生酮饮食、鱼油和热量限制对C57BL/6J小鼠血浆代谢物和脂质的影响

摘要

背景

越来越多的证据表明，饮食摄入会影响一系列疾病的预后，包括癫痫、自闭症、癌症、阿尔茨海默病和心血管疾病[1-5]. 治疗这些疾病的流行饮食包括生酮饮食、低血糖指数治疗饮食、鱼油补充饮食和卡路里限制饮食。关于饮食成分和数量如何影响体重、血脂水平和血糖控制，人们仍在继续争论和关注[6-10]. 为了有效利用饮食干预来治疗疾病，重要的是要了解不同的治疗方式如何影响血浆代谢物，如葡萄糖和酮体，以及受试者的整体健康和活力。

血糖和酮类水平是多种神经和非神经疾病饮食疗效的重要预测指标[5,11-16]. 对于癫痫，研究表明，限制生酮饮食的疗效取决于饮食降低血糖和升高血酮水平的程度[17-19]. 同样，临床前和临床研究表明，循环酮类水平升高和血糖水平降低对癌症的疾病转归有积极影响[13,20-22]. 然而，在健康人中，虽然降低血糖水平和增加酮类水平可能与代谢性疾病抵抗有关，但还不清楚这两者是否能改善健康[23].

据报道，在吃生酮饮食的人类和小鼠中，血脂和血糖水平的结果相互矛盾。在吃生酮饮食的成年人中，甘油三酯水平保持不变或降低，而胆固醇水平保持不变、降低或增加[24-27]. 生酮饮食增加儿童的血浆甘油三酯和胆固醇水平[28]. 成人和儿童的空腹血糖保持不变或在生酮饮食中降低[27,29-33]而血酮类持续增加[34]. 在小鼠中，生酮饮食降低了血浆甘油三酯水平，同时增加了胆固醇水平[35,36]. 据报道，生酮饮食小鼠的血糖水平升高、降低或无变化[13,18,35]. 与儿童一样，生酮饮食小鼠的血浆酮水平持续升高[18,35].

与生酮饮食相比，补充鱼油对血脂和血糖水平的影响更为一致。人体血甘油三酯水平下降，而总胆固醇水平保持不变[37-41]. 非糖尿病患者的空腹血糖水平没有变化，但补充鱼油的2型糖尿病患者的血糖水平升高[39-41]. 补充鱼油后，血酮水平保持不变[42]. 小鼠的鱼油补充和衍生饮食可降低血浆总胆固醇，并降低或不影响血浆甘油三酯水平[43-45]. 小鼠的空腹血糖保持不变或在给予鱼油补充或衍生饮食的小鼠中降低[44-46]. 由于脂肪生成减少和脂肪酸氧化增加，喂食添加了鱼白介素的饮食的大鼠的肝脏酮生成增加[47].

热量限制是一种长期研究的饮食方式，经常与生酮饮食结合使用，以治疗各种神经疾病[48]，用于心血管疾病和其他疾病的预防[49-51]. 人类热量限制导致总胆固醇和甘油三酯水平持续下降[52-54]血糖水平持续下降[52,53]血浆酮体水平升高[55,56]. 在小鼠中，热量限制导致血浆总胆固醇和甘油三酯水平下降或无变化[35,57]. 限制小鼠的热量摄入通常会导致血糖水平下降和血浆酮体水平升高[13,18,57,58]尽管有报告显示，限制热量摄入可以保持血糖水平不变[35]和酮体水平保持不变，甚至随着热量限制而下降[35,59].

为了评估饮食对血糖和酮类水平的影响，以及它们对激素和脂质的影响，我们评估了标准小鼠饮食、生酮饮食和补充鱼油的饮食在随意近交系C57BL/6J（B6）小鼠品系的饲养条件。这些饮食可以用来治疗疾病和障碍，目前尚不清楚这些饮食的疗效是否与它们的成分有关或与适度的卡路里减少有关[60,61]. 这三种饮食也在热量限制条件下进行了评估。这些饮食类型在文献中被广泛使用，生酮饮食用于治疗癫痫和其他神经系统疾病，鱼油补充饮食用于治疗心血管功能障碍和炎症疾病[1,62-66]. 我们发现标准饮食、生酮饮食和鱼油补充饮食在喂食时的血浆代谢物谱上存在差异随意然而，当在热量限制下服用时，这些差异大多被最小化，这表明无论宏观营养成分如何，热量限制饮食中的健康生物标志物都得到了改善。

