跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
鲜血。2014年5月29日；123（22）：e123–e133。
2014年4月16日在线预发布。 数字对象标识：10.1182/血液-2014-02-554634
预防性维修识别码：项目经理4041169
PMID：24740812

综合基因组分析阐明JAK-STAT通路激活在骨髓增生性肿瘤发病机制中的核心作用

Raajit Rampal公司,1,2,三 Fatima Al-Shahrour公司,4 奥马尔·阿卜杜勒·瓦哈卜,1,2,三 杰·佩特尔,1 珍妮·菲利普·布鲁内尔,5 克雷格·默梅尔,5,6 亚当·巴斯,5,7 詹妮弗·普雷茨,5,7 安继海（Jihae Ahn）,1 托德·克里克,1 Outi Kilpivaara公司,8 玛莎·沃德利,7 兰伯特·巴斯克,9,10,11 D.加里·吉利兰,12 托德·戈卢布,5,13,14 本杰明·艾伯特,5,15和罗斯·L·莱文1,2,三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关键点

  • 所有MPN患者，包括CALR（校准）突变。
  • 转录谱分析基于JAK2号机组V617F等位基因负荷和存在CALR（校准）和TET2测试突变。

摘要

基因组研究已经确定了大多数骨髓增生性肿瘤（MPN）患者的体细胞改变，包括JAK2号机组大多数MPN患者和CALR（校准）中的突变JAK2号机组-MPN阴性患者。然而，JAK-STAT通路激活在不同MPN和无MPN患者中的作用JAK2号机组突变尚未明确描述。我们使用表达谱、单核苷酸多态性阵列和突变谱来调查一组特征明确的MPN患者。纯合型MPN患者JAK2号机组V617F突变具有独特的转录谱特征。值得注意的是，与激活的JAK2号机组无论临床表型或突变状态如何，在所有MPN患者中都可以看到信号传导。此外，激活的JAK2信号存在于躯体疾病患者中CALR（校准）突变。相反，我们发现了CALR（校准）突变；这一特征在JAK2号机组-突变MPN患者符合共同的转化机制JAK2号机组和CALR（校准）突变。我们还发现了TET2测试MPN专利样品中的突变。我们的数据表明，MPN患者，无论诊断或JAK2号机组突变状态以JAK-STAT靶基因上调的独特基因表达特征为特征，表明JAK-STATpathway在MPN发病机制中的核心重要性。

介绍

Philadelphia阴性骨髓增生性肿瘤（MPN）是以成熟髓系成分克隆性扩增为特征的造血疾病。这些疾病包括真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）和原发性骨髓纤维化（PMF）。MPN的基因组分析显示JAK-STAT信号通路中频繁发生突变事件，包括JAK2V617F系列90%至95%的PV患者发生突变，50%至60%的ET和PMF患者发生突变。1-5此外，血小板生成素受体的体细胞突变多协议标签在一组患者中JAK2V617F系列-ET和PMF阴性，JAK2号机组第12外显子突变6,7在里面JAK2号机组V617F-负PV，8,9和LNK公司中的突变JAK2V617F系列-负MPN10-12已确定。这些遗传数据表明，导致构成JAK-STAT信号的突变是不同MPN中常见的遗传事件。

大多数MPN患者中JAK-STAT通路突变的鉴定导致了JAK抑制剂的开发，美国食品和药物管理局批准了JAK1/2抑制剂ruxolitinib用于治疗骨髓纤维化（MF）。13,14用鲁苏立替尼和其他JAK激酶抑制剂治疗可获得实质性临床益处，包括显著减少脾肿大和疾病相关症状。然而，值得注意的是，在JAK2V617F系列-积极的和JAK2V617F系列-阴性MF患者。13该观察强烈暗示JAK-STAT通路参与JAK2号机组V617F-阴性MF。然而，JAK-STAT通路激活的作用和程度尚未正式描述JAK2号机组V617F等位基因负荷和在JAK-STAT通路中无已知突变的MPN患者中。

最近，有2项研究使用全外显子组测序来鉴定钙网蛋白的突变(CALR（校准）)大多数JAK2号机组V617F阴性MPN患者。15,16这些突变被发现不包括JAK2号机组和多协议标签突变，这表明这些突变通过一种新的替代机制导致JAK-STAT信号或JAK-STAT-信号下游的关键途径激活。此外，是否CALR（校准）突变导致广义JAK-STAT通路激活，与JAK2号机组激酶突变或是否CALR（校准）突变激活一个离散的下游信号效应器尚未被描述。

尽管MPN发病机制中涉及的突变事件现已被广泛描述，但不同的体细胞改变对转录输出的影响尚未被广泛评估。为了回答这些问题，我们对正常人和一组慢性MPN患者的粒细胞进行了基因表达谱分析，并将这些数据与详细的分子特征相结合，以了解MPN细胞的转录输出与MPN患者临床表型和分子基因型的关系。我们的数据表明，JAK-STAT通路的转录激活是不同MPN的共同分子特征，无论JAK2号机组突变状态和CALR（校准）-突变型MPN患者的特征在于JAK-STAT通路特征的表达。最后，我们给出的数据表明CALR公司和TET2测试MPN患者的突变对转录输出有特殊影响，这可能有助于在MPN患者中观察到的表型变异。

方法

患者

从97例MPN患者的外周血粒细胞中分离出DNA和RNA（作为哈佛骨髓增生性疾病研究中345例独特患者样本的一部分5)以及11名年龄匹配的正常受试者。这些研究获得了达纳-法伯癌症研究所和斯隆-凯特琳纪念癌症中心机构审查委员会的批准，并根据《赫尔辛基宣言》提供了知情同意书。

