产生(Agius等人，2000年;Wessely等人，2001年). 这些内胚层因子包括Cer（结节、Wnt和BMP信号的抑制剂）；抗Wnts如Frzb-1、Crescent和Dickkopf，抗BMP如Follistatin、Chd和Nog(De Robertis等人，2000年). 一些分子，如Chd和Nog，在囊胚的背侧动物帽和原肠胚的Spemann组织者中均表达，而其他分子，如Cer，仅在Nieuwkoop中心及其内中胚层后代中表达。在两栖动物中，原肠胚背唇在移植到宿主原肠胚时能够诱导完整的中枢神经系统，这被认为是原肠胚发生神经诱导的迹象。我们现在表明，Chd和Nog在母细胞β-儿茶酚胺信号触发的囊胚期的短暂表达是大脑形成所必需的。当来自潜在内中胚层的额外信号被抑制结节信号或阻止凯勒背侧外植体内卷化阻止时，这一要求变得明显。我们的结论是爪蟾神经诱导开始于中胚层之后不久的假定神经外胚层。这与最近的其他工作一致爪蟾(贝克等人，1999年;游戏和筛选2001;Wessely等人，2001年).

神经诱导中的冗余信号

多种分泌生长因子拮抗剂参与中枢神经系统诱导(哈兰德2000;De Robertis等人，2000年)，他们的活动可能是多余的。在鼠标中，变更和诺格突变体有正常的神经板，但在变更 -/-;诺格 -/-胚胎，前脑发育失败(Bachiller等人，2000年). 在爪蟾和斑马鱼，Chd在整个胚胎中的丢失导致动物仍然能够形成前中枢神经系统，尽管其体积缩小了(Schulte-Merker等人，1997年;Oelgeschläger等人，2003年). 这与此处揭示的对Chd的强烈需求形成对比，当时神经诱导由单个信号中心驱动爪蟾在无中胚层的胚胎中(证书-囊胚背侧动物细胞是Chd的唯一来源，而CNS前向分化可被变更-MO（参见图5). Spemann组织者移植物的神经诱导活性也需要Chd(Oelgeschläger等人，2003年). 多种神经诱导分子，如上述生长因子拮抗剂，已被确定，并可能补偿完整胚胎中Chd的损失。此外，位于背侧信号中心以外的其他信号，如FGF和胰岛素样生长因子（IGF）可能参与神经诱导（见下文）。

来自预期神经外胚层和内胚层的冗余信号是否也在其他脊椎动物的神经诱导中起作用？对于鸡胚来说，这似乎是可能的。小鸡变更最初表达于Koller镰刀前方外胚层中央细胞的未受精卵中(Streit等人，1998年)，一个可能对应于爪蟾囊胚变更-表达区。小鸡外胚层这一区域的后代有助于形成前脑，并在发育过程中向前移动。小鸡的后代变更-表达脑祖细胞一直在组织者面前迁移，组织者位于原始条纹的尖端，具有尾状化的影响(Foley等人，2000年). 在斑马鱼中，缺乏Nodal信号的突变胚胎在缺乏中胚层组织者的情况下仍会形成脑组织并表达变更(Gritsman等人，1999年). 在小鼠胚胎中，原肠期的移植实验支持不同胚层在脑诱导中的作用(Tam和Steiner 1999年). 然而，小鼠的表达变更和诺格仅从早期原始条纹阶段开始分析(Bachiller等人，2000年). 需要研究这些BMP拮抗剂在预胚胎或预移植小鼠胚胎中的表达，或β-连环蛋白最早的核定位，以确定是否有一个区域与爪蟾囊胚变更-哺乳动物胚胎中存在表达区。

脊索动物的神经传导信号

在两栖动物中，默认的神经诱导模型提出，外胚层中表达的BMP会引起表皮诱导。当动物帽细胞被分离时，它们会被神经化（由Weinstein和Hemmati-Brivanlou，1999年). 当外源性BMP添加到分离的动物帽细胞中时，表皮分化得以恢复。目前对抑制Chd、Nog和Cer的吗啉酸的研究强调了BMP信号调节在爪蟾。BCNE中心出现在中囊胚后不久，当内胚层信号被抑制时，它是前中枢神经系统形成所必需的。在没有Chd和Nog（例如。，图5H） ●●●●。显性负性FGF受体4a可以阻断这种后部神经组织的形成（参见图6J） ●●●●。在爪蟾，FGF和IGF信号能够诱导动物帽子的神经分化(Hardcastle等人，2000年; Pera等人，2001年；Richard Parpaillon等人，2002年)已知晚期典型Wnt信号抑制前脑形成(Kiecker和Niehrs，2001年).

