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基因发育。2004年5月1日；18（9）：1035–1046。
数字对象标识：10.1101/gad.1176104
预防性维修识别码：项目经理406293
PMID：15105378

SNF2样基因PASG断裂小鼠的生长迟缓和早衰表型

孙林泉,1 大卫·W·李,1 张广庚,1 肖伟红,三 埃里克·拉贝,1 阿兰·米克尔,2 苗登顺,4 大卫·L·胡索,5和罗伯特·J·阿切西1,6
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

基因组完整性的不完全维持被认为是衰老的一个重要原因。在这里，我们通过证明PASG的破坏为这一假设提供了支持(最小二乘法)，一种促进DNA甲基化的SNF2样因子，导致全球低甲基化、发育迟缓和早衰表型。PASG突变小鼠表现出生长迟缓和过早衰老的迹象，包括出生体重低、发育不良、头发灰白和脱落、皮肤脂肪沉积减少、骨质疏松、驼背、恶病质和过早死亡。来自PASG突变胚胎的成纤维细胞表现出复制性衰老表型。PASG突变小鼠和成纤维细胞均显示衰老相关肿瘤抑制基因（如p16）的表达显著增加INK4a公司，这与启动子甲基化无关，但与p16负调控因子bmi-1的下调有关INK4a公司这些研究表明，PASG对于正确维持正常生长和寿命所需的DNA甲基化和基因表达模式至关重要。PASG突变小鼠为研究衰老以及在发育和出生后生活中调节表观遗传模式的机制提供了一个有用的模型。

关键词：PASG、，最小二乘法，SMARCA6，甲基化，基因组不稳定，老化，衰老

了解衰老和癌症易感性的生物学机制仍然是生物医学的一个重要目标。大多数细胞的有限寿命被认为是细胞衰老或复制衰老过程的结果(坎皮西1996；Sherr和DePinho 2000)这被认为是由于对各种细胞应激的生理反应，包括DNA损伤和复制(海弗利克1965；Hasty等人，2003年)、端粒侵蚀(夏普莱斯和德皮尼奥2004)和异常激活的癌基因(Lundberg等人，2000年；坎皮西2001). 这种生理反应似乎通过激活抑癌基因（如p16）触发生长抑制INK4a公司，第19页农业研究基金、p53和p21(Alcorta等人，1996年；Kiyono等人，1998年；Stein等人，1999年；Ramirez等人，2001年；Randle等人，2001年；Rheinwald等人，2002年；Schmitt等人，2002年；Tyner等人，2002年). 最近的数据表明，bmi-1在某些组织中维持组织内稳态是必需的，部分原因是它抑制了诱导细胞衰老和细胞死亡的基因(Jacobs等人，1999年；Itahana等人，2003年；Lessard和Sauvageau 2003年; Park等人。2003,2004). 此外，尽管DNA和染色质的表观遗传修饰在正常发育和癌症形成中的重要性已经得到证实(Li等人，1992年；Okano等人，1999年；李2002；罗伯逊2002；Eden等人，2003年；Gaudet等人，2003年；Jaenisch和Bird 2003)，与衰老的关系尚未得到广泛研究(Issa 1999年；Bandyopadhyay和Medrano 2003年；邓恩2003；理查森2003).

在培养的老化细胞和动物中观察到基因组DNA的5-甲基胞苷含量降低(威尔逊和琼斯1983；Wilson等人，1987年；Barbot等人，2002年). 与未经处理的对照细胞相比，用DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂（如5-氮杂-2′-脱氧胞苷）处理培养细胞会导致寿命缩短(霍利迪1986；Fairweather等人，1987年). 反义寡核苷酸抑制DNMT导致DNA低甲基化和衰老样表型，由p16表达增加介导INK4a公司人成纤维细胞和癌细胞中的p21抑癌基因(Fournel等人，1999年；Young and Smith 2001年). 原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和人类癌细胞中DNA甲基转移酶的破坏也与细胞增殖显著降低和异常基因表达有关(Jackson-Grusby等人，2001年；Rhee等人，2002年). 这些体外数据表明，降低DNA中5-甲基胞苷的水平可能是导致衰老的重要分子机制，这是霍利迪近20年前提出的一个概念(霍利迪1985). 然而，在基因组低甲基化背景下研究过早衰老的体内研究在很大程度上尚未探索。

