谷氨酰胺酶活性我-对ASNS-阴性细胞的抗癌活性不需要天冬酰胺酶

关键点

摘要

介绍

我-天冬酰胺酶(我-ASP）是一种酶制剂，与长春新碱和糖皮质激素（如地塞米松）联合用于治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）。^1,2我们^三-6和其他⁷报告了测试的基本原理我-ASP还可对抗低天冬酰胺合成酶（ASNS）实体肿瘤。我-ASP的主要已知酶活性是将天冬酰胺脱酰胺为天冬氨酸和氨，但它也将谷氨酰胺脱酰胺成谷氨酸和氨（尽管亲和力较低，最大速率较低）。我-ASP治疗常常受到通常归因于谷氨酰胺酶活性的毒性副作用的限制。^8,9这些副作用常常妨碍完成整个治疗方案，导致不良结果。¹⁰然而，出现的问题是我-ASP可以通过降低其谷氨酰胺酶活性来增加^8,9或者这是否也会相应地降低抗癌效果。

辩论的一方假设我-ASP的治疗指数可以通过以下方式提高增加的谷氨酰胺酶活性。为了支持这一假设，过去十年收集的数据表明，谷氨酰胺酶活性通常会提高我-ASP，有时需要达到抗癌效果。这些研究报告称，天冬酰胺酶活性是消耗性的。^11-19然而，高谷氨酰胺酶的临床评价我-ASP来自谷氨酰胺不动杆菌产生了相当大的毒性，²⁰这表明谷氨酰胺缺乏增加毒性的程度大于其增加抗癌活性的程度，导致治疗指数较低。继续努力开发基于谷氨酰胺酶的疗法显然应该谨慎进行。

争论的另一方假设我-ASP的治疗指数可以通过减少谷氨酰胺酶活性。在之前对该策略的测试中，“无谷氨酰胺酶”我-ASP变体来自琥珀酸Wolinella succiogenes被隔离、表征，¹⁵并在2001年至2008年间通过美国国家癌症研究所快速介入发展（NCI RAID）拨款进行临床评估。然而，出乎意料的是，W琥珀酸酯 我-ASP被发现具有谷氨酰胺酶活性，对患者有毒性。决定不提交试验新药申请。因为W琥珀酸酯 我-ASP并不是真正的“无谷氨酰胺酶”，降低谷氨酰胺酶活性是否能提高治疗指数的问题仍未得到回答。

在这里，我们报告一项新的贡献，它支持辩论的双方。因为之前的研究发现W琥珀酸酯 我-ASP是有毒的，我们首先推断出“谷氨酰胺酶无”我-ASP应来源于安全有效的异构体。因此，我们的工作重点是临床使用的大肠杆菌 我-ASP。该酶的分子动力学（MD）模拟指导谷氨酰胺酶缺陷变体的合理工程。在天冬酰胺上优先与谷氨酰胺相互作用但对酶转化不是必需的残基被选为饱和诱变的候选物。最佳候选氨基酸为Q59。我们发现了一个突变株（Q59L），该突变株表现出的谷氨酰胺酶活性最多只占原始谷氨酰胺酶的一小部分，但保留了大于60%的野生型（WT）天冬酰胺酶活性。最后，我们发现Q59L对ASNS-阴性白血病细胞株表现出选择性抗癌活性，而WT酶表现出ASNS-非依赖性毒性。

材料和方法

结果

总经理我-ASP公司

为了指导旨在创建谷氨酰胺酶缺陷突变体的突变实验，我们对WT进行了20-ns MD模拟我-ASP与天冬酰胺或谷氨酰胺结合。我们比较了内衬内两种基板的择优取向和接触我-ASP催化裂解并确定了每个底物如何协调的关键差异。酶-底物接触时间的分析是鉴定最有前途的诱变靶标的基础。

