Oncotarget公司。2014年5月；5(9): 2635–2647.
谷氨酰胺酶2负调控人肝癌中PI3K/AKT信号转导并显示抑瘤活性
,1,4 ,1,4 ,1 ,1,2 ,1 ,1,2 ,1,2 ,三 ,1,2和1
刘娟（Juan Liu）
1放射肿瘤学系
4这两位作者对这项工作的贡献相等
岑章
1放射肿瘤学系
4这两位作者对这项工作的贡献相等
魏朱
1放射肿瘤学系
2美国新泽西州新不伦瑞克市罗格斯大学新泽西罗格斯癌症研究所儿科
洪雪慧
1放射肿瘤学系
2美国新泽西州新不伦瑞克市罗格斯大学新泽西罗格斯癌症研究所儿科
赵玉涵
1放射肿瘤学系
2美国新泽西州新不伦瑞克罗格斯大学新泽西罗格斯癌症研究所儿科
肯·H·杨
三德克萨斯大学安德森癌症中心血液病理学系，德克萨斯州休斯顿，美国
胡文伟
1放射肿瘤科
2美国新泽西州新不伦瑞克市罗格斯大学新泽西罗格斯癌症研究所儿科
1放射肿瘤学系
2美国新泽西州新不伦瑞克市罗格斯大学新泽西罗格斯癌症研究所儿科
三德克萨斯大学安德森癌症中心血液病理学系，德克萨斯州休斯顿，美国
4这两位作者对这项工作的贡献相等
2014年2月15日收到；2014年3月24日接受。
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- 补充资料
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摘要
抑癌基因p53及其信号通路在肿瘤预防中起着关键作用。谷氨酰胺酶2（GLS2）作为p53的直接靶基因，在肿瘤发生中的作用尚不清楚。在这项研究中，我们发现GLS2在大多数人肝细胞癌（HCC）中的表达显著降低。肝癌细胞中GLS2表达的恢复抑制了锚定非依赖性细胞的生长，并降低了肝癌异种移植瘤的生长。有趣的是，我们发现GLS2负调控PI3K/AKT信号传导，而PI3K/AKT信号传导在HCC中经常被激活。阻断肝癌细胞中的PI3K/AKT信号在很大程度上消除了GLS2对锚定非依赖性细胞生长和异种移植瘤生长的抑制作用。这个GLS2级在大多数肝癌样本中，启动子被甲基化。CpG甲基化GLS2级启动子抑制GLS2级转录，而降低GLS2启动子甲基化诱导GLS2表达。综上所述，我们的结果表明GLS2在肝癌的抑瘤中起着重要作用，PI3K/AKT信号的负调控对GLS2的这一功能起着重要的作用。此外GLS2级启动子是导致肝癌中GLS2表达降低的重要机制。
关键词：p53、GLS2、肿瘤抑制、PI3K/AKT、肝细胞癌
简介
抑癌基因p53在包括肝细胞癌（HCC）在内的肿瘤预防中起着至关重要的作用[1-三]. p53是人类肿瘤中突变频率最高的基因；超过50%的人类肿瘤中存在p53基因突变。在肝癌中，大约40-60%的肝癌包含p53基因的DNA突变[4,5]. 正常中断第53页在许多情况下，功能是肿瘤发展或进展的先决条件[6,7]. p53作为一种转录因子，主要通过其下游靶基因的转录调控发挥其抑瘤功能。通过调节许多下游靶基因的表达，p53调节细胞周期阻滞、凋亡、衰老、细胞能量代谢和抗氧化防御，所有这些都有助于p53在肿瘤抑制中的作用[1-三,8].