最近的研究已将依赖ATP的SWI/SNF染色质重塑蛋白与基因组表观遗传修饰的调节联系起来，后者反过来通过调节转录、复制和基因组稳定性促进胚胎发生、细胞增殖和肿瘤发生(Jeddeloh等人，1999年；Gibbons等人，2000年；Meehan等人2001；李2002；罗伯逊2002；Jaenisch和Bird 2003). PASG（增殖相关SNF-2样基因）或最小二乘法（淋巴细胞特异性解旋酶）编码一种SNF-2样蛋白，该蛋白已被证明有助于全球基因组甲基化(Lee等人，2000年；Dennis等人，2001年). 术语最小二乘法最初的研究结果表明它是以淋巴细胞特异性解旋酶的形式表达的(Jarvis等人，1996年). 随后的研究表明，PASG(最小二乘法)在快速分裂的细胞或组织中普遍表达(Raabe等人，2001年)与细胞增殖有关(盖曼和穆格2000；Raabe等人，2001年；Fan等人，2003年). 该遗传位点被称为SMARCA6(Lee等人，2000年).Lsh（磅/平方英寸）-/-删除了包含解旋酶结构域I、Ia和部分II的外显子6和7的小鼠显示出围产期死亡率，480只小鼠中只有一只存活至出生后5天(Geiman等人，2001年). 新生儿的体重比野生型同窝婴儿低22%，并且有肾小管异常(Geiman等人，2001年). 然而，由于无效动物在出生后数小时内死亡，因此无法得出其他结论。进一步调查PASG的功能后果(最小二乘法)在表观遗传模式和正常生长发育方面，我们通过同源重组，删除包含解旋酶结构域III、IV和部分II的外显子10、11和12，生成了一只携带PASG亚型突变的小鼠。结果表明，靶向性破坏PASG不仅导致基因组低甲基化和受抑制基因的重新表达，而且还导致过早衰老，这与增殖减少、复制衰老增加以及基因表达模式改变有关，尤其是与衰老相关的基因，如p16INK4a公司和bmi-1。

结果

靶向破坏PASG和异常基因组甲基化

通过删除外显子10-12（包括保守的解旋酶结构域II、III、IV），通过同源重组产生PASG表达中断的小鼠(图1A). Southern blot验证了PASG的成功靶向性(图1B)，Northern杂交(图1C)，并通过Western blot分析(图1D). 尽管在杂合子（PASG）中观察到具有预测长度的截短型mRNA（456-bp cDNA被删除）+/-)和纯合子（PASG-/-)小鼠(图1C)用兔抗PASG C末端序列的抗体进行Western blots，未观察到缺失152个氨基酸的短型PASG蛋白，该抗体不在蛋白的缺失区域(图1D)，表明截短的蛋白质可能不稳定或低于检测水平。为了通过富集PASG进一步测试这种可能性，我们用抗PASG抗体免疫沉淀PASG-最小二乘法抗体，然后用兔抗PASG C末端序列抗体对免疫沉淀蛋白进行Western blot(Raabe等人，2001年). 这些结果表明，纯合子和杂合子小鼠表达了预测大小的截断PASG蛋白，尽管其表达水平较低(图1E).

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通过同源重组靶向性破坏PASG。(A类)靶向载体的基因组图和预测的野生型和破坏的等位基因。带数字的黑盒子在上面它们代表21个PASG外显子。罗马数字表示假定的七螺旋结构域，其中域I包含ATP结合位点，域II包含DExH盒。探针表示用于Southern印迹分析的靶区外部的5′基因组探针。(B)Southern印迹分析显示PASG基因的预期靶向破坏。基因组DNA经SpeI消化后与5′基因组探针杂交。8.5kb片段表示野生型等位基因，5.4-kb片段代表突变等位基因。(C)从E14.5胚胎纯化的mRNA的Northern blot分析显示杂合和纯合小鼠中PASG转录物的短形式（2.0kb）。探针是来自PASG ORF C末端的1.0kb cDNA片段。(D类)对PASG蛋白的西方分析表明，在PASG中未检测到截短的PASG蛋白质-/-动物和PASG+/-.箭头指示预测的PASG缩写的位置。对MEF的核提取物进行电泳分离，转移用于Western blotting，并将其暴露于针对PASG C末端区域的选定肽制备的兔抗血清中，如材料和方法中所述。野生型和预测短型PASG的分子量分别为95.2 kD和77.4 kD。(E类)PASG的免疫沉淀和Western blot分析表明，PASG中表达了低水平的截断PASG蛋白-/-和PASG+/-MEF公司。箭头表示PASG的预测缩写形式。MEF细胞裂解物用抗-最小二乘法根据材料和方法中的描述，用针对PASG C末端区域的选定肽制备的兔抗血清进行抗体和Western分析。

量化这些PASG中的甲基化水平-/-小鼠，我们使用MspI消化、5′末端标记和甲基胞嘧啶和胞嘧啶的薄层色谱分离直接测定基因组DNA中的5-甲基胞嘧啶(图2A). 在野生型和PASG中，甲基胞嘧啶在胚胎第13.5天（E13.5）胚胎的总DNA中的百分比分别为54%和36%-/-胚胎分别减少33%。在野生型和PASG的E17.5肝DNA中也观察到类似的结果-/-胚胎中甲基胞苷含量分别为56%和32%（下降43%）。杂合小鼠的甲基胞苷含量与野生型小鼠相似（数据未显示）。