方法

结果

作为一种治疗方式，饮食调整受到可变性的影响，因为研究人员经常使用不同的方法来实施饮食，这阻碍了研究的重复性。为了提高重复性并评估每种饮食的优点，我们在开始饮食之前将所有小鼠禁食16小时。这允许对饮食进行适当的评估，因为小鼠的代谢设定值相同。此外，以前使用的标准啮齿动物食物对动物新陈代谢的影响将降至最低[71]. 我们还观察到，在开始节食之前禁食老鼠也有助于限制老鼠在转向不熟悉的饮食时施加的自我约束量（个人观察）。

体重和代谢能摄入

所有CR小鼠的体重减少了约20%（图1，表2). 所有小鼠都能很好地耐受这些饮食，在研究结束时看起来健康有力。所有组的活动水平都相当，所有小鼠都没有出现嗜睡。

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图1

饮食习惯对体重的影响。 重量表示为平均值±SEM。箭头表示16小时禁食后开始各自的饮食。SD-UR（SD-UR），标准饮食无限制；SD-R系统，限制标准饮食；KD-UR公司生酮饮食无限制；KD-R公司，生酮饮食受到限制；FO-UR（前向上），鱼油补充饮食不受限制；FO-R型，限制添加鱼油的饮食。

表2

饮食摄入对C57BL/6J小鼠体重和热量消耗的影响

	饮食
	标准饮食		生酮饮食		鱼油饮食
	UR（欧元）	R（右）	UR（欧元）	R（右）	UR（欧元）	R（右）
最终体重（g）一	29.0±0.7	23.6 ± 0.1	32.5 ± 0.7	23.3 ± 0.3	27.9 ± 0.9	23.1 ± 0.2
体重变化（%）	+0.3 ± 1.8	-21.1 ± 1.4	+11.2 ± 2.3	-19.9 ± 0.6	-10.7 ± 2.7	-22.4 ± 1.1
能量摄入（kcal）b条	15.0 ± 0.4	11.3±0.6	13.4 ± 0.3	10.1 ± 0.3	13.1 ± 0.6	10.2 ± 0.2
热量差（%）c（c）来自UR饮食	0.0 ± 1.3	-24.4 ± 1.1	0.0 ± 1.2	-24.9±2.2	0.0 ± 4.6	-22.3 ± 1.9
热量差（%）d日来自SD-UR	0.0 ± 1.3	-24.4 ± 1.1	-10.5 ± 1.1	-32.8 ± 1.9	-12.2 ± 4.0	-31.8 ± 1.7

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^一数值表示为平均值±SEM（每组4只小鼠）。

^b条从第7-31天开始，每只小鼠每天消耗的平均代谢能（kcal）。

^c（c）来自UR饮食。

^d日来自SD-UR。

实施饮食后约7天，体重稳定（图1)而热量摄入在8-10天后趋于稳定（数据未显示）。虽然SD-UR组在整个研究过程中保持了体重，但KD-UR组的体重在32天期间增加了约11%，尽管与SD-UR相比，计算得出的每日卡路里摄入量减少了约10%（表2). FO-UR组在32天期间体重减轻了约11%，与SD-UR组相比，热量摄入减少了12%。虽然每个CR组的体重相对于随意对照组，实现这种减肥所需的CR量取决于饮食中的大量营养成分。喂食高脂肪饮食（KD-R和FO-R）的小鼠需要减少约33%的热量，而喂食正常饮食（SD-R）小鼠需要减少24%的热量才能达到20%的体重减轻。FO-UR组每天摄入700毫克鱼油，而FO-R组每天摄入550毫克鱼油。