人雄激素受体基因克隆性测定和X灭活率测定

人类雄激素受体基因位点多态性CAG重复序列的聚合酶链反应（PCR）扩增用于确定倾斜程度（DS），如前所述。17与克隆粒细胞生成一致的等位基因倾斜被定义为X连锁等位基因之间的3:1比率，这相当于DS至少为0.25。17

突变分析和单核苷酸多态性（SNP）阵列

这个JAK2号机组如前所述，使用定量实时PCR测定粒细胞DNA中的V617F等位基因负荷。17突变分析ASXL1、CALR、JAK2、IDH1/2、，和TET2测试通过对ASXL1型和TET2测试以及已知突变区域CALR、JAK2、IDH1、，和IDH2公司如前所述。16-18此外，使用iPlex延伸化学方法（Sequenom）和质谱法对扩增的DNA进行了代表111个基因的另外953个突变的基因分型，如之前对整套OncoMap分析所述。19所有的体细胞突变都是通过重新测序非扩增DNA来验证的。除了突变分析外，还使用Affymetrix 250K对207例MPN肿瘤样本进行了分析史蒂I阵列。20

RNA干扰介导的JAK2基因敲除

这个JAK2V617F系列-用2种独立的shRNA慢病毒治疗突变型急性髓系白血病细胞系HELJAK2号机组在如上所述的pLKO嘌呤霉素选择性载体中21以及2个非靶向shRNA控制（sh-Luciferase和绿色荧光蛋白载体控制）。在选择稳定的细胞系后，使用Trizol（Invitrogen）从HEL细胞中纯化RNA。然后按照下文所述进行RNA处理和寡核苷酸微阵列杂交。

寡核苷酸微阵列

使用Trizol（Invitrogen）从粒细胞中纯化RNA。使用卵巢生物素RNA扩增和标记系统（Nugen）对20 ng总RNA进行线性扩增。如前所述，将片段化、标记的cDNA与Affymetrix HG_U133AAAv2微阵列杂交。22使用稳健多数组平均对原始表达值进行标准化。23本手稿中使用的所有微阵列数据都保存在基因表达总览中(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)使用此参考序列号：GSE54646型.

标记基因选择

原始基因表达值使用稳健多阵列平均法进行预处理和标准化。23通过丢弃最大基因表达值除以所有样本的最小值小于2的基因，或最大值和最小值之间的差异小于100的基因，排除了数据集中变异最小的基因。计算学生人数t吨测试确定了标记基因。统计显著性由类别标签的随机排列确定。24使用Benjamini和Hochberg程序计算的假发现率（FDR）阈值0.05（在某些情况下为0.01）来选择重要标记。25使用GenePattern软件包进行分析26使用比较标记选择模块。27

基因集富集分析

如前所述进行基因集富集分析（GSEA）。28将数据集从探针集转换为基因符号，并使用javaGSEA软件包分析基因表达特征。每次比较中差异最大的基因用于生成GSEA分析的签名。输入模体基因集从第4版分子特征数据库（MSigDBv2）中提取。28对于STAT5A/B靶基因分析，STAT5A签名是从先前发布的数据中获得的，29STAT5B签名来自MsigDB。

结果

基因表达谱分析区分MPN患者和正常对照

以前的研究已经描述了CD34中的基因表达+MPN患者的细胞和粒细胞。然而，这些研究并没有确定MPN整体特征或特定MPN疾病等位基因特征的一致、独特的基因表达模式。30-33例如，先前的研究在确定MPN患者的基因定义亚型（如JAK2号机组V617F-突变型vsJAK2号机组-野生型（WT）MPN）具有不同的基因表达特征。34-37CD34型+从MPN患者分离的细胞和中性粒细胞是克隆MPN细胞和正常造血细胞的混合物。我们假设，先前对MPN患者样本的基因表达研究的有限见解是由于正常细胞受到污染，这限制了识别MPN克隆特定转录特征的能力。为了确定一组包括主要克隆细胞的MPN样本，我们对JAK2号机组通过X灭活分析，对所有患者的V617F突变和信息丰富的女性患者的克隆性进行检测。我们将克隆优势定义为存在>50%的输入MPN细胞，定义如下JAK2号机组V617F等位基因负荷>51%，X失活DS>0.25，或通过Sanger测序发现另一突变疾病等位基因，或在Affymetrix SNP阵列分析中发现拷贝数改变。我们将患者定义为纯合子JAK2号机组当定量等位基因为JAK2号机组V617F大于60%，我们将患者定义为杂合突变，当JAK2号机组V617F等位基因负荷小于60%，X等位基因偏斜大于0.25。采用这种方法，50%或更多样本来自混合细胞且没有克隆标记的样本被排除在基因表达分析之外。

然后，我们对93例MPN患者（28例PV、47例ET、18例MF）进行了微阵列基因表达分析。对11名年龄匹配的正常供体的粒细胞进行了类似分析。总之，在每个样本中评估了14500个基因的表达水平。如所示图1A，分层聚类显示，与正常受试者相比，MPN患者具有不同的基因表达谱。这些数据表明，在没有大量混合正常细胞的情况下，对MPN患者样本的分析可以用于识别MPN特异性基因表达特征。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为e123f1.jpg