谷氨酰胺酶2（GLS2）是一种肝脏型线粒体谷氨酰胺酶，能催化细胞线粒体中谷氨酰胺水解为谷氨酸[9,10]. GLS2在包括肝脏在内的极少数组织中特异性表达。迄今为止，除了GLS2作为谷氨酰胺酶的功能外，对其在细胞中的生物学功能知之甚少。最近，GLS2级被我们组和另一组确定为一个新的p53下游靶基因[11,12]. p53在应激和非应激条件下均诱导GLS2表达。重要的是，GLS2介导p53在能量代谢和抗氧化防御调节中的功能[11,12]. 考虑到p53及其通路在肿瘤抑制中的关键作用，GLS2作为一种新的p53靶基因，可能在肿瘤抑制方面发挥重要作用。然而，GLS2在肿瘤发生中的作用尚不清楚。
肝癌是全球第五大最常见的癌症[13-15]. 肝癌是一种高度恶性的肿瘤类型，诊断后平均生存率低于1年。HCC死亡率高的一个主要原因是，大多数患者在疾病已经进入晚期时被诊断出肝癌，并且癌组织无法手术切除[13-15]. 因此，进一步了解肝肿瘤发生的分子机制将为肝癌的早期诊断和新的治疗策略提供潜在的分子生物标志物。
在本研究中，我们研究了GLS2在肝脏肿瘤发生中的作用。我们的结果表明，我们检测的大多数肝癌中GLS2蛋白水平显著降低。GLS2抑制HCC细胞的非锚定生长和HCC异种移植瘤的生长。此外，GLS2负调控PI3K/AKT信号，PI3K/AKT信号在包括肝癌在内的各种肿瘤中经常激活，并在肿瘤发生中起着关键作用[16-18]. 阻断PI3K/AKT信号在很大程度上消除了GLS2肝肿瘤发生的抑制作用。基因启动子中的CpG超甲基化是一种重要的表观遗传机制，导致包括肝癌在内的癌症中抑癌基因的表达降低[19-21]. 我们的结果强烈表明GLS2级启动子是肝癌中GLS2表达下调的重要机制。总之，这项研究的结果表明，GLS2通过对PI3K/AKT信号的负调控，在HCC的肿瘤抑制中发挥着重要作用。
结果
人类原发性肝癌中GLS2蛋白表达经常降低
肝脏是少数特异表达GLS2的组织之一。此前，我们检测了一组不同阶段原发性肝癌中GLS2 mRNA的水平，发现与正常肝组织或癌旁肝组织相比，大多数原发性肝细胞癌中GLS2mRNA水平显著降低[11]. 这些结果与另一项研究的结果一致[12]. 然而，目前尚不清楚肝细胞癌中GLS2蛋白水平的变化是否与GLS2 mRNA水平的变化一致。
为了研究肝细胞癌中GLS2蛋白的表达是否降低，我们通过免疫组织化学（IHC）染色分析了两组不同原发性肝细胞癌样品中的GLS2蛋白质水平。美国Biomax公司（马里兰州Rockville）提供了一组样本，其中包括三个组织微阵列（TMA）中的110个原发性肝癌和125个非肿瘤肝组织。另一组样本是在德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心收集的，其中包括21对原发性肝癌及其匹配的相邻非肿瘤肝组织。如图所示IHC染色结果显示，在TMA的125个非肿瘤肝脏样本中，118个样本显示GLS2阳性染色（+；≥10%阳性染色细胞），7个样本显示弱GLS2染色（±；<10%阳性染色）。相比之下，在TMA的110份HCC样品中，96份HCC样本GLS2呈阴性（-；0%阳性染色细胞），10份HCC标本GLS2（±）呈弱染色，而只有4份HCC试样GLS2阳性染色(第页<0.0001; 肝癌与非肿瘤肝组织）。GLS2蛋白表达减少似乎是肝癌中常见的事件，这在大多数不同阶段和不同组织学分级的肝癌中都可以观察到(补充表S1和第2页).
人原发性肝癌中GLS2蛋白表达降低通过IHC分析测量三种组织芯片（TMA；US Biomax）中HCC样品中GLS2蛋白的表达。这三个TMA共包含110个原发性肝癌和125个非肿瘤肝脏样本。上图：2个HCC中GLS2的代表性IHC染色显示阴性染色（-），2个非肿瘤肝组织显示阳性染色（+）。下面板：IHC染色导致TMA。-：0%阳性染色细胞；±：<10%阳性染色细胞；+：≥10%阳性染色细胞。这个第页数值采用χ2检验计算。HCC样本的临床病理信息见补充表S1&第2页。
在另一组HCC样本中也观察到类似的结果。IHC染色结果显示，21例原发性肝癌中，19例标本GLS2（-）呈阴性染色，1例呈弱染色（±），1例阳性染色（+）。相反，在匹配的21个相邻非肿瘤肝组织中，20个样本显示GLS2（+）阳性染色，1个样本显示弱GLS2染色（±）(补充图S1A;第页<0.0001; 肝癌与邻近非肿瘤肝组织）。同样，GLS2蛋白在大多数不同阶段和不同组织学分级的HCC中表达降低(补充表S3). 与IHC染色结果一致，Taqman实时PCR检测结果显示，大多数肝癌中GLS2 mRNA水平明显降低；21例HCC中有18例mRNA水平低于其匹配的相邻非肿瘤肝组织（截止值为2倍差异）。平均还原倍数约为8倍(补充图S1B). 综上所述，这些结果清楚地表明，在大多数原发性肝癌中，GLS2的表达在mRNA和蛋白水平上均显著降低，这强烈表明GLS2在肝癌的抑瘤中具有潜在的重要作用。
GLS2抑制HCC细胞的非锚定生长和HCC异种移植瘤的生长
我们进一步研究了GLS2是否在HCC的肿瘤抑制中发挥作用。如图所示与非肿瘤肝组织（Origene的3个组织）相比，不同肝癌细胞系（包括Huh1、Huh7、PLC/PRF/5和Hep3B细胞）中GLS2 mRNA水平明显降低。为了研究GLS2在肝癌中的作用，GLS2通过稳定转导逆转录病毒载体在Huh1和Huh7细胞中体外表达，该载体表达GLS2（图，左侧面板）。用空载体转导对照细胞。然后将这些细胞系用于软琼脂中的凤尾鱼非依赖性生长试验和裸鼠中的异种移植瘤试验。如图所示与对照细胞相比，GLS2在Huh1和Huh7细胞中的异位表达显著抑制了软琼脂中细胞的锚定非依赖性生长。同样，与对照细胞形成的肿瘤相比，GLS2的异位表达大大降低了Huh1和Huh7细胞形成的异种移植物肿瘤的生长（图).