模拟结果与之前发表的结果基本一致（在Labrou等人¹⁹)，但有一个功能令人惊讶。与天冬氨酸的晶体取向相比，这两种底物的位置都在～200至300 ps范围内发生了变化。这种重新定向发生在四聚体的所有4个酶结合囊中，与产品天门冬氨酸相比，明显确立了对天门冬酰胺和谷氨酰胺的不同偏好。重新定向可能是因为这两种底物都包含不带电的酰胺侧链，而不是产品的带负电荷的羧酸部分。由于在生理蛋白质浓度、离子浓度和温度下的模拟条件，预计晶体结构与紧密堆积的酶在低水合作用下形成的晶体结构存在其他差异。补充图3显示了20-ns模拟过程中的平衡动力学。如补充图3B所示，谷氨酰胺侧链酰胺氧（-CONH）之间的接触概率₂标记为“OE1”），酶在6到8 ns之间的时间间隔内减少，而其他相互作用的概率在稳定的平均值附近波动。

在天冬酰胺和谷氨酰胺周围形成第一层外壳的酶残基和特定原子列于表1和补充表2。第一个壳体中包含的标准是在整个模拟时间的1%以上的持续时间内接近<3º。对所有4个酶结合位点的概率进行平均。表1和补充表2表明，两种底物基本上由相同的原子组进行协调。重要的是，天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链酰胺氧接近苏氨酸T12的催化羟基（-OH），概率分别只有3%和1%（补充表2）。相反，它们的α-羧酸基团（-COO^负极)接触T12的催化-OH的时间要长得多（分别为77%和48%）。

表1

极性基团大肠杆菌 我-最常与基板主干相互作用的ASP

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基板接触之间的差异(表1和补充表2；最右边的柱）表明谷氨酰胺与酶催化位点中几乎所有残留物接触的可能性降低。值得注意的例外是谷氨酰胺Q59和苏氨酸T89的主链α-氨基（-NH）和侧链胺（-NH_三⁺)赖氨酸K162。事实上，天冬酰胺和谷氨酰胺底物之间最显著的区别是与Q59的相互作用方式(图1). 谷氨酰胺底物α-羧基与Q59主链酰胺的相互作用增加，与催化T12残基的相互作用减少。因此，谷氨酰胺的α-羧基向T89的主链酰胺重新定向，谷氨酰胺侧链酰胺与T89的主酰胺和侧链氢键供体失去接触。由于T89通常与天冬酰胺的酰胺基团相协调，因此与谷氨酰胺的失去接触似乎非常重要。

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图1

天冬酰胺和谷氨酰胺在大肠杆菌我-ASP。在模拟约20 ns时拍摄快照。Q59通常与天冬酰胺（A；浅绿色）和谷氨酰胺（B；橙色）的骨架相互作用，但模式不同。天门冬氨酸通常通过其主链NH基团与Q59的侧链氧配位，而谷氨酰胺的主链羧基通常与Q59中的主链-NH基团相互作用，而Q59的支链则背对底物。

这些结果表明我-ASP将是比K162或T89更有希望的诱变位点。后一种残基在反应的第二阶段（天冬氨酰酶键的水解）中起着重要的催化作用，因此不应突变。²⁴类似地，K162参与催化间隙中几个电荷的静电稳定^24,27因此，不应发生突变。另一方面，Q59协调两种基板的主链组，而不是侧链。因此，我们推断Q59的突变不太可能使酶完全失活。

的特征我-ASP Q59突变体

为了实验验证Q59残基的一些突变会选择性降低谷氨酰胺酶活性的预测我-ASP在不使其酶失活的情况下，我们进行定点突变以获得该酶的Q59变体。我-编码所有20种可能氨基酸的59位ASP表达载体被转化为大肠杆菌BL-21。除Q59C和Q59S外，所有突变体都能像WT蛋白一样高效地表达和分泌到培养基中(图2A). 随后使用比色分析进行的动力学筛选表明，突变体的天冬酰胺酶活性范围为WT的0%至80%，中位数为12%(图2B). Q59突变体的谷氨酰胺酶活性范围为WT的0%至60%，但中值仅为WT谷氨酰胺酶的2%(图2C)这表明Q59对谷氨酰胺酶活性确实比对天冬酰胺酶活性更重要。