基因表达谱分析区分MPN患者与正常对照组和纯合子JAK2号机组来自其他人的V617F-突变MPN患者。（A） 对55例MPN患者和11例正常人的粒细胞基因表达微阵列数据进行了分层聚类。与正常人相比，MPN患者的特征是具有不同的基因表达谱。患者样本与临床MPN亚型和JAK2号机组基因型显示MPN患者具有纯合子JAK2号机组V617F突变的特征是MPN患者中存在独特的差异表达基因簇。（B） 正常人和纯合MPN患者显著差异表达基因的热图表示JAK2号机组V617F（265个基因FC>3和FDR<0.01），杂合JAK2号机组V617F（222个基因FC>2和FDR<0.05），以及JAK2号机组WT基因型（209个基因FC>2和FDR<0.05）。红-蓝色阶表示标准化的基因表达水平（红色：高；蓝色：低）。

我们还询问基因表达谱分析是否可以根据临床诊断或JAK2V617F系列突变状态。我们没有在MPN中性粒细胞中观察到PV、ET或MF特异性基因表达特征。然而，我们能够检测到先前定义的PV和ET相关基因表达特征的显著变化。38Chen等人在et和PV患者的红系甲基纤维素菌落中进行了基因表达谱分析，从而得出了PV和et的特征。38我们还测试了这些PV和ET基因表达特征，发现本文研究的患者的PV中性粒细胞中PV红系特征显著富集（40个基因中有26个通常上调，24个基因中有20个通常下调；FDR q值分别为0.007和0.006）以及此处研究的ET中性粒细胞中ET红细胞特征的显著富集（83个基因中的72个基因通常上调，21个基因中有20个基因通常下调；FDR q值分别为0.25和0.08）（补充图1和补充表1，可在血液网站）。在他们之前的研究中，Chen和同事假设这种差异是基于观察干扰素基因表达特征差异表达的基础上差异激活STAT1的结果；相比之下，我们没有发现PV或ET患者的干扰素或STAT1信号与其他患者或与正常供者相比有所增加。此外，我们没有观察到基于二元存在或不存在JAK2V617F系列突变。

纯合MPN患者的基因表达特征JAK2号机组V617F突变

我们注意到，来自纯合PV或MF患者的样本JAK2号机组V617F突变与MPN患者杂合子或WT分开聚集JAK2号机组V617F，提示纯合子中存在特定的基因表达特征JAK2号机组V617F中性粒细胞。染色体9p处拷贝中性杂合性缺失，包括JAK2号机组基因，早就在MPN患者中被识别39并导致发现JAK2号机组MPN患者中的V617F突变。2此外JAK2号机组V617F纯合子突变和获得性9p杂合子丢失强烈表明JAK2号机组突变提供了比杂合子更大的克隆优势JAK2V617F系列-突变细胞。尽管有这些遗传观察JAK2号机组V617F基因剂量对转录输出的影响尚未在主要患者样本中得到很好的描述。为了解决这个问题，我们进行了监督分析，以确定纯合子患者的特定差异表达基因JAK2号机组V617F-突变细胞，杂合JAK2号机组V617F突变或WT患者JAK2V617F系列与正常人的中性粒细胞相比。我们发现纯合子之间的基因表达存在显著差异JAK2号机组V617F突变型MPN患者和正常受试者，大多数差异表达基因在纯合子中表达增加JAK2号机组V617F-突变型MPN患者(图1B). 我们鉴定出265个基因在纯合子中差异表达（FDR<0.01和fold-change[FC]>3）JAK2号机组V617F-突变型MPN患者与正常人的比较(图1B; 补充表2）。我们还比较了杂合子MPN患者的基因表达JAK2号机组V617F突变或WTJAK2V617F系列和正常控制(图1B). 我们发现222个基因在杂合子MPN患者中有显著差异表达（FC>2和FDR<0.05）JAK2号机组在患有WT的MPN患者中，V617F突变和正常对照组（补充表3）以及209个基因的基因表达发生显著变化JAK2号机组和正常对照（补充表4）。

接下来，我们比较了纯合子MPN患者的特异性基因表达特征JAK2号机组V617F突变，杂合子JAK2号机组V617F突变和WTJAK2号机组与正常对照组相比。纯合子间差异表达前100个基因的分析JAK2号机组V617F-突变MPN患者与正常对照组的比较表明，这种表达特征对纯合子具有特异性JAK2号机组V617F-突变型MPN患者与杂合子MPN患者的比较JAK2号机组V617F突变或WTJAK2V617F。(图2A；补充表5）。纯合MPN患者的差异表达基因集JAK2号机组包含V617F突变JAK2号机组这表明JAK2激活调节自身表达的可能性，正如JAK2扩增的淋巴瘤细胞所显示的那样（补充图2A）。30,35我们还发现CD177的过度表达/PRV1型纯合子的JAK2号机组V617F-突变型MPN患者；这与之前的数据一致PRV1过度表达JAK2V617F系列-突变MPN。40我们还观察到JAK2下游关键信号中间产物的表达增加，包括STAT5B型和地图14，纯合子JAK2号机组V617F-突变型MPN患者(图1A; 补充图2A）。此外，我们注意到CSF3R公司和KRAS公司在里面JAK2号机组V617F纯合MPN患者与对照组比较。这些基因的突变与JAK2号机组V617F-负极MPN41MPN/MDS重叠综合征。42我们还注意到KRAS公司,JAK2号机组、和JAK3（JAK3）在里面JAK2号机组V617F杂合子与对照组。的比较JAK2号机组正常对照组的WT MPN再次发现KRAS公司和，共TYK2型此外，我们观察到多梳抑制复合物2成员的表达显著增加EZH2型和SUZ12型; 研究表明，EZH2表达显著增加可促进小鼠MPN。43总之，这些数据表明，除JAK-STAT途径外，其他致癌途径的表达失调可能有助于MPN的发病机制，而纯合子MPN患者JAK2号机组V617F突变构成具有特征性基因表达特征的MPN的特定分子亚群。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为e123f2.jpg