GLS2抑制HCC细胞的非锚定生长和HCC异种移植瘤的生长（A） ●●●●。通过半定量RT-PCR测定不同肝癌细胞系和3个非肿瘤肝组织（由Origene提供）中GLS2 mRNA的表达。（B） GLS2在Huh1和Huh7细胞中的异位表达抑制了软琼脂中凤尾鱼非依赖性细胞的生长。左面板：用表达GLS2的pLPCX-GLS2载体或空白对照载体稳定转导Huh1和Huh7细胞。通过Western-blot分析检测细胞中GLS2的表达。中间面板：软琼脂中非凤尾鱼依赖性细胞生长的代表性图像。右图：软琼脂中异位表达GLS2的细胞或对照细胞的相对菌落数。数据表示为平均值±SD（n=5）。**：第页<0.001；学生t吨-测试。（C） GLS2在Huh1和Huh7细胞中的异位表达抑制了异种移植瘤的生长。左幅：接种细胞后第27天Huh1细胞形成的异种移植瘤的典型图像，有或没有异位GLS2表达。中幅：Huh1细胞异位表达或不表达GLS2形成的异种移植瘤生长曲线。右图：Huh7细胞在裸鼠体内形成的异种移植瘤的生长曲线，有或无异位GLS2表达。数据表示为平均值±SD（n=10）；**：第页<0.001; 方差分析，然后是学生的t吨-测试。
为了研究GLS2表达的缺失是否会促进HCC中的肿瘤发生，通过稳定转导针对GLS2的shRNA载体来敲除PLC/PRF/5细胞中的内源性GLS2（图). PLC/PRF/5细胞系用于shRNA敲除，因为与我们测试的其他HCC细胞系相比，GLS2的mRNA水平相对较高（图). 为了避免非靶向效应，使用了两种不同的抗GLS2的shRNA载体（图). 如图所示与用对照shRNA转导的对照细胞相比，敲除PLC/PRF/5细胞中的GLS2显著促进了锚定非依赖性细胞在软琼脂中的生长。此外，敲除GLS2也明显促进了PLC/PRF/5细胞形成的异种移植瘤的生长（图). 这些结果共同强烈表明GLS2在肝癌的抑瘤中起着重要作用。
敲除GLS2促进HCC细胞的非锚定生长和HCC异种移植瘤的生长（A） Taqman实时PCR检测PLC/PRF/5细胞内源性GLS2的敲除。用对照shRNA载体（sh-con）或2种不同的GLS2载体（sh-GLS2-#1和sh-GLS2-#2）稳定地转导细胞。实时PCR检测GLS2 mRNA水平，并用肌动蛋白归一化。对照细胞中GLS2的相对水平指定为1。（B） 敲除GLS2可促进PLC/PRF/5细胞在软琼脂中的非凤尾鱼依赖性生长。左面板：软琼脂中非凤尾鱼依赖性细胞生长的典型图像。右侧面板：软琼脂中GLS2敲除细胞或对照细胞的相对菌落数。（C） 敲除PLC/PRF/5细胞中的GLS2促进了异种移植物肿瘤的生长。左面板：在接种细胞后第27天，由对照细胞或GLS2被2种不同的shRNA载体稳定击倒的细胞形成的异种移植瘤的代表性图像。右图：PLC/PRF/5细胞在GLS2敲除或不敲除的情况下形成的异种移植瘤生长曲线。数据表示为平均值±SD（n=3 in A；n=5 in B；n=10 in C）*第页<0.01. 学生的t吨-B中的试验；方差分析，然后是学生的t吨-C中的测试。
GLS2负调节PI3K/AKT信号
PI3K/AKT信号在各种肿瘤中经常被激活，包括肝癌，它在促进肿瘤细胞生长、增殖和生存中起着关键作用[16,17]. 据报道，PI3K/AKT信号在50%以上的肝癌中被激活[18]. 有趣的是，我们发现GLS2在HCC细胞中负调控PI3K/AKT信号传导。众所周知，Ser473和Thr308的AKT磷酸化导致AKT活化[16,17]. Huh1和Huh7细胞中的异位GLS2表达明显降低了Ser473和Thr308处AKT的磷酸化（图). 在肝癌异种移植瘤中，GLS2也下调AKT活性；Western-blot和IHC染色结果显示，与对照细胞形成的肿瘤相比，GLS2异位表达的Huh1细胞形成的异种移植瘤中Ser473的AKT磷酸化明显降低（图). 此外，PLC/PRF/5细胞中内源性GLS2的敲除明显增强了AKT在Ser473和Thr308的磷酸化（图). 与对照细胞形成的肿瘤相比，GLS2敲除的PLC/PRF/5细胞形成的异种移植瘤中Ser473的AKT磷酸化明显增加（图). 考虑到致癌PI3K/AKT信号在肝癌中的关键作用，GLS2对PI3K/AKT信号的负调控可能对GLS2在HCC中的抑瘤活性有很大贡献。
GLS2对肝癌细胞PI3K/AKT信号的负调控（A） Western-blot分析检测到GLS2的异位表达降低了Huh1和Huh7细胞中Ser473和Thr308的AKT磷酸化。（B） Western-blot（左）和IHC染色（右）分别检测到GLS2的异位表达降低了Huh1细胞形成的异种移植瘤中Ser473的AKT磷酸化。（C） Western-blot分析测定，2种不同shRNA载体敲除GLS2后，PLC/PRF/5细胞中Ser473和Thr308的AKT磷酸化增加。GLS2击倒如图所示Western-blot（左）和IHC染色（右）检测发现，shRNA载体敲除GLS2后，PLC/PRF/5细胞形成的异种移植瘤中Ser473的AKT磷酸化增加。