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图2

Q59的酶学特性我-ASP突变体。（A） 考马斯蓝染色SDS-PAGE显示我-ASP WT和Q59突变体。表达载体被转换为大肠杆菌B类我-用SDS-PAGE分析21株和20µL培养上清液。空表达载体（Ctrl）和T89V（非活性突变体）作为阴性对照，用于检测B组和C组中的酶活性。（B）通过比色法检测Q59突变体的天门冬氨酸酶活性。（C） 比色法测定Q59突变体的谷氨酰胺酶活性。（D） 比色法测定纯化Q59突变体的天冬酰胺酶特异性活性。（E） 比色法测定纯化Q59突变体的谷氨酰胺酶特异性活性。（F） 纯化谷氨酰胺酶和天冬酰胺酶特异性活性的比率我-ASP突变体。SDS-PAGE，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

排除内源性大肠杆菌 我-天冬氨酸有助于在非纯化上清液上测定天冬酰胺酶和谷氨酰胺酶活性，我们纯化了突变体Q59L、Q59F、Q59D、Q59E、Q59H和Q59N，发现它们产生了结果(图2D-E)与初始屏幕一致。该观察结果表明，未净化上清液的筛选在数量上是可靠的（补充图2）。图2F说明了纯化突变体的谷氨酰胺酶和天冬酰胺酶的比率。在1个极端，Q59L和Q59F表现出最小的谷氨酰胺酶：天冬酰胺酶比率，几乎检测不到谷氨酰胺酶活性，但分别为80%和25%的WT天冬酰胺活性。接下来，我们使用灵敏的LC-MS/MS分析来确认Q59L的谷氨酰胺酶活性可忽略不计，如与谷氨酰胺孵育1小时后测量谷氨酸所示（补充图4）。相比之下，Q59L的谷氨酰胺酶活性甚至低于W琥珀酸酯类 我-Asp（补充图4C），以前报道过，使用不太敏感的方法，表现出非常低的谷氨酰胺酶活性。^15,28,29在另一个极端，Q59H表现出最大的谷氨酰胺酶与天冬酰胺酶活性比率。

Q59L的动力学表征我-ASP公司

接下来我们比较了Elspar我-ASP，带WT我-ASP和Q59我-ASP关于天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺的动力学。使用优化的稳态反应条件，我们发现初始产物形成速率（v₀)当使用同等浓度的天冬酰胺酶时，用比色法测定的天冬酰胺酶对所有3种酶都是等效的（补充图5A-B）。WT相应的谷氨酰胺酶活性我-ASP略低于Elspar，未检测到Q59L的谷氨酰胺酶活性。

然而，我们担心比色分析可能会误导动力学分析，因为它们基于氨基酸底物和产物的衍生物，而不是氨基酸本身。因此，我们求助于我们的LC-MS/MS分析，以获得更可靠和更灵敏的分析。首先，比较我-ASP变体，我们确定WT、Q59L和Q59H的10、20和60 nM浓度我-ASP分别表现出几乎相同的天冬酰胺酶初始反应速率（～4.8×10⁻²nmol/s）（补充图5C）。使用相同的比例（40、80和240 nM）不会产生同等的谷氨酰胺酶活性；初始反应速率为1.7×10⁻³, <9.8 × 10⁻⁵（接近分析检测限），和9.0×10⁻³nmol/s（补充图5D），表明Q59L表现出检测不到的谷氨酰胺酶活性。

接下来，我们使用生理相关浓度的天冬酰胺和谷氨酰胺分析底物竞争动力学。图3显示了在单底物反应（黑色符号）或两种底物的混合物（白色符号）中产生的天冬酰胺消耗和谷氨酸形成的时间过程。重量我-ASP在～500秒内以线性方式完全降解纯100µM天冬酰胺(图3A黑圈），而1600µM谷氨酰胺的存在将天冬酰胺降解延迟至～600 s(图3A，白色圆圈）。在与谷氨酰胺的单一反应中，谷氨酸在1200秒内立即线性生成(图3B，黑色三角形），但直到～600秒才在混合物中检测到(图3B，白色圆圈）。由于天冬酰胺在与两种底物反应的600秒时几乎完全耗尽(图3A和谷氨酸直到那时才开始出现，数据表明WT具有强烈的动力学偏好我-天冬酰胺的ASP。在1mM下使用两种底物的其他竞争实验中，反应产物天冬氨酸和谷氨酸的出现也存在时滞（补充图6）。相反，Q59L没有表现出可测量的谷氨酰胺酶活性(图3B). 此外，1600µM谷氨酰胺没有抑制Q59L的天冬酰胺酶活性，表明谷氨酰胺没有被Q59L强烈结合（或脱酰胺）。