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PASG公司-/-胚胎和小鼠表现出基因组低甲基化、基因重新表达、生长迟缓和早期死亡。(A类)通过薄层色谱法对基因组DNA中甲基胞嘧啶的定量显示PASG中的甲基胞嘧啶水平降低-/-妊娠第13.5和17.5天的胚胎DNA。用MspI消化E13.5小体或E17.5肝脏中等量的基因组DNA，在5′端标记，用核酸酶P1再消化生成5′-脱氧单核苷酸，用薄层色谱法分离并用荧光成像仪定量。甲基胞嘧啶与总胞嘧啶的比率表明所有CCGG位点的甲基化水平。HpaII消化液不应产生甲基胞苷斑点，它们可作为对照，表明检测的特异性。(B)出生后第15天，用HpaII对小鼠胸腺中微小卫星着丝粒DNA重复序列的探针进行甲基化敏感限制性内切酶消化，发现PASG中存在低甲基化-/-老鼠。(C)出生后第15天，使用小鼠肾脏IAP探针用HpaII进行甲基化敏感限制性内切酶分析。低分子量片段表示脱甲基限制位点，而高分子量片段表示甲基化限制位点。(D、 E类)PASG中IAP表达的Northern blot分析-/-小鼠和MEF在突变小鼠中显示IAP转录物的重新表达(D类; 出生后第15天）和成纤维细胞(E类)与对照动物或细胞中没有表达相比。(F类)63 PASG的存活曲线-/-30窝老鼠。(G公司)PASG的生长曲线-/-胚胎发育迟缓，到妊娠第15.5天左右，发育迟缓具有统计学意义。每个数据点都来自至少三窝幼崽。(H（H）)存活PASG的生长曲线-/-小鼠表现出严重的出生后生长迟缓。(我)PASG中的葡萄糖水平降低50%-/-将小鼠与出生后的杂合突变或野生型动物进行比较。通过将全血涂在“一键式”纸条（Ultra、Lifespan）上来测定血糖水平。每个数据点至少有三只老鼠。

为了评估PASG突变小鼠中特定DNA序列的甲基化是否也受到影响，我们使用甲基化敏感限制性内切酶检测了微小卫星着丝粒和胞内A颗粒（IAP）重复序列的甲基化度(图2B、C). 在这两种情况下，PASG中都观察到显著的低甲基化-/-老鼠(图2B、C). Northern blot分析进一步表明，IAP表达水平在PASG中诱导并高水平表达-/-将小鼠和MEF与杂合和野生型小鼠进行比较，其中IAP基因甲基化，转录受到抑制(图2D，E). 这一发现表明，由于PASG表达中断导致的DNA低甲基化可导致转录去表达。

PASG公司-/-小鼠出现生长迟缓和过早衰老

杂合小鼠与野生型（PASG）无法区分+/+)与PASG杂交所生后代中的一胎和～20.5%（205个中的42个）+/-小鼠为PASG-/-这一比例略低于预期的25%，可能是因为母亲在出生后立即吃下死去的后代。大约60%的PASG-/-小鼠在出生后不久或几天内死亡，其余40%存活数周(图2F). 虽然形态正常，但新生儿PASG-/-小鼠明显小于野生型和杂合子同窝小鼠。重量差异首先出现在E12.5，然后增加了E15.5(第页≤ 0.05;图2G、H). PASG公司-/-新生小鼠的体重比正常窝友低25%，但到2周龄时，它们的体重比野生型动物低70%(图2H). 由于限制葡萄糖的可用性可能会限制生长因子维持细胞活力的能力(Vander Heiden等人，2001年)，出生后连续测量PASG中的血糖水平-/-小鼠和同窝对照。我们发现出生后PASG会出现低血糖-/-老鼠(图2I)新生儿和出生后第15天动物的血糖浓度为52%(第页≤0.002）和50%(第页≤0.0003），尽管有足够的母乳喂养和胃中有奶，但仍低于其室友。除了低出生体重和生长迟缓（图。2G，高,​，3A），3A级)出生后生活的特点是早期出现老化特征的表型变化，包括头发灰白、秃顶、脂肪沉积减少、步态不稳、恶病质和后凸畸形(图3B-D).

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PASG公司-/-小鼠过早衰老。(A类)新生小鼠。PASG公司-/-小鼠（箭头）除了体型较小外，形态正常。(B)PASG公司-/-小鼠（如第17天所示）迅速出现白发和秃顶。(C)PASG公司-/-第15天的小鼠体重减轻，肌肉萎缩，恶病质，脂肪组织深度减少。(D类)幸存的PASG-/-15日龄小鼠出现后凸畸形。

组织病理学检查显示许多突变新生小鼠的弥漫性肺泡不张和小气道缺乏通气(图4A). 这些结果表明，在围产期，肺部扩张减少，可能导致这些小鼠呼吸衰竭和死亡。由于表面活性蛋白表达减少可能导致肺泡不张，我们通过Northern blot分析检测了表面活性蛋白A、B、C和D的表达，但在E17.5胚胎、新生儿或出生后第14天的PASG中，这些表面活性剂编码转录物没有显著减少-/-小鼠（数据未显示）。其他器官，如胸腺、脾脏、大脑、肝脏、胃、肠道和肾脏，在PASG中表现大致正常-/-新生小鼠。出生后第14天，PASG的皮肤-/-小鼠出现明显异常，表现为表皮角化过度，皮下脂肪组织几乎完全缺失(图4B). 到2周大时，胸腺的大小适度缩小，其特征是严重的淋巴耗竭，尤其是在皮层(图4C). PASG肾脏-/-小鼠体型稍小，肾小管变性和扩张，上皮细胞衰减，嗜酸性胞浆内包涵体积聚(图4D；Geiman等人，2001年); 这些变化被描述为特定年龄的变化(Hasty等人，2003年).