GLS2对PI3K/AKT信号的负调控有助于GLS2在肝癌中的抑瘤活性
我们进一步研究了GLS2对PI3K/AKT信号的负调控是否有助于GLS2在HCC肿瘤抑制中的作用。为此，用表达显性阴性AKT（DN-AKT；K179M）的载体稳定转导具有异位GLS2表达的Huh1细胞和对照细胞，该载体抑制细胞中的AKT活性[22,23]（图). DN-AKT表达明显抑制Huh1细胞的锚定非依赖性生长（图)以及Huh1异种移植瘤的生长（图). 值得注意的是，DN-AKT的表达在很大程度上消除了GLS2对锚定物非依赖性生长和异种移植瘤生长的抑制作用。与表达GLS2的细胞（GLS2）和对照细胞（Con）之间的差异相比，共表达GLS2和DN-AKT的细胞（GLS2+DN-AKT）和表达DN-AKT的细胞（DN-AKT）之间的肿瘤集落数量和生长速率的差异要小得多（图).
GLS2负性调节PI3K/AKT信号，抑制HCC细胞非依赖锚定物的生长和异种移植HCC肿瘤的生长（A） Western-blot分析测定Huh1细胞中GLS2和/或显性阴性AKT（DN-AKT，K179M）的异位表达。用pLPCX-GLS2载体和/或pLHCX-DN-AKT（K179M）载体稳定地转导细胞。用空白对照载体（Con）转导对照细胞。（B） DN-AKT的表达在很大程度上消除了GLS2对Huh1细胞在软琼脂中非锚定生长的抑制作用。左面板：软琼脂中Huh1细胞非凤尾鱼依赖性生长的典型图像。右侧面板：软琼脂中Huh1细胞的相对菌落数。（C） DN-AKT在很大程度上消除了GLS2对Huh1细胞形成的异种移植瘤生长的抑制作用。左图：Huh1细胞在接种细胞后第27天形成的异种移植物肿瘤的代表性图像。右图：Huh1细胞形成的异种移植瘤的生长曲线。（D） 通过Western-blot分析测定GLS2敲低的PLC/PRF/5细胞中DN-AKT（K179M）的异位表达。带有GLS2敲除的PLC/PRF/5单元（如图所示)用DN-AKT载体转导。（E&F）。DN-AKT在很大程度上消除了GLS2敲除对PLC/PRF/5细胞（E）非锚定生长和PLC/PRF/5细胞形成的异种移植瘤（F）生长的促进作用。E中的左面板：软琼脂中PLC/PRF/5细胞的非锚定生长的代表性图像。E中的右侧面板：PLC/PRF/5细胞的相对菌落数。数据表示为平均值±SD（B&E中n=5；C&F中n=10）。**：第页<0.001; *:第页<0.01; 学生的t吨-B&E测试，ANOVA，然后是Student’st吨-C&F试验。
为了研究阻断PI3K/AKT信号能否在很大程度上消除GLS2敲除对HCC细胞非依赖性生长和HCC异种移植瘤生长的促进作用，DN-AKT（K179M）在PLC/PRF/5细胞中稳定表达，GLS2稳定敲除（图). 尽管PLC/PRF/5细胞中GLS2的敲除明显增加了软琼脂中的菌落数和异种移植瘤的生长速度，但DN-AKT的表达在很大程度上消除了GLS2敲除对凤尾鱼非依赖性生长的促进作用（图)以及异种移植物肿瘤的生长（图). 这些结果强烈表明，GLS2对PI3K/AKT信号的负调控在肝癌中对GLS2的抑癌活性起着重要作用。
基因启动子区CpG位点的超甲基化GLS2级人肝癌细胞和原发性肝癌
启动子的超甲基化是一种重要的表观遗传机制，导致包括肝癌在内的人类癌症中抑癌基因的表达降低[19-21]. 的启动子区域GLS2级该基因是富含CpG的结构域（图). 为了研究启动子超甲基化是否是导致肝细胞癌中GLS2表达降低的重要机制GLS2级在人HCC细胞系和原发性HCC中分析了启动子。首先，采用甲基化特异性PCR（MSP）检测分析GLS2级多个肝癌细胞系中的启动子，包括Huh1、Huh7、Hep3B和PLC/PRF/5。与非肿瘤肝组织（Origene的3个组织）相比，所有这些细胞系都显示GLS2的mRNA水平明显降低（图). MSP分析显示甲基化在GLS2级所有这些肝癌细胞系的启动子区。相反，在GLS2级在这3个非肿瘤肝组织中检测到启动子区域（图). 检查甲基化状态GLS2级更详细地说，启动子亚硫酸氢盐基因组测序（BGS）分析用于分析2个非肿瘤肝脏样本（Origene）、Huh1和Huh7细胞（图). 与MSP结果一致，BGS分析显示，我们在这2种HCC细胞系中分析的大多数CpG位点上，GLS2启动子区的CpG位点被广泛甲基化。相比之下，对于这两种非肿瘤肝组织，在这些CpG位点中未观察到甲基化或甲基化水平低得多，这表明HCC细胞中甲基化水平过高（图).