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图3

天冬氨酸和谷氨酰胺脱酰胺动力学。重量我-ASP或Q59L我-将ASP添加到含有100µM天冬酰胺、1600µM谷氨酰胺或两者的反应溶液中。天冬酰胺（A）和谷氨酸（B）的浓度通过LC-MS/MS在1500-s的时间序列中测量。固体符号表示单底物反应中的浓度，开放符号表示混合物中的浓度。

抗肿瘤活性我-ASP Q59突变体

研究谷氨酰胺酶活性对其抗癌活性的影响我-ASP，我们使用纯化的WT、Q59L或Q59F我-ASP治疗6种白血病细胞系（CCRF-CEM、SR、MOLT-4、K562、NALM-6和REH）(图4A-F)和2个卵巢癌细胞系（OVCAR-8和SK-OV-3）(图4G-H). 根据天冬酰胺酶的比活性（IU/mg酶）调整剂量。纯化的WT酶的抗癌活性与Elspar相当(图4A-B). 相反，缺乏谷氨酰胺酶的Q59L和Q59F对8个品系中的任何一个都没有表现出可测量的抗癌活性，即使在最高剂量32 U/mL时，也没有表现出抗癌活性。这表明谷氨酰胺酶活性对我-这些细胞系中的ASP。为了进一步支持这一结论，W琥珀酸酯 我-显示弱谷氨酰胺酶活性的ASP（补充图4C）仅保留弱抗癌活性（补充图7）。与谷氨酰胺酶缺乏的Q59L和Q59F突变体相比，保留谷氨酰胺酶活性的Q59突变体（Q59D、Q59E、Q59H、Q59N）表现出与WT相似的抗癌活性我-ASP公司(图4I-J). 总的来说，结果如所示图4表明谷氨酰胺酶活性我-ASP有助于本节所列细胞系的抗癌活性。然而，在下一节中，我们发现谷氨酰胺酶活性并不是所有癌细胞类型都具有这种活性所必需的。

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图4

WT、Q59L和Q59F的抗癌活性我-ASP。（A-H）将两个卵巢癌细胞系（OVCAR-8和SK-OV-3）和6个白血病细胞系（MOLT-4、K562、NALM-6、REH、SR和CCRF-CEM）接种在96个培养皿中，培养48小时，用一系列（WT、Q59L或Q59F）处理我-ASP浓度持续48小时，最后使用CellTiter-Blue在544 nm处进行荧光激发，在590 nm处进行发射分析。（I-J）MOLT-4和OVCAR-8细胞接种在96个培养皿中并培养48小时，然后用指定浓度的大肠杆菌 我-ASP WT或Q59突变株48小时。在A-H组中测量细胞活力抑制。以Sham治疗作为对照。（K） 经EC处理的指示细胞中ASNS水平的Western blot分析₅₀剂量我-ASP。（五十） OVCAR-8细胞ASNS水平的Western blot分析我-ASP突变体。印迹下方的数字代表ASNS的相对水平，其被标准化为负载对照β-肌动蛋白的水平（对照设置为“1”）。

ASNS介导对我-ASP Q59突变体

我们和其他人之前曾报道过我-ASP和ASNS的表达。^5,25,30为了确定ASNS是否也介导对谷氨酰胺酶缺乏型Q59突变体的耐药性，我们首先在我们发现对谷氨酰胺蛋白酶缺乏型Q59L和Q59F不敏感的细胞株治疗前后进行ASNS western blot分析我-ASP突变体。正如预期的那样，ASNS在所有测试的细胞系中广泛上调(图4K). 接下来，我们用选定的Q59突变体处理OVCAR-8细胞后，对ASNS进行了western blot分析。ASNS也被所有6个被测试的突变体上调，尽管每个突变体的上调程度不同(图4L). 有趣的是，高谷氨酰胺酶Q59H诱导的ASNS上调幅度最低，这表明ASNS上调的幅度可能受到谷氨酰胺酶活性的抑制我-ASP。