在鸡胚和海鞘胚胎中，目前的神经诱导模型强调了FGF和Wnt在神经诱导中的作用，并不再强调BMP调节的作用(Wilson和Edlund 2001;斯特恩2002;Bertrand等人，2003年). 我们无法在这里深入讨论不同生物中不同信号通路的相对重要性（参见Wilson和Edlund 2001). 然而，很明显，多种途径在神经发育中相互合作。例如，在鸡胚中，将Wnt或BMP拮抗剂应用于表皮和CNS交界区域的细胞，可扩张神经板，而FGF信号抑制神经外胚层中BMP4的表达。此外，中间水平的FGF拮抗剂的抗神经作用可以通过添加鸡变更(Wilson和Edlund 2001). 比较两种神经诱导的困难之一爪蟾而其他脊索动物则关注事件的不同时间。现在，我们发现在中胚层之后的预期神经外胚层中需要β-连环蛋白触发的关键信号。因此，神经诱导过程似乎始于所有脊索动物的囊胚(Wessely等人，2001年;Wilson和Edlund 2001;斯特恩2002;Bertrand等人，2003年). 此外，新的分子机制正在被发现，有助于解释不同的信号通路——如FGF、IGF和抗BMP——如何在发育过程中整合。最近发现，酪氨酸激酶受体（如FGF和IGF的受体）通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化抑制BMP途径效应蛋白Smad1(Pera等人，2003年;Sater等人，2003年). BMP拮抗剂Chd的神经诱导需要额外增强FGF和IGF信号提供的Smad1抑制(Pera等人，2003年). 这种分子机制证明了迄今为止被认为完全独立的信号通路可能在胚胎细胞中整合的一种方式(马萨古埃2003). 多年来，脊索动物胚胎的初级神经诱导一直是一个积极的研究领域，我们可以预计在可预见的未来这一研究将继续下去。

外胚层在两栖类神经诱导中的作用

外胚层在两栖动物神经诱导中的作用一直备受争议(斯佩曼1938;霍特弗雷特和汉堡1955;Nieuwkoop和Koster 1995). 基因标记研究爪蟾注意到背部外胚层易受中胚层神经诱导(Sharpe等人，1987年;London等人，1988年)但对任何特定基因的要求尚未得到解决。此外，已知背侧动物帽对中胚层诱导物激活素的反应更好(索科尔和梅尔顿1991). 这些早期的发现现在可以被重新解释为反映了早期β-连环蛋白信号的影响，该信号诱导基因表达，如变更、编号、Xnr3、，和西亚莫伊斯。变更不仅在原肠胚形成期间的组织区表达，在囊胚形成期间也在动物背帽区表达，这是神经规范所必需的。

在这项研究中，我们提供了证据表明，假设的神经板材料可以在没有中胚层基质的情况下分化为中枢神经系统。胚胎中的脑形成需要BCNE中心，但需要Cerberus等内胚层信号的配合。早期工作人员在缺陷实验的基础上提出了原肠胚前瞻性神经外胚层对神经板形成的要求(戈特勒1925;莱曼1928). 然而，这些结果存在争议(霍特弗雷特1933;斯佩曼1938;霍特弗雷特和汉堡1955;汉堡1988;Nieuwkoop和Koster 1995)中胚层Spemann组织者的垂直诱导被认为在两栖类神经诱导中起着重要作用。在神经诱导实验胚胎学的多年研究中，对未来神经外胚层的作用仍未被认识的一个可能的解释是，与Spemann的组织者不同，BCNE中心在移植到异位部位时缺乏诱导活性。研究单个基因功能的新工具的可用性，例如β-连环蛋白，Chd，和证书-现在已经提供了证据表明，外胚层和内胚层信号都是诱导胚胎发育所必需的爪蟾。