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PASG的组织学变化-/-小鼠表现出多器官异常和骨骼缺陷。(A类)新生儿PASG肺弥漫性肺泡不张-/-与对照组同窝小鼠肺泡扩张正常（100×）相比。(B)PASG公司-/-皮肤角化过度，基本上完全没有皮下脂肪组织（100×）。（ep）表皮；（de）真皮；皮下脂肪组织；（m） 肌肉。(C)2.5周龄PASG的胸腺-/-小鼠比对照小鼠小，以淋巴细胞严重耗竭和散在性淋巴细胞坏死（100×）为特征。(D类)PASG肾脏-/-与对照小鼠（400×）的肾脏相比，小鼠表现出肾小管变性和扩张、上皮细胞衰减以及年龄特异性嗜酸性细胞质内含物（箭头）的积聚。(E类)对15日龄小鼠胫骨的von Kossa染色显示，PASG中骨骺的二次骨化延迟-/-动物。在野生型小鼠中钙化的小梁骨完全形成，但在突变型小鼠中仅观察到钙化软骨。PASG中皮质和小梁体积均减小-/-小鼠（25×）。(F类)15日龄动物胸椎体的von Kossa染色显示PASG的皮质和小梁体积减小-/-小鼠（25×）。

PASG中观察到骨发育明显延迟，伴有骨质减少和骨质疏松-/-老鼠。突变小鼠的股骨和胫骨变短(图3D)与野生型同胞相比，它们的骨密度降低，骨骺较小（图。​（图3D，三维,4E、F). PASG中胫骨骨骺的继发骨化也会延迟-/-老鼠(图4E). 钙化软骨主要见于PASG-/-在野生型小鼠中观察到正常钙化小梁骨(图4E、F). 与野生型同胞相比，空白小鼠胫骨和胸椎体的皮质和小梁体积均减少(图4E、F).

PASG-/-基因型与体内外复制衰老和体外核型不稳定性增加有关

确定PASG中的器官-/-显示衰老分子标记的小鼠，检测不同器官中β-半乳糖苷酶的表达(Dimri等人，1995年). 帕斯卡-/-小鼠在其许多组织中强烈表达β-半乳糖苷酶，如在肾脏中所证明的那样(图5A)和胸腺(图5B). β-半乳糖苷酶在年龄匹配的正常窝友的组织中没有显著表达。这些结果表明，PASG-/-组织发生早期衰老。同样，从PASG导出的MEF-/-胚胎表现出扁平和扩大的形态，这是衰老表型的特征(图5C、D)与野生型MEF相比，衰老相关β-半乳糖苷酶的表达显著增强(图5C).

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衰老生物标志物β-半乳糖苷酶的表达增加，并且在PASG中BrdU的掺入减少-/-小鼠和/或MEF。(A、 B类)PASG中发现β-半乳糖苷酶阳性细胞-/-肾皮质小管(A类)和胸腺(B). 正常窝友的组织没有显示出这种衰老标记物的增加表达。(C)PASG公司-/-与野生型MEF相比，MEF显示β-半乳糖苷酶阳性细胞增加（第5代）。(D类)PASG公司-/-与野生型MEF（第5代）的正常形态相比，MEF表现出扁平和扩大的形态，与衰老表型一致。(E类)PASG公司-/-与PASG相比，14天龄小鼠的胸腺细胞显示BrdU掺入显著减少+/+窝友（PASG中为6.1±0.8%-/-小鼠与PASG中的15.5±1.4%相比+/+老鼠，第页< 0.001,n个= 4).

为了确定生长迟缓和体内衰老表型是否是由于细胞增殖减少所致，我们检测了小鼠体内的BrdU掺入。对14日龄小鼠胸腺的检查显示BrdU在PASG中的掺入显著降低-/-老鼠与同窝老鼠的比较(图5E).

为了更好地确定导致突变动物表型变化的可能机制，我们检测了来自突变和野生型胚胎的初级成纤维细胞的生长特征。突变胚胎早期传代MEF的生长速度大约是PASG的两倍+/-或PASG+/+成纤维细胞(图6A). 为了量化PASG缺陷MEF的增殖能力，我们计算了一段时间内的种群倍增能力。PASG的MEF-/-胚胎在第6代后表现出持续的增殖能力下降。然而，这种增殖能力的下降可以通过SV40大T抗原转化来挽救(图6B). 大T抗原转化的野生型和PASG-/--衍生的MEFs能够在裸鼠体内形成肿瘤（8个部位中有4个部位注射了106帕斯卡-/-细胞和八分之三的细胞使用野生型细胞），后一种MEF保持相同程度的DNA低甲基化（数据未显示）。这些结果表明，PASG-/-MEF的增殖潜能显著降低，这可能通过p53/Rb通路的失活而恢复。衰老细胞的另一个特征是对电离辐射的抵抗力增强。为了评估PASG在DNA损伤修复中的作用，我们将MEF暴露于不断增加的电离辐射中。PASG公司-/-与野生型MEF相比，细胞表现出更强的抗辐射性，这与衰老表型一致(图6C).