接下来，我们使用功能基因组学方法RNAi来测试ASNS上调介导谷氨酰胺酶缺乏抗性的假设我-ASP。ASNS公司siRNA处理导致OVCAR-8细胞ASNS蛋白的高效敲除(图5A). 为了支持这个假设，ASNS公司siRNA对谷氨酰胺酶缺乏的Q59L有效增敏OVCAR-8细胞(图5B). 此外，Q59L和Q59F对白血病细胞株Sup-B15和RS4具有较强的抗癌活性；11 (图5C-D)，在治疗前后未表达ASNS蛋白的可检测水平我-ASP处理(图5E). 因此，我们将这两种细胞系称为“ASNS-阴性”。值得注意的是，Q59L对Sup-B15细胞系（EC）的抗癌活性₅₀= 1.4 × 10⁻⁴U/mL）和RS4；11（秒₅₀= 1.3 × 10⁻³U/mL）大于或等于Q59L对ASNS公司siRNA-处理的OVCAR-8株（EC₅₀= 1.1 × 10⁻³U/mL）-反映体外最大抗癌活性的程度我-我们迄今为止在对70多种细胞类型进行测量时观察到的ASP效力。^5,6,25总之，这些结果表明ASNS-阴性癌细胞株对单独的天冬酰胺酶活性超敏（即天冬酰胺缺乏而谷氨酰胺缺乏）。

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图5

WT、Q59L和Q59F对ASNS-阴性癌细胞的选择性生长抑制我-ASP。（A） Western blot分析转染48小时后OVCAR-8细胞ASNS水平ASNS公司siRNA（siASNS）或阴性对照siRNA（siNeg）。β-actin作为负荷对照。（B） WT和Q59L我-ASP浓度-活性曲线。用阴性对照siRNA（siNeg）或ASNS公司siRNA（siASNS）48小时，然后用一系列我-ASP浓度持续48小时，最后用CellTiter-Blue进行分析。WT、Q59L和Q59F我-在（C）Sup-B15和（D）RS4中测定ASP浓度-活性曲线；CellTiter-Blue法检测11个白血病细胞系。（E） Sup-B15和RS4中ASNS水平的Western blot分析；11个经EC处理的细胞₅₀剂量我-ASP。未使用任何治疗作为主要对照，MOLT-4细胞作为次要对照。

讨论

酶制剂我-ASP已成功用于治疗急性淋巴细胞白血病40多年。然而，毒性是一个问题。患者通常无法忍受25周的我-通常需要ASP治疗来诱导缓解。¹⁰毒性被归因于我-ASP的谷氨酰胺酶活性，^8,9但是，复杂的问题是，谷氨酰胺酶的抗癌活性也被归因于谷氨酰胺酶活性。^11-18因此，对于如何提高我-ASP。谷氨酰胺酶活性应该增加还是减少？我们的结果表明，根据ASNS在靶癌中的表达情况，这两种方法中的任何一种都有可能得到意想不到的答案。