材料和方法

胚胎操作

爪蟾通过体外受精获得的胚胎在0.1×改良Barth培养基中培养(Sive等人，2000年). 对于BCNE移植和缺失实验，在1×Steinberg溶液中进行解剖(Sive等人，2000年). BCNE移植物是从囊胚腔底部正上方的动物背盖上分离出的0.3 mm方形。在第9早期（室温下受精后6.75–7.25小时），在广泛的外胚层运动开始之前，即大细胞囊胚期（第8期）之后仅一次分裂时，将其切除，并且可以通过动物帽的厚度和细胞大小进行监测。胚胎在1×Steinberg’s溶液中培养，直到愈合（0.5–1 h），然后变为0.1×Barth’s溶液。胚胎期根据Nieuwkoop和Faber（1994年).

凯勒三明治是在10月初准备的。使用不锈钢钳子，从背中线，从背唇到动物极，以30°的角度切除原肠胚的背侧部分。将两个外植体夹在1 x Steinberg溶液中培养12 h，用于原位杂交，1 d用于RT-PCR分析，2 d用于形态学分析。对于RT-PCR分析，从五个Keller外植体、五个动物帽或单个胚胎中收集RNA。RT-PCR条件和引物以及全山原位杂交的方案在http://www.hhmi.ucla.edu/derobertis/index.html.

世系追踪

为了绘制BCNE后代的命运图，开发了一种改进的谱系追踪方法。在H中向胚胎注射1-4 nl的1%BDA（美国俄勒冈州尤金市分子探针公司）2O和培养的外植体或胚胎在MEMFA中固定至少1小时(Sive等人，2000年). 随后，胚胎在70%乙醇中放置24小时，在100%乙醇中放置1小时，在100%异丙醇中放置1 h，在100%二甲苯中放置12–16小时，在65°C的石蜡中放置1个小时，然后进行包埋。我们发现在二甲苯中隔夜孵化可以改善早期胚胎的切片，因为早期胚胎富含蛋黄。切片在8–10μm处切割，并在100%二甲苯、100%乙醇和70%乙醇中脱蜡2分钟。接下来，将切片在结合缓冲液（100 mM Tris–HCl，150 mM NaCl[pH7.5]）中清洗两次5分钟，并在含有链霉亲和素偶联碱性磷酸酶的结合缓冲液中培养（瑞士巴塞尔罗氏），室温下稀释1:5000过夜。然后，用结合缓冲液清洗载玻片两次，用反应缓冲液清洗一次（100 mM Tris–HCl，100 mM NaCl，50 mM MgCl2，pH 9.5）孵育5分钟，并在4°C的黑暗中与含有10%BM紫溶液（罗氏）的反应缓冲液在Coplin罐中孵育过夜。通过在Stop溶液（100 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 7.4）中培养，停止染色，切片在100%甲醇中脱水并完全风干，然后安装在Vectashield培养基中（Vector Laboratories Inc.，美国加利福尼亚州伯灵盖姆）。在一些核实验中lacZ公司mRNA（R.Harland的亲缘礼物）、荧光素葡聚糖胺或德克萨斯红葡聚糖胺被用作谱系示踪剂。

RNA注射

为了产生合成mRNA，质粒pCS2-认证证书，pCS2型-变更，pCS2型-β-连环蛋白，和pCS2-dnGSK3号机组如前所述，用NotI线性化并用SP6 RNA聚合酶转录(Piccolo等人，1999年). 以下数量的mRNA用于微量注射：600 pg（150 pg在4细胞期四次进入植物区）认证证书，100pg（50pg两次进入4细胞期动物背区）变更，800pg（400pg在8细胞期两次进入动物背区）β-连环蛋白，600pg（在8细胞期，300pg两次进入动物背区）dnGSK3号机组mRNA。