饮食对血脂的影响

我们使用HPTLC检查了血脂分布（图2). 血浆甘油三酯水平的变化通常与血糖水平的变化相关，CR组的循环甘油三酸酯和葡萄糖水平最低（表​（表3）。三). KD-UR组的甘油三酯水平最高，而FO-UR组甘油三酸酯水平与CR组相似。与非限制性对照组相比，SD-R和KD-R组的总游离胆固醇水平降低，尽管KD-R组的胆固醇水平与SD-UR组相似。两个鱼油组的胆固醇水平与SD-UR组相似。胆固醇酯水平遵循与游离胆固醇类似的模式。虽然与SD-UR组相比，SD-R组的胆固醇酯水平没有显著降低，但KD组的胆甾醇酯水平最高，KD-UR组的胆固醇脂水平明显高于KD-R组。鱼油组的胆固醇酸酯水平没有变化，与SD-UR组的胆固醇含量相似。SD-R组和KD-R组的游离脂肪酸水平（FFA）高于各自UR组。

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图2

标准饮食（SD）、生酮饮食和鱼油饮食（FO）条件下小鼠在无限制（UR）和限制（R）喂养条件下的血脂HPTLC平板。金融流量账户，游离脂肪酸；总工程师，胆固醇酯；TG公司，甘油三酯；是，内标物（油醇）；胆汁、胆固醇；证书神经酰胺；CB（断路器）、脑苷类；体育课磷脂酰乙醇胺；个人计算机磷脂酰胆碱；性虐待，鞘磷脂；液化石油气，赖氨酰磷脂酰胆碱。如方法所述，在两个单独的平板上运行脂质（中性脂质和游离脂肪酸）。表中量化了所有脂质值三，除了神经酰胺和脑苷脂，因为只存在微量。

与各自的无限制饮食相比，SD-R组和KD-R组的磷脂酰胆碱（PC）水平降低，但KD组的水平更高。鱼油组的PC水平相似。SD-R组的溶血磷脂酰胆碱（LPC）水平略有下降，其余各组的情况相似（表三). 鱼油组的血浆磷脂酰乙醇胺（PE）水平最低，与非限制性饮食相比，SD-R和KD-R组的血浆PE水平显著降低，尽管KD组的总PE水平最高，与SD-UR相比，SD-R显著降低。鱼油组之间没有差异，它们与SD-UR中的水平相当。还评估了血浆神经酰胺和脑苷脂水平，但它们仅以微量存在，未进行量化（图2).

体重、葡萄糖、酮和甘油三酯水平的主要预测因素

我们汇集了饮食组，以独立评估自变量的预测强度（图三). 根据既定标准，满足了方差分析的二元线性回归假设[75]. 最终体重、血糖、酮类和甘油三酯水平的最强独立预测值（最高决定系数）如图所示三对于评估的每个变量。我们发现，虽然热量和酮类可以适度预测体重，但血糖水平（R² = 0.850; 95%置信区间=1.000±0.186；t吨₂₂ = 11.157;年 = 16.798 + 1.000x个)是研究期间最终体重的最强预测因子。膳食脂肪和膳食碳水化合物的摄入量不是最终体重的显著指标。

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图3

小鼠体重、葡萄糖、β-羟丁酸和甘油三酯水平的线性回归分析。 绘制每个因变量的最强预测值（最高决定系数）。无论饮食如何，葡萄糖水平最能预测体重和甘油三酯水平，热量最能预测葡萄糖和酮类水平，膳食脂肪摄入最能预测胆固醇水平。SD-UR（SD-UR），标准饮食无限制；SD-R系统，限制标准饮食；KD-UR公司生酮饮食无限制；KD-R公司限制生酮饮食；FO-UR（前向上），鱼油补充饮食不受限制；前R，限制添加鱼油的饮食。

虽然我们发现循环血糖水平是最终体重的最强预测因子，但热量摄入是血糖水平的最显著预测因子（R² = 0.500; 95%置信区间=1.304±0.5777；t吨₂₂ = 4.687;年 = -6.390 + 1.304x个). 膳食脂肪摄入也适度预测了血糖水平，而膳食碳水化合物摄入并不是血糖水平的显著预测因素。

循环酮类最重要的预测指标是热量摄入减少（R² = -0.740; 95%置信区间=-0.399±0.105；t吨₂₂ = -7.904;年 = 1999年1月6日x个). 虽然降低热量对增加酮类水平的影响最大，但降低膳食碳水化合物摄入也有显著但适度的影响（R² = 0.384; 95%置信区间=-0.591±0.332；t吨₂₂ = -3.700;年 = 2.018-0.591x个)酮水平。血糖水平是酮类水平的弱预测因子，令人惊讶的是，膳食脂肪摄入并不是循环酮类水平重要的预测因子。