我们的第一个目标是生成临床使用的谷氨酰胺酶缺乏衍生物大肠杆菌 我-ASP。分子结构大肠杆菌天门冬酰胺酶与天门冬氨酸复合物的活性位点首次在3ECA的x射线晶体结构中发现³¹然后在更高分辨率的结构中，1NNS。³²这些结构揭示了S58、Q59、D90、E283和天冬氨酸骨架基团之间的接触。N246和N248没有直接接触任何一种底物，尽管N248可能会在配体附近稳定E283。我们在MD模拟中观察到类似的接触，这表明Q59是一种催化非必需残基，天冬酰胺和谷氨酰胺底物之间的接触模式差异最大(表1和图1). 之前的模拟研究（在Labrou等人¹⁹)虽然在Q59残基上进行的实验诱变产生了3个突变体（Q59A、Q59E和Q59G），但没有将重点放在Q59上，这些突变体的酶活性显著降低。³³以往研究中对Q59的相对忽视可能是由于所用方法的差异所致。最相关的研究^18,33使用晶体结构来识别目标，然后用MD模拟来解释这些发现。这些研究集中在亚单位间接触和催化回路动力学上，以发现可能提高催化速率和酶稳定性的变化。最近的模拟³⁴还研究了基于3ECA结构的活性位点，活性位点中只有1个水分子，导致缺少稳定活性位点的氢键网络。水分子的缺乏可能非常显著。相反，我们首先进行了MD模拟，以充分水合和平衡酶，从而更全面地探索其生物相关结构。这种方法改变了在酶包封、低水合、结晶条件下观察到的接触概率，从而改变了优选的诱变目标。

在寻找抑制谷氨酰胺酶活性但不抑制天冬酰胺酶活性的诱变靶点时，我们选择了一个具有以下4个特征的残基：不直接参与催化，没有净电荷，只接触底物的主干，优先接触谷氨酰胺而不是天冬酰胺。我们消除了N248与基板的直接接触，并消除了E283带电。S58和D90满足4个标准中的3个标准，但与2个基板的接触频率大致相同。Q59满足所有标准。

确定Q59为我们的主要靶点后，我们对Q59进行了饱和诱变，并开发了一种快速比色筛选程序，以测量产生的突变体的天冬酰胺酶和谷氨酰胺酶活性。重要的是，实验筛选结果证实了电子预测；Q59突变通常比天冬酰胺酶活性降低更大程度上降低了谷氨酰胺酶活性(图2). 我们使用灵敏的LC-MS/MS分析进一步表征了一些Q59突变体。为了证明该方法的灵敏度，我们测量了W琥珀酸酯 我-ASP谷氨酰胺酶活性1.5×10⁻⁵在存在160 nM酶的情况下，nmol/s（之前其他方法未检测到的水平）。然而，即使具有这种敏感性，Q59L也没有检测到谷氨酰胺酶活性（补充图4C）。此外，它对谷氨酰胺的亲和力非常低，即使高浓度的谷氨酰胺（高达16 mM）也不能抑制其天冬酰胺酶活性(图3A). 该观察结果为进一步考虑Q59L作为候选药物提供了一个有吸引力的理由。

因为我们和其他人已经证明ASNS的表达与对我-ASP、，^{三,5,6,25,30,35-40}关于…的研究我-ASP必须考虑ASNS表达式。我们首先测试了WT、Q59L和Q59F的抗癌活性我-ASP针对6种表达ASNS的白血病细胞系和2种卵巢癌细胞系。谷氨酰胺酶缺乏型Q59L和Q59F我-ASP变体对ASNS-阴性细胞类型（Sup-B15、RS4、11和ASNS公司siRNA-处理的OVCAR-8）(图5)但不是ASNS-阳性细胞类型(图4)，支持本研究的中心假设，即我-ASP并不总是抗癌活性所必需的。值得注意的是，“ASNS-阳性”细胞类型包括MOLT-4等细胞系，这些细胞系的基线ASNS表达几乎无法检测到，但在以下情况下诱导表达我-ASP治疗和K562等基线ASNS表达高的细胞系(图5K).