吗啉寡核苷酸

吗啉寡聚物如下：变更-MO1（5′-ACG TTC TGT CTC GTA TAG TGA GCG T-3′）和变更-MO2（5′-ACA GCA TTT TTG TGG TTG TCC CGA A-3′）(Oelgeschläger等人，2003年);诺格-MO（5′-TCA CAA GGC ACT GGG AAT GAT CCA T-3′）（本工作）；β-猫-MO（5′-TTT CAA CCG TTT CCA AAG CAG G-3′）(Heasman等人，2000年);证书-MO（5′-ACT TGC TGT TCC TGC ACT GTG C-3′）（本作品）；和对照MO（5′-CCT CTT ACC TCA GTT ACA ATT TAT a-3′）(Oelgeschläger等人，2003年). 重新悬浮吗啉寡聚物以制备1 mM储备溶液（SS），然后在无菌水中进一步稀释，得到工作溶液：变更-MO解决方案(变更-MO1-SS：变更-MO2-SS:H型2O=1:1:6），β-猫-MO解决方案(β-猫-MO-SS:H型2O=1:4），诺格-MO解决方案(诺格-MO-SS:H型2O=1:1），证书-MO解决方案(证书-MO-SS:H型2O=1:1），对照-MO溶液（对照-MO-SS:H2O=1:1），以及变更-生产任务单/诺格-MO解决方案(变更-MO1-SS：变更-MO2-SS：诺格-MO-SS:H型2O=1:1:4:10）。在2细胞期共注射8 nl（2倍4 nl或4倍2 nl）吗啉溶液，或在8细胞期注射4 nl（两倍2 nl）吗啉液。

支持信息

图S1

使用改进的BDA谱系追踪方法可以在64个细胞阶段可靠地标记BCNE区域：

（A–H）微量注射单个32细胞卵裂球并不能忠实地再现原肠胚BCNE移植物的谱系（与图2B和​和2D）。2D） ●●●●。值得注意的是，D1的谱系包括Nieuwkoop中心的一部分，并参与原肠胚的前内胚层。这张32细胞图与之前发布的命运图基本一致(Dale and Slack 1987年;Bauer等人，1994年); 观察到的微小差异可以通过我们选择的定期切割胚胎批次来解释(克莱因1987)带有紧密粘附的小动物卵裂球。缩写：AE，前内胚层。

（I–L）图显示了B1的下女儿和C1的上女儿在64细胞期（I）的注射，该图可靠地确定了BCNE在9期（J）、11期（K）和36期（L）的后代。箭头表示胚孔。缩写：fp，楼板；不，脊索。

（4.39 MB TIF）。

致谢

我们感谢D.D.Brown博士的转基因X·莱维斯；H.Okamoto博士、D.Wilkinson博士、R.Harland博士和D.Kimelman博士负责DNA构建；U.Tran和A.Cuellar提供技术援助；以及E.Neufeld、L.Zipursky、S.Millard、E.Pera和C.Coffinier对手稿的评论。这项工作得到了美国国立卫生研究院（HD21502-18）和霍华德·休斯医学研究所的支持，EMDR是该研究所的研究员。

缩写

β-猫-卫生官员 β-连环蛋白吗啉寡核苷酸
BCNE公司囊胚科尔丁-和诺金-表达区
BMP公司骨形态发生蛋白
证书-卫生官员 Cerberus公司吗啉寡核苷酸
证书 Cerberus-短
变更-卫生官员 科尔丁吗啉寡核苷酸
中枢神经系统中枢神经系统
FGF公司成纤维细胞生长因子
葛兰素史克3糖原合成酶激酶-3
IGF公司胰岛素样生长因子
氯化锂氯化锂
卫生官员反义吗啉寡核苷酸
MAPK公司丝裂原活化蛋白激酶
国家癌症管理局神经细胞粘附分子
诺格-生产任务单 诺金吗啉寡核苷酸
ODC公司鸟氨酸脱羧酶
不锈钢储备溶液
Xnr公司 爪蟾节点相关

利益冲突。提交人声明，不存在利益冲突。

作者贡献。HK和EMDR构思并设计了实验。HK和EMDR进行了实验：HK、OW和EMDR分析了数据。HK、OW和EMDR提供了试剂/材料/分析工具。香港和EMDR撰写了这篇论文。所有作者都在这项工作上合作。