MPN患者的特征是JAK2活性增加的转录特征，无论JAK2号机组基因型。（A） MPN患者差异表达基因的热图表示（FC>3和FDR<0.01）。红-蓝色阶表示标准化的基因表达水平（红色：高；蓝色：低）。显示了前100个差异表达基因，这些基因来源于对来自JAK2号机组V617F纯合突变粒细胞与正常人的比较。成绩单编码JAK2、STAT5B、CD177（PRV1）、和地图214将显示。（B） GSEA显示MPN患者相对于正常受试者JAK2 shRNA信号的富集JAK2号机组突变状态。

MPN患者的特征是JAK2活性增加的转录特征，无论JAK2号机组突变状态

鉴于我们可以根据基因表达谱区分MPN患者和正常对照，我们试图确定是否存在导致MPN细胞病理转录输出的功能途径。鉴于MPN患者中JAK2途径突变的高流行率，我们假设与构成基因相关的特定基因表达模式JAK2号机组活动将区分MPN患者和正常对照。我们在JAK2号机组靶向2个独立shRNAs治疗后的V617F纯合突变HEL细胞系JAK2号机组或2种不同的控制shRNA（补充图3）。对JAK2敲除的HEL细胞相对于对照细胞的基因表达进行监督分析，结果显示175个差异表达的探针组（FDR<0.05）（补充图3；补充表6）。然后我们应用了这个JAK2号机组MPN样本和对照的shRNA敲除特征。该分析显示MPN患者与对照组相比JAK2 shRNA信号显著增强(图2B; 补充图2B）。MPN样本中JAK2 shRNA签名的富集与JAK2号机组V617F突变状态，与激活的JAK2信号调节MPN患者异常基因表达的作用一致，无论基因型或临床表型如何。(图2B). 与这一发现一致，GSEA没有显示JAK2 shRNA签名在JAK2号机组V617F纯合MPN患者与杂合MPN或WT患者的比较JAK2V617F系列（补充图3C）。相比之下，GSEA显示，相对于正常人，MPN样本中JAK2 shRNA特征显著富集（补充图3D）。这些数据表明，来自JAK2激活的基因表达特征是MPN患者的特征，无论JAK2V617F系列突变状态。

CALR（校准）-突变型MPN患者的特征是与激活的JAK2信号相关的基因特征

Klampfl等人的两篇开创性文章16Nangalia等人，15利用外显子组测序鉴定体细胞CALR（校准）70%至80%的基因突变JAK2号机组-WT ET和PMF患者。15,16 CALR（校准）突变是相互排斥的JAK2号机组和多协议标签突变，表明在JAK2号机组/多协议标签突变和CALR（校准）导致信号转导途径激活的突变。鉴于MPN患者JAK-STAT信号活性转录标记的识别JAK2号机组突变，我们试图探索CALR（校准）-突变型MPN患者，并将其基因表达特征与JAK2V617F系列-MPN突变患者。已知突变区域的靶向测序CALR（校准）在我们确定的MPN患者队列中CALR（校准）84%（63/75）的基因突变JAK2/MPLWT患者样本(图3A). 与之前报告的观察结果一致，CALR（校准）仅在JAK2/英里/加仑-WT ET/MF患者。15,16

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为e123f3.jpg

CALR（校准）-突变型MPN患者的特征是与激活的JAK2信号相关的基因特征。（A） 的突变状态JAK2、CALR、，和多协议标签290例MPN患者的突变状态和临床MPN诊断。一个单独的列表示每个患者。（B） GSEA显示MPN患者JAK2 shRNA特征富集CALR（校准）与正常受试者相关的突变。（C） 粒细胞中433个差异表达基因（413个基因上调，20个基因下调；FDR<0.01和FC>2）的热图表示CALR（校准）-与正常受试者相比，突变MPN患者（21名MPN患者和11名正常人）。红-蓝色阶表示标准化的基因表达水平（红色：高；蓝色：低）。（D） GSEA显示出显著富集CALR（校准）-纯合子MPN患者的突变MPN特征JAK2号机组与正常受试者相关的V617F突变。

我们使用GSEA分析JAK2号机组V617F纯合子，JAK2号机组V617F杂合，JAK2号机组重量，和CALR（校准）-针对MSigDB中基因集集合的突变签名（包括C2：精选基因集、C5：基因本体基因集、C6：致癌签名基因集），以评估这些亚组签名的全局差异。该分析表明JAK2号机组V617F突变纯合MPN样本在以激活JAK/STAT（JAK/静止）信号，KRAS公司信号，以及MYC公司转录等，与其他亚组进行比较（补充表7和8）。此外，对CALR（校准）-突变MPN与正常对照组相比，多梳抑制复合体2核心成员表达上调EZH2型和SUZ12型，以及克拉斯。重要的是，CALR（校准）-突变型MPN患者在JAK2号机组和STAT1（补充表9）。

接下来，我们使用GSEA来询问JAK2 shRNA签名是否在CALR（校准）-突变MPN样本。我们发现JAK2号机组shRNA签名CALR（校准）-突变MPN患者与对照组的关系(图3B). 然后我们在CALR（校准）-与对照组相比，突变MPN患者发现433个差异表达基因（413个基因上调，20个基因下调；FDR<0.01，FC>2）(图3C; 补充表9）CALR（校准）-MPN突变患者。我们观察到CALR（校准）-突变MPN基因签名JAK2号机组V617F-突变MPN患者相对于正常人(图3D).