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PASG公司-/-表型与生长潜力降低、复制衰老和p16表达改变有关INK4a公司，第19页农业研究基金、bmi-1、p53和p21。(A类)MEF的生长动力学（第1代）表明，野生型、杂合型和纯合突变型MEF的细胞数增加到初始细胞数的五倍的时间分别为3.6、3.8和6.0天。显示了每种基因型的两个细胞系的平均值（一式三份）。(B)PASG的人口倍增率较低-/-然而，MEF可以被SV40大T抗原拯救。箭头表示转染含SV40大T抗原的逆转录病毒上清液的时间。显示了每种基因型的两个细胞系的平均值（一式三份）。(C)PASG公司-/-MEF（第3段）比对照MEF更耐γ辐射。与每个基因型的未辐照培养物相比，存活细胞的数量是辐射剂量的函数。显示了每种基因型的两个细胞系的平均值（一式三份）。(D类)PASG公司-/--衍生MEF显示循环细胞显著减少。用BrdU连续标记MEFs（第5代）48小时，然后通过流式细胞术进行分析以确定主动循环细胞的百分比。显示了每个基因型的两个细胞系的平均值。(E类)PASG中非整倍体增加-/-MEF随时间变化。PASG公司-/-MEF显示二倍体(n个=40），但与相对稳定的野生型MEF相比，晚期传代的DNA含量严重异常，染色体数目增加。(F类)p16水平增加INK4a公司PASG肾脏中观察到p53、p21和bmi-1水平降低-/-老鼠。(G公司)p16水平增加INK4a公司和第19页农业研究基金在PASG中观察到bmi-1水平下降-/-通道2（P2）和通道5（P5）处的MEF。

为了分析PASG缺乏对细胞周期的影响，我们测量了BrdU暴露48小时后非同步增长的MEF细胞群中复制细胞的百分比。与对照MEF相比，PASG减少50%-/-MEF正在细胞周期中积极进展(图6D). BrdU脉冲标记2h后，在PASG缺陷MEF（第3代）中评估细胞周期检查点的完整性。PASG在G1、S和G2/M中的细胞相对分布类似-/-短BrdU脉冲标记后立即进行MEF和控制；PASG和-/-和PASG+/+MEF 8小时后重新进入S阶段(表1). 用6 Gyγ射线照射后，两种PASG-/-对照细胞表现出辐射诱导的S期延迟和G2/M期阻滞，随后从初始阻滞中恢复并在照射后8小时重新进入G1期(表1). 这些结果表明，PASG中G1/S和G2/M DNA损伤检查点基本上完好无损-/--缺乏细胞，PASG缺乏细胞以类似于控制细胞的方式完成细胞周期。结果进一步证明，增殖能力降低是PASG复制能力降低的结果-/-MEF，不是由于细胞周期进展中的缺陷。为了确定细胞凋亡是否导致增殖能力降低，MEF用FITC-膜联蛋白V和碘化丙啶双重染色。在PASG中未观察到凋亡人群的显著增加-/-MEF与野生型细胞的比较（数据未显示）。因此，细胞凋亡不是MEF增殖能力降低和突变小鼠生长迟缓的主要决定因素。

表1。

PASG中的细胞周期进展−/− 和控制MEF

BrdU贴标签后的时间（小时）
未辐照
已辐照
基因型02468122402468122448
GI（%）+/+18621506577641421724624862
+/−17619496468571102722556563
−/−15426536972581742620656061
S（%）+/+56521410121417605897571313
+/−625220111220196463102三91711
−/−57471881017205363128三51312
G2（%）+/+26416640239202743918871303925
+/−214262412412242537909175371826
−/−284958402211253133878877312627

在BrdU标记2h后，再暴露6Gyγ射线，对MEF进行分析。顶行表示BrdU脉冲后的小时数。使用流式细胞术分析量化循环人群中G1、S和G2/M期细胞的百分比（BrdU阳性细胞）。数据来自两个得出类似结果的实验之一。

通过用碘化丙啶标记细胞并进行流式细胞术分析，测定不同代次MEF的DNA含量，研究复制衰老表型与基因组不稳定性的关系。DNA图谱显示，在第5代，野生型和突变型MEF都保持基本正常的染色体DNA含量。然而，在第10段中，PASG的很大一部分-/-MEF开始显示异常高的DNA含量和染色体数目(图6E). 在油道34处，PASG-/-MEFs逃避衰老介导的增殖停滞（数据未显示），并显示出大于4N的DNA含量(图6E). 通过测定第5代和第34代的核型，进一步研究了这种基因组不稳定性。对来自两个独立细胞系的每个基因型的40个核型进行了检测。在第5代，95%以上的野生型和突变核型都是二倍体。在第34代，野生型核型的主要部分（70%）是二倍体，其余30%是非整倍体，染色体数目从60到80不等。然而，PASG核型中的细胞百分比和非整倍体程度显著增加-/-90%以上的MEF染色体数目异常，范围从60到120(图6E). 值得注意的是，PASG中的染色体-/-MEF形态正常，无明显罗伯逊易位。因此，PASG功能的缺失可能会导致基因组不稳定性的增加，这可能是由于染色体分离受损。虽然端粒长度缩短也与衰老有关(夏普莱斯和德皮尼奥2004)，当我们使用荧光原位杂交测量端粒长度时，从PASG中观察到端粒含量没有显著差异-/--与对照组（数据未显示）相比，衍生骨髓细胞（出生后第15天）或MEF（第5代）。对胸腺和骨髓等组织来源的体内DNA含量的检测并不能揭示非整倍体。有几种可能解释这一结果。例如，可能有一小部分细胞会发展为非整倍体，但通过体内机制被消除，或者PASG的寿命延长-/-动物的长度不足以避免异常克隆的衰老和扩张，也不足以避免需要额外的基因突变，而这在培养条件下更容易发生。