学术编辑：Christof Niehrs，Deutsches Krebsforschungszentrum

工具书类

  • Agius E，Oelgeschläger M，Wessely O，Kemp C，De Robertis EM.内胚层结节相关信号和中胚层诱导爪蟾.发展。2000;127:1173–1183. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bachiller D、Klingensmith J、Kemp C、Belo JA、Anderson RM等。小鼠前脑发育需要组织因子Chordin和Noggin。自然。2000;403:658–661.[公共医学][谷歌学者]
  • Baker JC、Beddington RS、Harland RM、Wnt信号输入爪蟾胚胎抑制bmp4的表达并激活神经发育。基因发育。1999;13:3149–3159. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bauer DV，Huang S，Moody SA。Spemann组织者的卵裂期起源：原肠胚形成之前和期间卵裂球克隆的运动分析爪蟾.发展。1994;120:1179–1189.[公共医学][谷歌学者]
  • 贝丁顿RS，罗伯逊EJ。哺乳动物轴突发育和早期不对称。单元格。2000;96:195–209.[公共医学][谷歌学者]
  • Bertrand V、Hudson C、Caillol D、Popovici C、Lemaire P。海鞘胚胎中的神经组织由FGF9/16/20诱导，通过母体GATA和Ets转录因子的组合发挥作用。单元格。2003;115:615–627.[公共医学][谷歌学者]
  • Bouwmeester T、Kim S、Sasai Y、Lu B、De Robertis EM。Cerberus是一种头部诱导分泌因子，表达于Spemann组织者的前内胚层。自然。1996;382:595–601.[公共医学][谷歌学者]
  • Dale L，Slack JM.非洲爪蟾早期胚胎中胚层的区域规范.发展。1987;100:279–295.[公共医学][谷歌学者]
  • De Robartis EM，Larraín J，Oelgeschläger M，Wessely O。Spemann组织的建立和脊椎动物胚胎的模式。Nat Rev基因。2000;1:171–181. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Doniach T、Phillips CR、Gerhart JC。非洲爪蟾发育中中枢神经系统前后向模式的平面诱导.科学。1992;257:542–545.[公共医学][谷歌学者]
  • Foley AC，Skromne I，Stern CD。协调前脑诱导和模式的不同模型：成纤维细胞减数分裂的双重作用。发展。2000;127:3839–3854.[公共医学][谷歌学者]
  • Gamese JT，Sive H.年推测神经外胚层的早期前后分裂爪蟾.机械开发。2001;104:21–36.[公共医学][谷歌学者]
  • Gerhart J，Doniach T，Stewart R.纽约：Plenum出版社。纽约；1991年组织爪蟾组织者。收件人：Keller RE，编辑。肠胚形成：运动、模式和分子；第57-77页。[谷歌学者]
  • 吉尔伯特旧金山。连续性和变化：神经诱导的范式转换。国际开发生物学杂志。2001;45:155–164.[公共医学][谷歌学者]
  • Goerttler K.Urodelen市内Medullaranlage的模具。Roux's Arch Entw Mech公司。1925;106:503–541.[公共医学][谷歌学者]
  • Grainger RM。胚胎晶状体诱导：脊椎动物组织测定的光线照射。趋势Genet。1992;10：349–355。[公共医学][谷歌学者]
  • Gritsman K，Zhang J，Cheng S，Heckscher E，Talbot WS，et al.EGF-CFC蛋白独眼针头对淋巴结信号传导至关重要。单元格。1999;97:121–132.[公共医学][谷歌学者]
  • 汉堡V.牛津与纽约：牛津大学出版社；1988年，实验胚胎学遗产。汉斯·斯佩曼和组织者；208页。[谷歌学者]
  • Haramoto Y、Tanegashima K、Onuma Y、Takahashi S、Sekizaki H等人。热带爪蟾结节相关基因3调节BMP信号：前区的一个重要作用。开发生物。2004;265:155–168.[公共医学][谷歌学者]
  • Hardcastle Z、Chalmers AD、Papalopulu N.FGF-8通过FGFR-4a刺激神经元分化，并干扰中胚层诱导爪蟾胚胎。当前生物量。2000;23:1511–1514.[公共医学][谷歌学者]
  • Harland R.神经诱导。当前操作基因开发。2000;10:357–362.[公共医学][谷歌学者]