肝癌细胞和原发性肝癌中GLS2启动子的超甲基化（A） CpG站点位于GLS2级启动子区。CpG位点及其基因组位置GLS2级启动子区域由垂直线表示。核苷酸位置相对于转录起始位点（TSS；+1）进行编号。标记甲基化特异性PCR（MSP）和亚硫酸氢盐基因组测序（BGS）分析的引物位置。（B） 超甲基化GLS2级MSP分析检测HCC细胞中的启动子。甲基化状态GLS2级用MSP分析4个肝癌细胞株和3个非肿瘤肝组织（由Origene提供）的启动子。U： 非甲基化特异性引物PCR；M： 甲基化特异性引物PCR。（C） 超甲基化GLS2级用BGS分析肝癌细胞株中的启动子。对来自2个HCC细胞系和2个非肿瘤肝组织（Origene）的亚硫酸氢盐处理的DNA的8个PCR产物克隆进行测序。黑色和白色方块分别表示甲基化和非甲基化。（D） 超甲基化GLS2级MSP检测原发性肝癌启动子。采用MSP对21对原发性肝癌及其匹配的非肿瘤肝组织进行分析。代表性图像是样品#1-10的MSP结果。NT：非肿瘤肝组织；T： 肿瘤。
我们进一步调查了GLS2级启动子在原发性HCC中高度甲基化。MSP分析用于检测GLS2级上述21对肝癌及其邻近非肿瘤肝组织中的启动子。MSP分析表明GLS2级在大多数肝癌中，启动子被甲基化。与匹配的非肿瘤组织相比，21个肿瘤中的16个检测到甲基化水平更高（>2倍），2个肿瘤（如#10）检测到类似的甲基化水平，3个肿瘤没有检测到明确的甲基化（如#7）（图). 这两种非肿瘤肝组织的高甲基化可能是由非肿瘤组织中肿瘤细胞的污染引起的。此外，GLS2级肝癌中启动子高甲基化与GLS2表达降低显著相关(第页<0.001; χ2测试）。这些结果强烈表明GLS2级启动子是导致肝癌中GLS2表达降低的重要机制。
CpG甲基化抑制GLS2启动子的转录活性
为了直接研究CpG超甲基化对GLS2级发起人，GLS2级启动子区域（相对于转录起始点-458到+86）通过PCR扩增并亚克隆到pGL2荧光素酶报告载体的启动子区域。荧光素酶报告分析显示GLS2级与未插入GLS2级启动程序（图). 用CpG甲基转移酶M.SssI处理报告载体，使载体中CpG的胞嘧啶残基甲基化[24,25]. 作为对照，载体被模拟甲基化。CpG甲基化的完成通过HpaII（一种甲基化敏感的限制性内切酶）的消化得到证实（图). 这个GLS2级从甲基化和模拟甲基化的PGL2载体上切下的启动子DNA片段然后通过连接反应重新插入到非甲基化的PGL2载体中。在连接反应后，含有甲基化或模拟甲基化的非甲基化pGL2载体GLS2级启动子转染HCC细胞进行荧光素酶报告分析。含有甲基化的报告载体GLS2级与含有模拟甲基化的载体相比，启动子显示出较弱的荧光素酶活性GLS2级发起人；GLS2级启动子甲基化使Huh1和Huh7细胞中的荧光素酶活性降低了30-40倍以上（图). 这些结果表明GLS2级启动子大大降低了GLS2级发起人。
启动子超甲基化降低肝癌细胞中GLS2的表达（A）GLS2级启动子激活Huh1和Huh7细胞中的荧光素酶报告载体。左侧面板：控制荧光素酶报告载体（Con-Luc）和包含GLS2级启动子区（GLS2-Luc）。对照报告者的相对荧光素酶活性指定为1。（B） HpaII消化显示pGL2-GLS2报告载体完全甲基化。被M.甲基化的载体。新加坡证券交易所I或模拟甲基化用HpaII消化，并在农用凝胶上分离。（C） 甲基化GLS2级启动子降低了Huh1和Huh7细胞中报告载体的荧光素酶活性。左面板：含有甲基化或模拟甲基化的非甲基化pGL2荧光素酶报告载体的示意图GLS2级发起人。