研究表明状态5a/b对MPN表型的发展很重要雅克2V617F驱动的小鼠MPN模型。44,45因此，我们研究了STAT5A靶点是否在JAK2号机组V617F-突变型（纯合子和杂合子）MPN患者以及CALR（校准）-MPN突变患者。STAT5A的特征来自之前发表的一项研究，29STAT5B签名是从MsigDB中提取的。我们发现，与正常对照相比，STAT5A靶点在所有MPN基因型定义的亚型中的表达增加。我们还发现，与对照组相比，MPN患者STAT5B靶点的表达增加，包括CALR（校准）-突变MPN患者与对照组的比较（补充图4；补充表7和8）。总的来说，这些数据表明CALR（校准）-和JAK2号机组V617F-突变MPN患者与对照组相比，包括STAT5A/B直接靶点表达增加。

MPN患者的综合基因组分析

除了JAK2、MPL、，和CALR（校准），研究发现MPN患者的表观遗传调节蛋白反复发生体细胞突变，包括TET2、ASXL1、和印尼盾1/2.了解其他基因改变对CALR（校准）和JAK2号机组V617F-突变MPN患者，我们对其进行了靶向测序TET2、ASXL1、IDH1/2、，Affymetrix 250K SNP阵列、基因表达和基于质谱的111个额外基因已知突变基因分型19以93 MPN为单位(图4A). MPN患者中最常见的额外基因组改变是TET2型突变（7.2%），ASXL1型突变（7.1%），扩增/单亲二体性JAK2号机组(15.9%),和20q缺失（8%）。ASXL1型5.3%的人发生突变JAK2号机组-突变MPN和11.6%CALR（校准）-突变MPN（不显著），而TET2测试10.7%的人发生突变JAK2号机组-突变MPN和4.7%CALR（校准）-突变MPN（不显著）。将这些数据与JAK2号机组V617F和CALR（校准）突变，我们观察到JAK2号机组仅发生在杂合子患者中JAK2V617F系列突变，从未与CALR（校准）突变。我们验证了每个案例JAK2号机组实时PCR扩增并观察到JAK2V617F系列65%至75%的等位基因负荷与选择性扩增一致JAK2V617F系列等位基因(图4B). 鉴于此TET2型除了JAK2号机组或CALR（校准），以及明确的相关性TET2的髓系转化突变，46,47我们调查了TET2型MPN患者的突变具有特征性基因表达特征。监督基因表达分析TET2测试-突变MPN vsTET2测试WT鉴定出78个在TET2测试-突变型与WT MPN患者（FDR<0.05；图4C; 补充表10）。值得注意的是，该基因签名中的几乎所有基因在TET2型-突变MPN患者，与TET2通过DNA化学修饰负调控DNA甲基化的已知作用一致。此外，GSEA分析TET2测试-MPN患者的突变中性粒细胞与WT中性粒细胞的比较显示TET2测试-突变样本。（补充表7）。这些数据与对原始人类细胞的研究一致48,49在小鼠中测试2淘汰赛模型50-53显示出TET2测试导致髓细胞偏倚和髓细胞集落产量增加。这些数据表明，JAK-STAT途径以外的突变可以对导致异常转录输出的基因表达产生明显影响。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为e123f4.jpg

综合基因组分析显示与CALR（校准）和JAK2号机组MPN患者转录组的突变。（A） 圆形图显示97例MPN患者样本的突变频率和共现率。有关的遗传数据JAK2号机组V617F等位基因负荷、细胞遗传学改变和突变校准，TET2，ASXL1，和印尼盾1/2以及基于质谱的基因分型数据。（B） 整合MPN患者的体细胞遗传改变、SNP阵列数据中的重复拷贝数改变以及关键改变转录物的基因表达。每个患者在顶部热图中的单个列中表示STAT5B、JAK2、MAPK14、，和遇见显示在底部热图中。（C） 基于对基因表达的监督分析，显著差异表达的基因（FDR<0.05）TET2测试-突变型与WT MPN患者（93个样本）。61个基因有显著差异表达。

讨论

尽管JAK2号机组在大多数MPN患者中发现了V617F突变JAK2号机组疾病发生和维持的突变仍不完全清楚。我们使用基因表达谱数据显示，无论临床表型如何，MPN患者的基因表达特征与正常对照组不同。该特征基于JAK-STAT通路激活特征在所有MPN患者中的表达，无论临床表型或体细胞基因型如何。这些数据表明，尽管MPN疾病诱导细胞在所有3种疾病中很可能是造血干/祖细胞，54JAK-STAT通路激活被传递给分化的后代，这与JAK-STAT激活在MPN患者的造血系统中的中心作用一致。因此，这些数据通过显示JAK-STAT通路在MPN基因型和临床表型中的中心作用，为MPN的生物学提供了重要见解。