衰老相关抑癌基因积累增加和bmi-1表达降低是PASG的特征-/-动物和MEF

衰老是细胞对各种生理类型的应激反应而显示的最终表型状态，这些应激导致细胞增殖下降，通常由肿瘤抑制基因（如p16）的表达增加和激活介导INK4a公司，第19页农业研究基金、p53和p21(Lundberg等人，2000年；坎皮西2001). 其中最突出的是p16INK4a公司(Lundberg等人，2000年). 与此一致，我们发现p16的表达INK4a公司PASG显著增加-/-小鼠与野生型小鼠比较，野生型小鼠几乎检测不到其表达(图6F). PASG中p53和p21表达水平也上调-/-小鼠与野生型小鼠的比较(图6F)，而p19农业研究基金PASG略有增加-/-尽管野生型小鼠中其表达水平较低(图6F). 确定p16是否上调INK4a公司由于启动子CpG去甲基化而诱导表达，我们对p16的5′启动子区进行了测序INK4a公司来自亚硫酸氢盐修饰DNA的甲基化特异PCR产物，如前所述。对25个CpG位点进行了分析，结果表明在两种PASG中均未甲基化-/-和野生型动物（数据未显示）。p16的上调INK4a公司因此不能归因于低甲基化和p16的替代机制INK4a公司因此，对表达进行了检查。

Ets和Id1的表达，p16的调节因子INK4a公司转录(Ohtani等人，2001年)通过Western blot分析检测，结果表明这些基因产物在PASG中的表达没有显著差异-/-和野生型小鼠（数据未显示）。然而，p16的另一个重要负调控因子bmi-1INK4a公司也与细胞增殖和衰老的变化有关(Jacobs等人，1999年；Park等人，2004年)，在PASG组织中减少约50%-/-小鼠与对照动物的比较(图6F).

与这些体内结果一致，p16的表达INK4a公司PASG也显著增加-/-中小企业基金(图6G)同时bmi-1也随之下降。p19的表达农业研究基金PASG较高-/-MEF与野生型MEF相比，p53和p21表达水平的变化不太明显(图6G)因此，PASG表达的中断和随后的复制性衰老表型与肿瘤抑制基因表达的变化密切相关。p16的诱导INK4a公司PASG中的表达-/-负性抑制剂bmi-1的表达减少可能在一定程度上介导了小鼠。

讨论

衰老是一种细胞不再具有增殖能力，并伴有异常基因表达和形态变化的状态。为了在动物的一生中保持组织内稳态，干细胞已经发展出严格的调节机制来自我更新、分化和防止过早衰老(Park等人，2004年). 在本研究中，PASG-/-小鼠表现出早衰的表型特征。BrdU掺入减少、衰老相关抑癌基因积累、衰老相关β-半乳糖苷酶增加以及体内与年龄相关的表型是早衰的特征。然而，我们不能排除其他因素，如增殖缺陷、生长迟缓、肺发育异常和低血糖，也可能导致PASG的总体表型-/-动物。

在这项研究中，我们证明了PASG（一种SNF2样因子）的靶向破坏会导致基因组低甲基化和基因表达改变，这与小鼠的发育生长迟缓和过早衰老以及PASG的复制衰老有关-/-MEF和组织。这些结果首次将小鼠生长迟缓和过早衰老的表型与表观遗传失调联系起来，这是由于SNF2样因子PASG的破坏所致。尽管最小二乘法-/-在之前的模型中，小鼠的出生体重较低，出生后数小时内死亡率基本一致，因此无法进行详细的出生后分析(Geiman等人，2001年). 目前尚不清楚为什么我们的PASG占很大比例-/-小鼠存活数周，但一种可能性是，低水平截短的PASG蛋白可能部分挽救了先前报告中所见的胚胎空表型(Geiman等人，2001年). 检测这种低水平表达的截短mRNA和蛋白产物支持这一结论。此外，PASG的这种靶向性缺失删除了保守的SNF2解旋酶结构域II、III和IV，表明PASG这一区域对其正常功能至关重要。然而，我们的PASG延长了生存期-/-动物为详细研究产后PASG的体内功能提供了重要机会。我们的PASG-/-模型还允许我们证明，观察到的生长迟缓和过早衰老的特征是肿瘤抑制基因（如p16）的深度上调INK4a公司，第19页农业研究基金p53和p21以及bmi-1的下调。其中，p16INK4a公司上调最为显著；这种增加的表达不是由于启动子甲基化的改变，而是与bmi-1表达减少有关，bmi-1是p16的负调控INK4a公司启动子。我们的发现是PASG的过早老化-/-小鼠与复制性衰老相关显著延长了先前的工作(威尔逊和琼斯1983；霍利迪1985；Wilson等人，1987年)重要的是，衰老与表观遗传模式改变和异常基因表达有关。