甲基化报告载体的相对荧光素酶活性GLS2级启动子被指定为1。（D） 5-Aza-dC减少甲基化GLS2级MSP检测HCC细胞中的启动子。用5-Aza-dC（5μM）或DMSO处理细胞7天。U： 非甲基化特异性引物PCR；M： 使用甲基化特异性引物的PCR。（E） 5-Aza-dC诱导肝癌细胞GLS2 mRNA水平。通过Taqman实时PCR测定GLS2 mRNA水平，并用肌动蛋白标准化。用二甲基亚砜处理的对照细胞中GLS2的相对水平指定为1。数据表示为平均值±SD（n=3）。**：第页<0.001; 学生t吨-测试。
甲基转移酶抑制剂5-Aza-2'-脱氧胞苷（5-Aza-dC）是一种广泛使用的脱氧核糖核酸脱甲基剂，可通过高甲基化启动子诱导许多基因表达[26,27]. 为了进一步研究GLS2级启动子是导致细胞凋亡下调的重要机制GLS2级用5-Aza-dC处理多个HCC细胞系，包括Huh1、Huh7、Hep3B和PLC/PRF/5细胞在HCCs中的表达。MSP分析表明，5-Aza-dC大大降低了CpG位点的甲基化GLS2级这4个肝癌细胞系中的启动子（图). 值得注意的是，5-Aza-dC可显著诱导GLS2级通过Taqman实时PCR分析（图)，表明GLS2级启动子增加了肝癌细胞中GLS2的表达。综合起来，结果如图所示&提示GLS2启动子高甲基化是导致肝癌中GLS2表达降低的重要机制。
原发性肝癌中GLS2杂合性缺失
杂合性缺失（LOH）在包括肝癌在内的多种肿瘤中常见，它导致许多抑癌基因的表达减少和功能丧失[28,29]. 为了确定LOH是否导致肝细胞癌中GLS2的表达降低，采用Taqman实时PCR拷贝数分析来确定上述21例原发性肝癌及其邻近非肿瘤肝组织中该基因的拷贝数。三种不同的拷贝数分析，测量5'、3'和GLS2级分别使用基因，得到了相同的结果。只有1例HCC失去了一个GLS2基因拷贝，而其余20例HCC保留了两个GLS2基因拷贝GLS2级（表)表明尽管LOH发生在GLS2级肝癌中的基因LOH并不是导致肝癌中GLS2经常下调的主要机制。
表1
的LOHGLS2级人类原发性肝癌
| GLS2副本号 | 非肿瘤 | 肿瘤 |
|---|
| 1 | 0 | 1 |
| 2 | 21 | 20 |
| 总计 | 21 | 21 |
讨论
GLS2最近被鉴定为一个新的p53靶基因[11,12]. 然而，GLS2在肿瘤发生中的作用尚不清楚。在这项研究中，我们发现与非肿瘤肝组织（包括肝硬化和肝炎的肝组织）相比，我们检测的大多数原发性肝癌中GLS2蛋白表达显著降低(补充表S2). 这一结果与我们组和另一组以前的报告一致，报告显示大多数肝癌中GLS2 mRNA表达显著降低[11,12]. 这些结果清楚地表明，GLS2的下调是原发性肝癌的常见事件，它有潜力成为肝癌早期检测和诊断的生物标志物。我们的结果进一步表明，肝癌细胞中GLS2的异位表达大大降低了非锚定细胞的生长和异种移植瘤的生长。一贯地，肝细胞癌细胞中GLS2的敲除明显促进了细胞的锚定非依赖性生长和异种移植瘤的生长。我们的结果证明了GLS2在肝癌抑瘤中的重要作用。除肝脏外，GLS2也在脑组织中特异表达。有趣的是，有报道称GLS2在脑肿瘤中的表达也降低[30]. 众所周知，p53在肝癌的预防中起着关键作用[4,5]. GLS2作为p53的直接靶点，对p53在肝癌抑瘤中的作用具有重要作用。