  • Harland R，Gerhart J.Spemann组织者的形成和功能。年收入细胞开发生物。1997;13:611–667.[公共医学][谷歌学者]
  • Heasman J，Kofron M，Wylie C.Beta-catenin早期分离的信号活动爪蟾胚胎：一种新的反义方法。开发生物。2000;222:124–134.[公共医学][谷歌学者]
  • Hino J、Nishimatsu S、Nagai T、Matsuo H、Kangawa K等。BMP-3b和cerberus需要协调，以形成头部爪蟾胚胎。开发生物。2003;260:138–157.[公共医学][谷歌学者]
  • Holtfreter J.Die totale Exobalusulation，eine Selbtablösung des Ektoderms vom Entomesoderm。Entwicklung und funktitonelles Verhalten神经损失器官。Roux's Arch Entw Mech公司。1933;129:670–793.[公共医学][谷歌学者]
  • Holtfrieter J，汉堡诉纽约：哈夫纳；1955.胚胎发生：渐进分化-双歧杆菌。收件人：Willier BH，Weiss PA，Hamburger V，编辑。发展分析；第230-296页。[谷歌学者]
  • Hongo I、Kengaku M、Okamoto H.FGF信号转导和前脑神经诱导爪蟾.开发生物。1999;216:561–581.[公共医学][谷歌学者]
  • Keller RE非洲爪蟾早期胚胎发育.Meth细胞生物学。1991;36:61–113.[公共医学][谷歌学者]
  • Keller R，Danilchik M.非洲爪蟾原肠胚形成过程中收敛和延伸的区域表达、模式和时间.发展。1988;103:193–209.[公共医学][谷歌学者]
  • Kiecker C，Niehrs C.Wnt/β-catenin信号的形态原梯度调节爪蟾.发展。2001;128:4189–4201.[公共医学][谷歌学者]
  • Klein SL。第一个卵裂沟在爪蟾胚胎。开发生物。1987;120:299–304.[公共医学][谷歌学者]
  • Kobel HR，Du Pasquier L.多倍体遗传学爪蟾.趋势Genet。1986;2:310–345. [谷歌学者]
  • 莱曼有限公司。Die Bedetung der Unterlargerung für Die Entwicklung der Medullarplatte von Triton公司。Roux's Arch Entw Mech公司。1928;113:123–171.[公共医学][谷歌学者]
  • Lemaire P、Garrett N、Gurdon JB。的表达克隆Siamois公司一爪蟾同源异型盒基因在囊胚背植物细胞中表达，能够诱导完整的次生轴。单元格。1995年；81:85–94.[公共医学][谷歌学者]
  • Leung TC、Bischof J、Söll I、Niessing D、Zhang D等。博佐克直接抑制bmp2b型转录和介导最早的背腹不对称性bmp2b型斑马鱼的表达。发展。2003;130:3639–3649.[公共医学][谷歌学者]
  • 刘易斯·怀特。两栖动物眼睛发育的实验研究。Am J Anat公司。1904年；三:505–536. [谷歌学者]
  • London C，Akers T，Phillips CR。原肠胚形成前，非洲爪蟾胚胎中表皮特异性标记Epi1的表达被指定。开发生物。1988;129:380–389.[公共医学][谷歌学者]
  • Marsh Armstrong N，Huang H，Berry DL，Brown DD.非洲爪蟾转基因的种系传递.美国国家科学院程序。1999;96:14389–14393. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • MassaguéJ.Smad和MAPK通路的整合：重新访问链接和链接器。基因发育。2003;17:2993–2997.[公共医学][谷歌学者]
  • Nieuwkoop PD，Faber J.纽约：Garland出版社；1994年非洲爪蟾正常表.[谷歌学者]
  • Nieuwkoop PD，Koster K.两栖动物早期发育中的垂直与平面诱导。发展增长差异。1995年；37:653–668.[公共医学][谷歌学者]
  • Oelgeschläger M、Kuroda H、Reversade B、De Robertis EM。在爪蟾胚胎。开发单元。2003;4:219–230.[公共医学][谷歌学者]
  • Pera EM、Ikeda A、Eivers E、De Robertis EM。神经诱导中通过Smad1磷酸化整合IGF、FGF和抗BMP信号。基因发育。2003;17:3023–3028. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Piccolo S、Agius E、Leyns L、Bhattacharyya S、Grunz H等。头部诱导剂Cerberus是Nodal、BMP和Wnt信号的多功能拮抗剂。自然。1999;397:707–710. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Poznanski A，Keller RE。平面和早期垂直信号在Hoxb-1表达模式中的作用爪蟾.开发生物。1997;184:351–366.[公共医学][谷歌学者]