中所示的模型图6总结了我们的结果。癌细胞可分为ASNS-阴性和ASNS-阳性，后者可进一步分为低ASNS和高ASNS。只有ASNS阳性的癌细胞能够使用从细胞外环境输入的Gln来合成Asn，使它们能够增殖，而不管细胞外Asn的可用性如何。因为Q59L我-ASP有效地只消耗Asn而不消耗Gln，ASNS-阳性细胞对Q59L治疗有抵抗力（左面板，图6A-B). 相反，细胞外Asn对ASNS-阴性细胞类型的增殖至关重要，因为不能内源性合成Asn（左图，图6C). 重量我-然而，ASP由于增加了谷氨酰胺酶活性，耗尽了Asn和Gln的细胞外供应。如果Asn和Gln的细胞内合成足够，那么在这种治疗后，高-ASNS癌细胞可能会继续增殖（右图，图6A). 然而，低-ASNS细胞类型承受此类治疗的能力降低；生成Asn的能力降低导致癌细胞增殖降低（右面板，图6B). ASNS-阴性电池类型不能承受WT我-ASP处理，重要的是，我-ASP谷氨酰胺酶活性对于抑制ASNS-阴性细胞的增殖似乎是不必要的（右图，图6C). 还需要进行更多的研究，以更清楚地定义区分高ASNS、低ASNS和ASNS-阴性细胞类型的阈值（用水平虚线表示），但从我们的结果中可以清楚地看出，ASNS-阳性癌细胞对没有谷氨酰胺酶活性的天冬酰胺酶治疗过敏。

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图6

WT机制的建议模型我-ASP和Q59L我ASP的抗癌活性。抗癌活性的机制取决于我-ASP谷氨酰胺酶活性和ASNS表达，这是由背景的颜色梯度反映的。为简单起见，未显示谷氨酰胺合成途径。（A） （左面板）（1）Q59L我-ASP有效地消耗Asn，但不消耗Gln，Gln（2）由癌细胞输入，用于（3）ASNS合成Asn，从而促进癌细胞增殖（4）。随后的面板中省略了编号，但类似的解释表明，WT添加的谷氨酰胺酶活性我-ASP减少Gln的细胞外供应，从而限制癌细胞的增殖（右图）。（B） 低ASNS癌细胞对Q59L不敏感我-ASP（左侧面板），但不到WT我-ASP（右侧面板）。（C） ASNS-阴性癌细胞对Q59L（左面板）和WT（右面板）均敏感。文本中提供了模型的详细信息。

谷氨酰胺酶活性我-ASP与许多ALL治疗相关的副作用有关，包括免疫抑制、胰腺炎、肝损伤和神经毒性。^9,41-45谷氨酰胺酶缺乏的潜在强度我-因此，ASP变体有可能提高治疗指数，如果我-ASP对癌细胞保持活性。例如，不含谷氨酰胺酶我-ASP变体如Q59L可能不会诱发胰腺炎。谷氨酰胺补充治疗胰腺炎疗效显著⁴⁶为这种猜测提供进一步的支持。然而，使用动物模型的临床前研究对于确定Q59L是否表现出改善的治疗指数至关重要。

我们注意到我们的结果和文献之间有一点不一致。谷氨酰胺酶缺失的不同变体我-据报道，ASP（N24A，Y250L双突变体）对REH细胞系具有抗癌活性，¹⁸我们发现它对Q59L和Q59F具有高度抗性我-ASP。因为这些作者没有测量ASNS的表达，也没有对他们的细胞系进行DNA指纹分析，所以我们无法确定我们的REH细胞系确实是相同的。此外，他们没有报告完整的剂量-反应曲线，因此我们无法确认抗癌活性的测量方法是否相似。与同一报告的另一个微小差异是，我们的Sup-B15品系对谷氨酰胺酶缺乏症更为敏感我-ASP变体。然而，我们的结果与另一组最近报道的结果高度一致，该组研究表明，Sup-B15对天冬酰胺缺乏敏感，而不会消耗谷氨酰胺。¹²

总之，我们报告（1）我-ASP对表达显著ASNS的癌细胞具有抗癌活性是必要的，但（2）ASNS阴性的癌细胞仅对天冬酰胺酶活性高度敏感。因为谷氨酰胺酶的活性我-ASP被认为是其毒性的原因，这些发现为验证谷氨酰胺酶缺乏的假设提供了理论基础我-ASP变体（如Q59L）的治疗指数将高于WT我-ASP对抗ASNS-阴性癌症。总的来说，我们的结果支持关于增加与减少谷氨酰胺酶活性的争论的双方我-ASP。也就是说，降低谷氨酰胺酶活性可能足以治疗ASNS-阴性癌症，而增加谷氨酰胺酶活力似乎对治疗ASNS-阳性癌症是必要的。

致谢

脚注

工具书类