肝癌中经常观察到PI3K/AKT信号的异常激活，这在肝肿瘤发生中起着关键作用[16-18]. 本研究结果表明，GLS2是肝癌中PI3K/AKT信号的重要负调控因子；异位GLS2表达明显降低了肝癌细胞中AKT活性，而GLS2敲除则增强了AKT活性。阻断肝癌细胞中的PI3K/AKT信号在很大程度上消除了GLS2对锚定非依赖性细胞生长和异种移植瘤生长的抑制作用。这些结果有力地表明，PI3K/AKT信号的负调控在很大程度上有助于GLS2在抑制HCC中的作用。目前尚不清楚GLS2如何负性调节PI3K/AKT信号。据报道，GLS2通过其C末端的PDZ结构域与其他蛋白质相互作用[31]这可能有助于其对PI3K/AKT信号的负调控功能。最近，GLS2也被报道调节基因表达，尽管其机制尚不清楚[30]. 因此，GLS2可能改变PI3K/AKT信号通路中基因的表达，从而导致细胞内PI3K/AKT信号的下调。进一步的研究应阐明潜在的机制。
我们的结果进一步表明GLS2级在高比例的HCC中高甲基化，但在与其匹配的相邻非肿瘤肝组织中没有。The hypermethylation ofGLS2级在不同肝癌细胞系中也观察到启动子。脱甲基GLS2级5-Aza-dC启动子可显著诱导这些细胞中GLS2的表达。荧光素酶报告物分析进一步表明，CpG位点的体外甲基化GLS2级启动子区域大大降低了GLS2级发起人。这些结果强烈表明GLS2级启动子超甲基化是导致肝癌中GLS2表达降低的重要机制。
总之，本研究的结果清楚地表明，GLS2蛋白在大多数肝癌中的表达显著降低，GLS2启动子的高甲基化是导致肝癌中GLS2表达降低的重要机制。我们的研究结果进一步表明，GLS2在肝癌的抑瘤中起着重要作用，GLS2对PI3K/AKT信号的负调控大大促进了GLS2对肝癌抑瘤的作用。
材料和方法
细胞系、载体和细胞治疗
Huh-1、Huh7、PLC/PRF/5和Hep3B是人肝癌细胞系。表达GLS2的pLPCX-GLS2逆转录病毒载体是通过如上所述的PCR扩增构建的[11]. 通过将pLNCX-AKT1 K179M（Addgene）中的DN-AKT DNA片段亚克隆到pLHCX载体中，构建了表达显性阴性AKT（DN-AKT:K179M）的pLHCX-DN-AKT逆转录病毒载体[22]. 两种慢病毒shRNA载体GLS2级（ID:V3LHS-307701；V2LHS-71048）和对照shRNA载体来自Open Biosystems（美国亚利桑那州亨茨维尔）。为了建立稳定的GLS2敲除细胞系，用嘌呤霉素筛选感染shRNA载体的细胞。对于5-Aza-2'-脱氧胞苷（5-Aza-dC）处理，用5μM 5-Aza-dC（Sigma）处理细胞7天，每天更换5-Aza-dC。对照细胞用二甲基亚砜处理。
组织样本
美国Biomax公司（马里兰州Rockville）提供了三种组织微阵列（TMA），其中包括110份HCC样本和125份非肿瘤肝组织。德克萨斯大学MD Anderson癌症中心收集了21例福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）原发性肝癌样本及其匹配的相邻非肿瘤肝组织，IRB批准。Origene（马里兰州Rockville）提供了三份新鲜冷冻非肿瘤肝脏样本。
免疫组织化学（IHC）分析
如前所述，通过IHC分析测定组织中GLS2的表达水平[32]. 如前所述制备GLS2抗体[11]. 采用酪氨酸钠信号放大加二硝基苯基（DNP）-HRP系统（Perkin-Elmer）增加IHC信号。用兔IgG代替一级抗体作为阴性对照。两个已知的正常肝组织被用作阳性对照，以使不同批次的染色效率正常化。IHC结果根据GLS2染色阳性的肿瘤细胞百分比进行评分：-：0%；±：＜10%；+：≥10%.