循环葡萄糖水平强烈预测循环甘油三酯水平（R² = 0.883；95%置信区间=4.223±0.672；t吨₂₂ = 12.870;年 = -22.631 + 4.233x个). 热量和膳食脂肪摄入适度预测甘油三酯水平，而酮类水平是甘油三酸酯水平的弱预测因子。膳食碳水化合物摄入不能预测循环甘油三酯水平。

讨论

我们发现，饮食中的大量营养成分在给药时对C57BL/6J小鼠的血浆代谢物谱有很大影响随意.服用生酮饮食随意促进小鼠的高糖水平、体重增加和高脂血症，而补充鱼油可降低体重、血糖水平，并产生正常的血脂水平。在CR下服用这些饮食可导致体重减轻、胰岛素敏感性增加、血糖水平降低、酮类水平升高，并促进血脂正常。当在CR下给药时，饮食组成对小鼠代谢谱的影响最小，所有组的代谢谱相似。因此，限制总能量摄入可以纠正B6小鼠的体重增加或高脂血症。

我们证实了先前的研究，即当小鼠在开始节食前禁食时，KD-UR不会导致小鼠的长期体重减轻[13,18,76]. 我们的研究支持“卡路里不是卡路里”的观点，因为与SD-UR相比，KD-UR组的代谢卡路里摄入量减少了10%，但体重增加了约10%。然而，我们的结果挑战了KD-UR的代谢优势理论，该理论指出，与不同成分的等热量饮食相比，低碳水化合物的等热量膳食会导致更大的体重减轻[77]. 这并不奇怪，因为膳食脂肪的代谢效率高于膳食碳水化合物和蛋白质[78]. 代谢性热量摄入和体重之间的差异很可能是由于不同饮食组之间能量利用的差异，包括强制性产热、微生物发酵、饮食诱导产热和基础代谢（包括能量消耗）等因素[79].

除了KD-UR下体重增加外，KD-UR组的血浆特征也表明饮食不健康[80-83]. KD-UR小鼠的血浆特征与之前发表的一份报告相似，该报告使用了同一品系小鼠的高脂肪、高蔗糖饮食[35]. KD-UR组的致动脉粥样硬化脂质甘油三酯、胆固醇和胆固醇酯最高。KD-UR饮食也会提高癫痫儿童的血脂[28]. KD-UR组存在高循环葡萄糖水平，这在其他对高脂肪、低碳水化合物饮食的啮齿动物的研究中也有报道[84,85]，会进一步增加动脉粥样硬化的风险，因为葡萄糖会导致内皮功能障碍[86,87]. 在不含碳水化合物的高脂肪饮食中，通过糖异生作用（通过脂肪酸氧化为乙酰辅酶A间接发生），可以通过摄入过量热量来提高葡萄糖[88]. KD-UR组的PC、LPC、PE和SM水平也最高。有人认为PC与游离胆固醇的比值（mol/mol）小于1是动脉粥样硬化的危险因素[89]. 所有组（限制组和非限制组）计算的PC/胆固醇比率相似，范围为1.5-1.75（数据未显示）。LPC水平与肥胖呈正相关[90]. PE水平被认为与动脉粥样硬化并发症呈正相关[91]. 血浆中SM与冠状动脉疾病风险增加相关[92,93]. 我们的数据与LPC、PE和SM的观察结果一致。这些发现以及我们在B6小鼠中的观察结果表明，不限制剂量的KD摄入会对健康相关生物标记物产生不利影响。

限量服用KD可减轻B6小鼠的高脂血症血浆状况。除了降低甘油三酯、胆固醇、磷脂（PC、LPC和PE）和葡萄糖外，KD-R还降低了空腹胰岛素水平。循环胰岛素水平降低是抗动脉粥样硬化的[94]. KD-R组的血浆酮水平也最高。酮类可以治疗各种神经疾病和癌症[1,48,95-97]. 众所周知，酮类可以取代葡萄糖作为能量代谢产物，并可以保护大脑免受低血糖的影响[16,98,99]. 我们之前的研究结果以及本研究的结果表明，当饮食以限制量而非非限制量管理时，KD对癫痫和脑癌的治疗效果可能最好[13,18,20].