基因组完整性的维持已成为细胞存活和寿命的主要因素，异常导致端粒缩短或DNA损伤和修复与衰老、生长迟缓和衰老密切相关(Hasty等人2003；夏普莱斯和德皮尼奥2004). 由WRN DNA解旋酶突变引起的沃纳综合征患者基因组不稳定与早期衰老和癌症易感性相关(Hasty等人，2003年). 此外，复制DNA甲基化模式的错误可能会破坏基因组完整性(Eden等人，2003年；Gaudet等人，2003年)导致基因表达异常，细胞增殖减少(Jackson-Grusby等人，2001年)和异常胚胎发育(Li等人，1992年；Okano等人，1999年). 例如，DNMT1缺陷ES细胞和具有低形态DNMT1（DNMT1芯片/-)基因型已被证明是导致染色体不稳定和肿瘤形成率增加的原因(Chen等人，1998年；Eden等人，2003年；Gaudet等人，2003年). 免疫缺陷、染色体不稳定和面部异常是ICF综合征的特征，是DNMT3b基因突变的结果(Xu等人，1999年). 在动物和MEF中观察到类似的发现，Suv39h组蛋白甲基转移酶被破坏(Peters等人，2001年)和mSds3，功能性mSin3/HDAC共升压复合物的基本成分(David等人，2003年). 这些重要发现表明，正常的表观遗传调控模式对维持基因组完整性至关重要。以及我们在PASG中观察到的着丝粒低甲基化-/-这些观察强烈表明，低甲基化和基因组不稳定可能是导致过早衰老的基本机制。

体外观察到与年龄相关的整体低甲基化(威尔逊和琼斯1983)和体内(Singhal等人，1987年；Wilson等人，1987年；Drinkwater等人1989年；Barbot等人，2002年). 与DNA甲基化的总体降低相反，在正常的衰老过程中，单个基因的甲基化可能会逐渐增加(Issa 1999年；邓恩2003). 正常衰老过程中的基因组低甲基化和位点特异性高甲基化也可以与癌细胞中的发现相类似(琼斯和拜林2002；邓恩2003). 据推测，导致衰老的机制可能会保护年轻生物免受急性死亡和癌症的影响，但会使它们在以后的生活中容易发生体细胞的恶性转化（Campisi1996,2003). 这种假设在缺乏Brca1的小鼠中得到了证实，Brca1参与DNA损伤修复和乳腺癌(曹等人，2003). 异常的低甲基化也被证明有助于基因组不稳定和Dnmt肿瘤的诱导芯片/-老鼠(Eden等人，2003年；Gaudet等人，2003年). 在这方面，值得注意的是，在约40%-60%的急性白血病患者中观察到PASG C末端半部分保守基序的75-nt框架内缺失，已知这种缺失会导致类似酵母蛋白的显性阴性突变，这表明PASG在白血病发生中具有潜在作用(Lee等人，2000年).

尽管p16沉默INK4a公司肿瘤中的表达通常由启动子高甲基化介导(Jones和Baylin 2002)，p16的调节INK4a公司衰老细胞中的表达尚不清楚。我们的结果显示p16没有差异INK4a公司PASG之间启动子区甲基化-/-野生型动物以及突变或野生型成纤维细胞。相反，结果表明，PASG中bmi-1的表达减少了50%-/-组织。Bmi-1是Polycomb/trixthorax组（Pc-G/trx-G）蛋白的一员，已被证明是p16的负调控因子INK4a公司是一个高度保守系统的成员，在发育和细胞增殖过程中调节表观遗传记忆和转录抑制(Jacobs等人，1999年；鸟2002；Lessard和Sauvageau 2003年；奥兰多2003; Park等人。2003,2004). PASG调节bmi-1表达的机制尚待确定。

通过导致正常基因表达模式的放松调控，表观遗传模式的改变可能是衰老的一个重要的潜在分子机制。更有趣的是，转录阻遏物（如bmi-1）的调节改变可能为DNA甲基化的改变提供一种替代机制，以调节下游基因的表达，在建立和/或维持复制性衰老表型中发挥重要作用(Park等人，2004年). 其他机制也可能独立或协同促成PASG中观察到的衰老表型-/-动物，如染色质改变、结构和功能(Peters等人，2001年；David等人，2003年). 尽管这些观察对理解衰老和可能的癌症易感性的机制具有重要意义，但它们也提出了有关旨在改变癌症表观遗传模式的治疗策略的基本问题(卡普夫和琼斯2002；Schmitt等人，2002年；Kahlem等人，2004年).

材料和方法

PASG缺陷小鼠的产生

利用129/SvJ文库中3.65-kb的EcoRI基因组片段构建PASG靶向载体，该片段克隆到pKO Scrambler NTKV-1906载体（Stratagene）的5′臂；将6.5kb的XbalI基因组片段克隆到载体的3′臂中。利用该载体，含有外显子10、11和12，包括解旋酶结构域II、III和IV的7.126-kb基因组DNA被用作阳性选择标记的1.6-kb pGKneo盒所取代(图1A).

将靶向载体电穿孔成129/SvJ ES细胞，然后在含有G418/GCV的培养基中进行筛选。靶向频率为4/298（1.3%）。将4个阳性克隆分别注射到C57BL/6J囊胚中，产生嵌合小鼠。将嵌合动物与正常C57BL/6J小鼠杂交后，两个克隆成功地通过生殖系将突变的PASG等位基因传递给后代。杂合动物维持在129/SvJ/C57BL/6J混合背景下。在129/SvJ/瑞士黑人背景中观察到类似的表型（数据未显示）。

Southern和Northern印迹分析

用不同的限制性内切酶消化10微克DNA，产物在琼脂糖凝胶中电泳分解，转移到尼龙膜上，并与特定的放射性标记探针杂交。用Trizol（Invitrogen）分离的15微克总RNA在甲醛琼脂糖凝胶中进行电泳分离，转移到尼龙膜上，并与放射性标记探针杂交。IAP探针与gag编码区同源（nt 1570-1899，GenBank登录号：。M17551型；Walsh等人，1998年). 描述了小型卫星着丝粒探测器(Dennis等人，2001年). RNA负载量归一化为GAPDH表达。