Taqman实时PCR和半定量RT-PCR分析
使用RNeasy试剂盒（Qiagen）从细胞和新鲜冷冻组织中制备总RNA。使用RNeasy FFPE试剂盒（Qiagen）从FFPE组织中制备总RNA。使用TaqMan逆转录试剂盒制备cDNA。如前所述，使用Taqman PCR混合物（Applied Biosystems）进行Taqman实时PCR[11]. 基因的表达水平用标准化肌动蛋白基因。用于半定量RT-PCR的引物如下：GLS2级，5'-AGGCGAGAGTGTGCTGAGTGCTG-3'和5'-GCTGTCCCCCTATGGCTTC-3'；对于肌动蛋白，5'-GGACTCGAGCA AGAGATGG-3'和5'-AGCACTGTGGCGTACAG-3’。
亚硫酸氢盐处理和启动子CpG甲基化分析
使用QIAamp DNA迷你试剂盒（Qiagen）从细胞和新鲜冷冻组织中提取基因组DNA。使用QIAamp DNA FFPE试剂盒（Qiagen）从FFPE组织中提取基因组DNA。用亚硫酸氢盐处理DNA，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而使用EZ DNA甲基化试剂盒（Zymo Research）使甲基化的胞嘧啶保持不变。甲基化特异性PCR（MSP）和亚硫酸氢盐基因组测序（BGS）用于GLS2级启动子甲基化分析[33,34]. 对于MSP，使用甲基化特异性或非甲基化特异引物对亚硫酸氢盐处理的DNA进行PCR扩增。甲基化特异性引物序列：5'-CGTTATTCGT CGGGTTGC-3'（正向；相对于转录起始位点在nt−398到−377处）和5'-GAAACACCGTGTAAACTACGAATAAAATTATCG-3'（反向；nt−275到−240处）；非甲基化特异性引物序列：5'-TTATGTTATTTGTTGGGTTGGGTGTTG-3'（正向；在nt−401至−373处）和5'-CCAAAAACACCATAAACTACAAATAATAAAATTATCA-3'（反向；在nt−275至−238处）。对于BGS分析，使用亚硫酸氢盐处理的DNA扩增GLS2级（相对于转录起始位点，nt−460到+86）并克隆到TA载体（Invitrogen）。对八个不同的克隆进行测序，以检测CpG甲基化GLS2级发起人。
荧光素酶报告载体的构建、体外甲基化和荧光素酶活性测定
这个GLS2级PCR扩增启动子区域（相对于转录起始点-458至+86），并将其亚克隆到BglII和HindIII位点的pGL2荧光素酶报告载体（Promega）中。体外甲基化GLS2级启动子的操作如所述[24,25]. 总之，荧光素酶报告载体包含GLS2级启动子（10μg）使用CpG甲基转移酶M.SssI甲基化，该甲基化CpG的所有胞嘧啶残基。通过HpaII的消化证实了CpG甲基化的完成，HpaII是一种甲基化敏感的限制性内切酶，在CpG被甲基化时不能切断CCGG位点。在平行对照反应中，报告载体包含GLS2级启动子（10μg）被模拟甲基化。然后用BglII和HindIII消化甲基化和模拟甲基化报告载体GLS2级纯化启动子DNA片段，然后将其重新连接到未甲基化的pGL2载体中，并用BglII和HindIII消化。结扎后，含有甲基化或模拟甲基化的非甲基化pGL2载体GLS2级启动子直接用于荧光素酶报告子分析。荧光素酶报告分析按所述进行[35]. 简言之，含有甲基化或模拟甲基化的报告载体GLS2级启动子和表达pRL-SV40的载体被转染到细胞中海鳃荧光素酶作为一种内控物，使转染效率正常化。转染24小时后测定荧光素酶活性。
Taqman实时基因拷贝数分析
使用Taqman基因型Mix通过双重Taqman拷贝数分析测定基因拷贝数[32,36]. GLS2的FAM标记引物和TERT作为内部对照的VIC标记引物来自Applied Biosystems。三个引物（Hs01976936_cn、Hs02840568_cn和Hs03075375_cn），用于测量5'（内含子2外显子3）、3'（内含物15外显子16）和GLS2级基因（内含子10外显子11）。数据分析采用ΔΔCt法。
西部片分析
如前所述进行Western blot分析[11]. 使用了以下抗体。抗-p-AKT（Ser473）（#4051，细胞信号）、抗-p-AK（Thr308）（#40.56，细胞信号学）、抗-AKT。抗Flag-M2（F1804，Sigma），抗-β-肌动蛋白（A5441，西格玛）。如前所述制备GLS2抗体[11]. 蛋白质水平通过X射线胶片的数字化进行量化，并使用Scion Image软件（Scion Corporation，Frederick，MD）进行分析。
锚定非依赖性生长分析
在涂有含有0.6%琼脂糖的培养基的培养皿中进行锚定无关生长测定。细胞接种在含有0.3%琼脂糖的培养基上。2-3周后对菌落进行染色和计数[37].
异种移植致瘤性分析
如前所述，进行了异种移植致瘤性分析[38]. 使用7周龄BALB/c nu/nu雄性裸鼠（Taconic）。单元格（6x106Huh1电池和1x107将0.2 mL PBS中的Huh7和PLC/PRF/5注射（皮下注射）至裸鼠（n=10/组）。注射后，对小鼠进行检查，每周测量肿瘤体积3次，持续3-5周。肿瘤体积=½（长×宽2). 所有动物实验都是在动物保护和使用委员会的批准下进行的。
统计分析
用方差分析法分析各组间肿瘤生长的差异，并进行统计学意义分析，然后用Student’st吨-测试。所有其他P（P）使用Student获取值t吨-检验或χ2检验。**：第页<0.001; *:第页<0.01; #:第页<0.05.
致谢
这项工作得到了NIH（1R01CA143204）和NJCCR、UMDNJ基金会（给Z.F.）的资助，以及NIH（1 R01CA160558）和DOD拨款（W81XWH-10-1-0435）（给W.H.）的支持。J.L.和C.Z.获得了NJCCR博士后奖学金的支持。
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