JAK-STAT通路激活特征在高JAK2号机组V617F-突变等位基因负载或突变扩增JAK2号机组V617F等位基因，表明基于杂合或纯合的相对存在，信号输出存在数量差异JAK2号机组V617F-突变细胞。这些数据与小鼠模型的研究结果一致，55在哪儿JAK2号机组V617F基因剂量影响疾病严重程度。这些数据也与定量的临床观察结果相一致JAK2号机组PV中V617F等位基因对临床参数的负担，包括红细胞增多程度增加和纤维化转化率增加。56在纯合子环境下，描述JAK2的哪些下游效应器有助于疾病严重程度的增加，这一点很重要JAK2号机组V617F突变，以及靶向下游信号效应器的治疗是否显示出对MPN患者的疗效增加JAK2号机组V617F等位基因负荷。这也为寻求更有效地靶向JAK2的治疗策略提供了进一步的理论基础，无论是通过设计更有效的JAK2激酶抑制剂，还是通过允许更有效抑制JAK-STAT通路的组合方法。

确定CALR（校准）中的突变JAK2号机组V617F-阴性ET和PMF患者提供了强有力的遗传数据，表明CALR（校准）突变是激活癌基因信号效应器的另一种机制JAK2号机组WT MPN患者。体外数据表明，突变CALR在Ba/F3细胞中的过度表达导致STAT5磷酸化增加，这一点得到了支持。然而，是否CALR（校准）突变直接激活JAK2信号传导，并且将CALR与酪氨酸激酶信号传导激活联系起来的机制尚未阐明。我们在这里展示CALR（校准）-突变型MPN患者的特征是与在JAK2号机组与正常对照组相比，V617F-突变MPN患者的转化模式相同JAK2号机组-和CALR（校准）-MPN突变患者。为了进一步支持这一假设，我们得出了CALR（校准）-突变基因表达特征并显示CALR（校准）-突变体特征在JAK2号机组V617F-突变MPN患者。重要的是要描述在CALR（校准）导致MPN发病的突变，并研究是否CALR（校准）-突变基因表达特征在其他造血恶性肿瘤或疾病状态中可见，表明其在致癌转化中具有更广泛的作用。

虽然我们的基因表达数据表明JAK2激活在改变MPN细胞的转录输出中起着重要作用，但MPN患者中存在额外的体细胞突变，包括ASXL1型,57和TET2测试,20,58,59这表明还有其他基因组事件导致MPN细胞中基因表达的改变。我们的数据表明ASXL1型突变最常见于卡尔-突变MPN患者，而TET2测试突变最常见于JAK2号机组V617F-突变MPN患者。虽然没有统计学意义，但进一步研究以描绘其他突变与JAK2号机组和CALR（校准）使用较大样本量的突变可能显示不同的发病途径和致癌协同性JAK2号机组-突变体和CALR（校准）-突变MPN。

TET2测试突变是MPN患者中JAK-STAT途径外最常见的体细胞突变。60-63这里我们展示一下TET2测试-与对照组相比，突变型MPN患者表现出明显的基因表达特征TET2测试-WT患者，表明该突变对转录输出有明显影响。通过何种机制TET2测试突变改变了造血细胞特定部位的DNA羟甲基化/甲基化，而对其在致癌转化中的作用至关重要的特定TET2靶点尚待阐明。此外，是否TET2型-此处鉴定的突变基因表达特征延伸至其他TET2测试-突变型造血恶性肿瘤需要在后续研究中进行研究。

我们的数据还表明，有其他信号和表观遗传途径有助于MPN发病。我们观察到其他细胞因子信号通路的表达失调，包括KRAS和CSF3R的过度表达，在髓系恶性肿瘤的发病机制中具有已知的作用。这些数据强化了最近的研究，表明靶向下游或侧支信号通路结合JAK-STAT抑制可能提高治疗效果。例如，使用PI3K/AKT/mTOR途径和JAK-STAT途径的联合抑制的临床前模型已经产生了令人鼓舞的结果，64,65目前正在计划使用这些方法进行临床试验。66KRAS及其信号转导中间产物在MPN的所有遗传亚型中均高度表达，这一观察结果表明，与JAK-STAT抑制相结合，以MAPK通路为靶点，值得进一步进行临床前和临床评估。

除了支持我们对这些疾病的生物学理解外，这里的结果与JAK靶向治疗对MPN患者的临床疗效的概念一致，无论观察到的基因型如何。事实上，来自ruxolitinib和其他JAK抑制剂研究的临床数据表明，无论是否患有MPN患者JAK2号机组V617F突变在脾肿大和体质症状方面表现出类似的下降。13我们的研究表明，无论MPN基因型如何，JAK-STAT通路对MPN的发病机制都至关重要。进一步的基因组改变，例如JAK2号机组V617F等位基因负荷以及其他突变事件的存在，如TET2测试突变可以改变MPN的基因表达特征和潜在表型。因此，与JAK2号机组/多协议标签/CALR（校准）突变可能在MPN患者的表型异质性以及对MPN治疗的异质性反应中起作用。

致谢

作者感谢莱文和埃伯特实验室的成员提供了有益的评论和讨论。

这项工作得到了骨髓增生性肿瘤基金会（R.L.L.，B.L.E.）、斯塔尔癌症联盟（D.G.G.，T.R.G.，B.E.R.L.）和国家癌症研究所国立卫生研究院（拨款1R01CA151949-01）（R.L.L）的资助。R.L.L.和B.L.E.是白血病和淋巴瘤学会学者，O.A.-W.和R.R.是美国血液学学会学者。