虽然KD-UR增加了体重，并与高脂血症的血浆特征有关，但我们惊讶地发现，FO-UR饮食引起的体重和血浆代谢产物的变化与CR组相似。我们不能完全排除这些结果是FO-UR组食物适口性下降的结果，因为与SD-UR组相比，FO-UR的热量摄入减少。然而，在整个研究过程中，FO-UR组在禁食后（16.9±2.3（FO-UR）卡路里对17.0±0.3（KD-UR）热量）摄入的热量与KD-UR组相似，并且对食物没有明显的反感。我们假设，脂肪因子脂联素水平的增加可能是FO-UR组胰岛素敏感性增加和体重下降的原因，尽管喂食随意因为补充鱼油与脂联素水平增加有关[100,101]. 有趣的是，我们发现FO-UR组的脂联素没有升高，这表明脂联素本身并不是导致FO-UR小鼠胰岛素敏感性或CR-like曲线升高的原因。ω-3脂肪酸及其代谢物可以改变过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）α和γ的活性，并直接结合和调节固醇受体元件结合蛋白（SREBP）的活性，后者有助于调节脂质和葡萄糖代谢[102,103]. ω-3脂肪酸及其代谢物（环氧化物衍生物、二十二碳六烯酸、可溶性蛋白和神经保护素）可降低甘油三酯水平、肥胖和炎症，同时改善啮齿动物和人类的胰岛素敏感性[104,105]. 因此，模拟CR组的FO-UR小鼠的观察到的血浆特征可能是由于欧米伽-3脂肪酸调节的多种机制尚未完全阐明。

将所有饮食组合并进行事后分析，以检查体重、饮食摄入和血浆特征之间的关系。我们的研究结果表明，血糖是小鼠体重的最强预测因子，并且与体重高度相关。这一观察结果与之前的人类研究一致，尽管人类研究没有审查饮食摄入[106,107]. 我们发现，特定大量营养素的摄入不能预测最终体重。这一观察结果质疑提倡缺乏特定宏量营养素的饮食来控制体重的效用[7,108]. 就预测血糖水平而言，总热量摄入只是适度的预测，表明多种因素可以调节小鼠的血糖水平。我们的研究结果表明，限制总热量摄入对降低小鼠的血糖水平和体重比限制任何特定的大量营养素摄入更有效随意喂养。总热量的减少强烈预示着酮类水平的升高。碳水化合物摄入量的减少对酮类水平的增加起到了适度的作用。从生理学的角度来看，考虑到人体有大量的脂质储存库和少量的糖原储存库，限制能量摄入和碳水化合物会迅速减少糖原储存，从而导致脂质β-氧化以获取能量，这一点不足为奇[109]. 通过限制总能量摄入或严格限制碳水化合物摄入来促进脂质β氧化的饮食策略会促进酮症。由于循环葡萄糖强烈预测血浆甘油三酯水平，降低血糖水平的饮食策略应该对促进心血管和整体健康有显著影响[110,111].

结论

在喂食日粮时，各种日粮的宏观营养成分起着重要作用随意正如我们的数据显示的体重、激素和血浆代谢物。然而，与大量营养成分相比，CR对体重、激素和血浆代谢物具有主导和独立的影响。我们的数据表明，CR可能比改变大量营养素比例更适合改善健康结果，尤其是在使用饮食疗法治疗代谢性疾病时[13,18].

缩写

SD：标准饮食；KD：生酮饮食；FO：补充鱼油的饮食；UR：无限制；R： 受限；铝：随意; CR：热量限制；FFA：游离脂肪酸；PC：磷脂酰胆碱；LPC：溶血磷脂酰胆碱；PE：磷脂酰乙醇胺；SM：鞘磷脂。

竞争性利益

作者声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

JJM进行了饮食实施、激素分析，辅以脂质分析，进行了统计分析，并起草了手稿。NT进行了饮食实施、脂质和代谢产物分析，并帮助起草了手稿。TNS构思了这项研究，参与了其设计和协调，并帮助起草了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。

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