  • Richard-Parpaillon L，Héligon C，Chesnel F，Boujard D，Philpott A。IGF途径通过抑制Wnt信号传导调节头部形成爪蟾.开发生物。2002;244:407–417.[公共医学][谷歌学者]
  • Ruiz i Altaba A.诱导和图案中的平面和垂直信号爪蟾神经系统。发展。1992;116:67–80.[公共医学][谷歌学者]
  • Ruiz i Altaba A.神经板的诱导和轴向模式：平面和垂直信号。神经生物学杂志。1993;24：1276–1304。[公共医学][谷歌学者]
  • Sater AK，El-Hodiri HM，Goswami M，Alexander TB，Al-Sheikh O，et Al.MAP激酶拮抗BMP-4信号的证据爪蟾轴确定和神经规范。区别。2003;71:434–444.[公共医学][谷歌学者]
  • Saxén L，Toivonen S.London：学术出版社；1962.初级胚胎诱导；271页。[谷歌学者]
  • Schulte-Merker S、Lee KJ、McMahon AP、Hammerschmidt M。斑马鱼组织者要求弦恐龙.自然。1997;387:862–863.[公共医学][谷歌学者]
  • Sharpe CR、Fritz A、De Robertis EM、Gurdon JB。后神经分化的同源盒标记显示了神经诱导中预先确定的重要性。单元格。1987;50：749–758。[公共医学][谷歌学者]
  • Silva AC、Filipe M、Kuerner KM、Steinbeisser H、Belo JA。内生Cerberus活动是前头部规格所必需的爪蟾.发展。2003;130：4943–4953。[公共医学][谷歌学者]
  • Sive HL、Grainger RM、Harland RM。早期开发非洲爪蟾实验室手册。纽约冷泉港：冷泉港实验室出版社。2000:338. [谷歌学者]
  • Sokol S，Melton DA爪蟾激活素诱导的动物极性细胞。自然。1991;351:409–411.[公共医学][谷歌学者]
  • Spemann H.über Korrelationen，摘自《八月Entwicklung des Auges》。Verh Anat Ges.公司。1901年；15:61–79. [谷歌学者]
  • 斯佩曼·H·纽黑文：耶鲁大学出版社；1938.胚胎发育和诱导；401页。[谷歌学者]
  • Spemann H，Mangold H。通过植入不同物种的组织物诱导胚胎原基。Roux's Arch Entw Mech公司。1924;100:599–638.重印并翻译于《国际开发生物学杂志》（2001）45:13–38。[公共医学][谷歌学者]
  • Stern CD。神经系统的诱导和初始模式——鸡胚进入现场。当前操作基因开发。2002;12:447–451.[公共医学][谷歌学者]
  • Streit A、Lee KJ、Woo I、Roberts C、Jessell TM等。Chordin调节原始条纹的发育和诱导的神经细胞的稳定性，但不足以在鸡胚中进行神经诱导。发展。1998;125:507–519.[公共医学][谷歌学者]
  • Takahashi S、Yokota C、Takano K、Tanegashima K、Onuma Y等爪蟾Nieuwkoop中心。发展。2000;127:5319–5329.[公共医学][谷歌学者]
  • Tam PPL，斯坦纳KA。早期原肠胚组织和小鼠胚胎前胚层组织协同作用形成的前向模式。发展。1999;126:5171–5179.[公共医学][谷歌学者]
  • Weinstein DC，Hemmati-Brivanlou A.神经诱导。年收入细胞开发生物。1999;15:411–433.[公共医学][谷歌学者]
  • Wessely O，Agius E，Oelgeschläger M，Pera EM，De Robertis EM.无中胚层的神经诱导：β-catenin依赖于分泌型BMP拮抗剂在囊胚期的表达爪蟾.开发生物。2001;234:161–173. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wessely O，Kim JI，Geissert D，Tran U，De Robertis EM.年Spemann组织者形成分析爪蟾cDNA宏阵列检测胚胎。开发生物。2004新闻界。[公共医学][谷歌学者]
  • Wilson S，Edlund T.神经诱导：走向统一机制。自然神经科学。2001;4:1161–1168.[公共医学][谷歌学者]
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