脚注

本文包含数据补充。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节，本文特此标记为“广告”。

作者

贡献：B.L.E.、R.L.L.、T.R.G.和D.G.G.构思了该项目；R.R.、F.A.-S.、O.A.-W.、B.L.E.和R.L.L.根据所有其他作者的意见撰写了手稿；R.R.、F.A.-S.、O.A.-W.、J.P.Patel、J.-P.B.、O.K.、M.W.、L.B.、B.L.E.和R.L.L.分析数据；O.A.-W.、J.P.Patel、C.H.M.、A.J.B.、J.Pretz、T.H.、J.A.、B.L.E.和R.L.L.进行了实验。

利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。

通信地址：马萨诸塞州波士顿市布莱克范街1号布里甘姆女子医院本杰明·埃伯特，邮编02115；电子邮件：gro.srentap@trebeb公司; 和罗斯·L·莱文（Ross L.Levine），纽约州纽约市约克大道1275号斯隆·凯特琳纪念癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，1275 York Ave，New York，NY 10065）；电子邮件：gro.ccksm@renivel公司.

工具书类

1.James C、Ugo V、Le Couédic JP等。导致构成性信号传导的独特克隆JAK2突变导致真性红细胞增多症。自然。2005;434(7037):1144–1148.[公共医学][谷歌学者]
2Kralovics R、Passamonti F、Buser AS等。骨髓增生性疾病中JAK2的获得性功能突变。N英格兰医学杂志。2005;352(17):1779–1790.[公共医学][谷歌学者]
三。Baxter EJ、Scott LM、Campbell PJ等。癌症基因组项目。人类骨髓增生性疾病中酪氨酸激酶JAK2的获得性突变。柳叶刀。2005;365(9464):1054–1061.[公共医学][谷歌学者]
4Zhao ZJ，Vainchenker W，Krantz SB，Casadevall N，Constantinescu SN。酪氨酸激酶和磷酸酶在真性红细胞增多症中的作用。赛明血液。2005;42(4):221–229.[公共医学][谷歌学者]
5Levine RL、Wadleigh M、Cools J等。真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和骨髓样化生伴骨髓纤维化患者酪氨酸激酶JAK2的激活突变。癌细胞。2005;7(4):387–397.[公共医学][谷歌学者]
6Scott LM、Tong W、Levine RL等。真性红细胞增多症和特发性红细胞增生症的JAK2外显子12突变。N英格兰医学杂志。2007;356(5):459–468. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Passamonti F、Elena C、Schnittger S等。与JAK2外显子12突变相关的骨髓增生性肿瘤的分子和临床特征。鲜血。2011;117(10):2813–2816.[公共医学][谷歌学者]
8Pardanani AD、Levine RL、Lasho T等。骨髓增生性疾病和其他髓系疾病中的MPL515突变：对1182名患者的研究。鲜血。2006;108(10):3472–3476.[公共医学][谷歌学者]
9Pikman Y、Lee BH、Mercher T等。MPLW515L是骨髓纤维化伴髓样化生的一种新型体细胞激活突变。公共科学图书馆-医学。2006;三（7） ：e270。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
10Lasho TL、Pardanani A、Tefferi A.JAK2突变阴性红细胞增多症中的LNK突变。N英格兰医学杂志。2010;363(12):1189–1190.[公共医学][谷歌学者]
11Oh ST、Simonds EF、Jones C等。骨髓增生性肿瘤患者抑制性衔接蛋白LNK的新突变驱动JAK-STAT信号传导。鲜血。2010;116(6):988–992. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Pardanani A、Lasho T、Finke C、Oh ST、Gotlib J、Tefferi A.在急变期骨髓增生性肿瘤和TET2、IDH、JAK2或MPL突变的慢性期疾病中的LNK突变研究。白血病。2010;24(10):1713–1718.[公共医学][谷歌学者]
13Verstovsek S、Mesa RA、Gotlib J等。鲁索立替尼治疗骨髓纤维化的双盲安慰剂对照试验。N英格兰医学杂志。2012;366(9):799–807. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Harrison C，Kiladjan JJ，Al-Ali HK，等。ruxolitinib对JAK的抑制与骨髓纤维化的最佳可用治疗。N英格兰医学杂志。2012;366(9):787–798.[公共医学][谷歌学者]
15Nangalia J、Massie CE、Baxter EJ等。JAK2非突变骨髓增生性肿瘤中的体细胞CALR突变。N英格兰医学杂志。2013;369(25):2391–2405. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16Klampfl T、Gisslinger H、Harutyunyan AS等。骨髓增生性肿瘤中钙网蛋白的体细胞突变。N英格兰医学杂志。2013;369(25):2379–2390.[公共医学][谷歌学者]
17Levine RL、Bellisle C、Wadleigh M等。基于X灭活的克隆性分析和JAK2V617F定量评估揭示了PV中的克隆性与JAK2C617F之间的强相关性，但与et/MMM无关，并确定了JAK2V17F阴性et和MMM患者的一个子集，即克隆性造血患者。鲜血。2006;107(10):4139–4141. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Patel JP，Gönen M，Figueroa ME等。急性髓性白血病综合基因分析的预后相关性。N英格兰医学杂志。2012;366(12):1079–1089. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
19MacConaill LE、Campbell CD、Kehoe SM等。分析临床肿瘤样本中的关键癌症基因突变。《公共科学图书馆·综合》。2009;4（11） ：e7887。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Abdel-Wahab O、Mullally A、Hedvat C等。髓系恶性肿瘤中TET1、TET2和TET3改变的遗传特征。鲜血。2009;114(1):144–147. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21Moffat J、Grueneberg DA、Yang X等。应用于阵列病毒高内容屏幕的人和小鼠基因慢病毒RNAi文库。单元格。2006;124(6):1283–1298.[公共医学][谷歌学者]