亚硫酸氢盐修饰DNA的甲基化和直接测序

如前所述，在CCGG位点直接测量甲基胞苷(Li等人，1992年). 第16页INK4a公司发起人（GenBank登录号。U47108型)使用包含25个CpG位点的757-bp MSP产物进行扩增，并将其连接到TA克隆载体中，然后按照前面所述进行测序(Frommer等人，1992年). 对两只小鼠中的20个克隆进行了分析。Sense引物从nt88到112:AGTTGTATAGAATTTAGTGA；反义序列为nt845-819：CCATACTCCAAAACTCCTC。

小鼠胚胎成纤维细胞分析

将妊娠第13.5天的牺牲胚胎进行机械分离和胰蛋白酶消化，然后通过100μM网格过滤。MEF（2×104将每孔细胞数）一式三份置于24孔板中，细胞进行胰蛋白酶化，用台盼蓝染色，每24小时计数一次。用3T9法测定MEF的增殖动力学，用9×105细胞在6厘米的组织培养孔中培养，每三天传代一次。使用以下公式计算每一代的种群倍增：log2（细胞收获/细胞播种）。使用BrdU（10μM，Sigma）进行脉冲标记，5×105将MEFs（传代3）接种到6厘米的培养皿中，并在MEFs附着后将BrdU直接加入培养基中2小时(Nussenzweig等人，1996年). 对于连续标记，MEF（第5代）被镀上100μM BrdU并标记48 h(Frank等人，1998年). 根据制造商（BD Pharmagen）的说法，用70%乙醇固定细胞，并用FITC-结合的抗BrdU抗体和碘化丙啶染色。使用Becton和Dickson FACS机器，使用Cellquest程序采集和分析至少10000个事件。用0、2、4、6或8Gy的γ射线照射MEF，测量辐射敏感性137铬源的剂量率为0.7Gy/min。培养5d后，收集MEF，用台盼蓝染色并计数。SV40大T抗原转化是通过感染来自产生细胞系⌀2-SV40的病毒上清液进行的(Jackson-Grusby等人，2001年). 用标准方法从秋水仙碱染色和吉姆萨染色中期染色体扩散中分析MEF的核型。

小鼠BrdU标记

将BrdU（100mg/kg体重）腹膜内注射到14天大的小鼠中。注射后2小时处死小鼠；用抗BrdU抗体（BD Pharmagen）对胸腺单细胞悬液进行染色，并用Becton和Dickson FACS机器进行分析。

组织学分析

组织固定在10%中性缓冲福尔马林中，石蜡包埋，切成5μm的切片，并用苏木精和伊红染色。移除长骨和椎体，并将其固定在PLP固定剂中（2%多聚甲醛、0.075 M L-赖氨酸、0.01 M高碘酸钠）。脱钙的股骨远端、胫骨近端和椎体植入LR白色丙烯酸树脂（London resin Company Ltd.）中，并在超微切片机上切取1-μm切片。用von Kossa染色程序对这些切片进行矿物含量染色，并用甲苯胺蓝进行复染(Miao等人，2001年). 如前所述，在pH 6.0下测量β-半乳糖苷酶活性(Dimri等人，1995年). 定量荧光原位杂交用于测定端粒长度(Meeker等人，2002年).

免疫印迹分析和免疫沉淀

如前所述，从器官或培养细胞中提取全细胞蛋白(Li等人，1992年). 根据制造商的协议（Pierce），使用NE-PER核和细胞质提取试剂盒制备核蛋白提取物。根据ECL检测（Amersham）的标准程序进行蛋白质印迹分析。用1:2000稀释的兔抗血清检测PASG蛋白，抗血清针对不在缺失区的PASG C末端的肽序列(Raabe等人，2001年). 使用了以下主要抗体：p16（M-156，Santa Cruz），p19农业研究基金（NOVUS）、bmi-1（H-99，Santa Cruz）、p21（Ab-6，癌基因）、p53（Ab-7，癌基因。辣根过氧化物酶结合的抗兔或抗鼠抗体（Promega）用作次级抗体。

收集MEF细胞并在Triton X-100裂解缓冲液（150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、1%Triton X-100-蛋白酶抑制剂）中进行裂解。PASG蛋白用抗-最小二乘法抗体（N-16），并用针对PASG C末端区域肽序列的兔抗血清检测。

致谢

我们感谢Steven Baylin博士和Kam-Wing Jair博士的批判性审查和有益的讨论，感谢Jeffrey Whitsett博士提供编码肺表面活性剂蛋白的cDNA，感谢Angelo DiMarzo博士提供端粒测量的批判式指导，感谢R.Jaenisch博士提供SV40大T生产细胞系，感谢Ms。Jessica Hicks负责端粒原位杂交，Xiao Nan Li、Wen Yong Chen和Ming Zhou Guo博士负责专家技术援助。我们感谢儿童癌症基金会、希金学者基金会和国家卫生研究院的支持。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。

注意事项

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期为http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.1176104。

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文章来自基因与发育由提供冷泉港实验室出版社