22Bhattacharjee A、Richards WG、Staunton J等。通过mRNA表达谱对人类肺癌进行分类，发现不同的腺癌亚类。美国国家科学院程序。2001;98(24):13790–13795. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Bolstad BM、Irizarry RA、Astrand M、Speed TP。基于方差和偏差的高密度寡核苷酸阵列数据归一化方法的比较。生物信息学。2003;19(2):185–193.[公共医学][谷歌学者]
24Golub TR，Slonim DK，Tamayo P等。癌症的分子分类：通过基因表达监测进行分类发现和分类预测。科学。1999;286(5439):531–537.[公共医学][谷歌学者]
25Hochberg Y，Benjamini Y。多重显著性测试的更强大程序。统计医学。1990;9(7):811–818.[公共医学][谷歌学者]
26Reich M、Liefeld T、Gould J、Lerner J、Tamayo P、Mesirov JP。基因模式2.0。Nat Genet。2006;38(5):500–501.[公共医学][谷歌学者]
27Gould J，Getz G，Monti S，Reich M，Mesirov JP。比较基因标记选择套件。生物信息学。2006;22(15):1924–1925.[公共医学][谷歌学者]
28Subramanian A、Tamayo P、Mootha VK等。基因集富集分析：解释全基因组表达谱的基于知识的方法。美国国家科学院程序。2005;102(43):15545–15550. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
29Schuringa JJ，Wu K，Morrone G，Moore MA。STAT5A的强制激活促进胚胎干细胞衍生的造血干细胞的生成，从而促进体内造血。干细胞。2004;22(7):1191–1204.[公共医学][谷歌学者]
30Goerttler PS，Kreutz C，Donauer J等。真性红细胞增多症的基因表达谱：转录因子NF-E2的过度表达。英国血液学杂志。2005;129(1):138–150.[公共医学][谷歌学者]
31Pellagatti A、Vetrie D、Langford CF等。使用cDNA微阵列技术进行真性红细胞增多症的基因表达谱分析。癌症研究。2003;63(14):3940–3944.[公共医学][谷歌学者]
32Rice KL、Lin X、Wolniak K等。基因组畸变和基因表达谱分析确定骨髓增生性肿瘤中的新病变和途径。《血癌杂志》。2011;1（11） ：e40。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33.Skov V，Thomassen M，Riley CH等。采用主成分分析的基因表达谱描述了从原发性血小板增多症到真性红细胞增多症再到骨髓纤维化的生物连续性。实验血液学。2012;40(9):771–780.e719页[公共医学][谷歌学者]
34Berkofsky-Fessler W，Buzzai M，Kim MK，等。真性红细胞增多症的转录谱确定了依赖于和独立于JAK2V617F作用的基因表达模式。临床癌症研究。2010;16(17):4339–4352. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35Kralovics R、Teo SS、Buser AS等。骨髓增生性疾病中的基因表达改变与Jak2的V617F突变激活信号相关。鲜血。2005;106(10):3374–3376.[公共医学][谷歌学者]
36Puigdecanet E、Espinet B、Lozano JJ等。基因表达谱分析可区分原发性血小板增多症中JAK2V617F-阴性和JAK2C617F-阳性患者。白血病。2008;22(7):1368–1376.[公共医学][谷歌学者]
37.Schwemmers S、Will B、Waller CF等。JAK2V617F-阴性et患者不显示构成性活性JAK/STAT信号。实验血液学。2007;35(11):1695–1703. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Chen E，Beer PA，Godfrey AL，等。与JAK2V617F相关的不同临床表型反映了差异STAT1信号。癌细胞。2010;18(5):524–535. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
39.Kralovics R、Guan Y、Prchal JT。获得性单亲9p染色体二联体是真性红细胞增多症常见的干细胞缺陷。实验血液学。2002;30(3):229–236.[公共医学][谷歌学者]
40Klippel S、Strunck E、Temerinac S等。PRV-1 mRNA定量可区分真性红细胞增多症和继发性红细胞增生症。鲜血。2003;102(10):3569–3574.[公共医学][谷歌学者]
41Maxson JE、Gotlib J、Pollya DA等。慢性中性粒细胞白血病和非典型CML的癌基因CSF3R突变。N英格兰医学杂志。2013;368(19):1781–1790. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
42Kohlmann A、Grossmann V、Klein HU等。下一代测序技术通过检测TET2、CBL、RAS和RUNX1的频繁变化，揭示72.8%慢性粒单核细胞白血病分子突变的特征模式。临床肿瘤学杂志。2010;28(24):3858–3865.[公共医学][谷歌学者]
43Herrera-Merchan A、Arranz L、Ligos JM、de Molina A、Dominguez O、Gonzalez S。造血干细胞中组蛋白甲基转移酶Ezh2的异位表达导致骨髓增生性疾病。国家公社。2012;10(3):623.[公共医学][谷歌学者]
44Yan D，Hutchison RE，Mohi G.真性红细胞增多症小鼠模型中Stat5的临界要求。鲜血。2012;119(15):3539–3549. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
45Walz C、Ahmed W、Lazarides K等。Stat5a/b在BCR-ABL1和JAK2（V617F）诱导的小鼠骨髓增生性肿瘤中的重要作用。鲜血。2012;119(15):3550–3560. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
46Vainchenker W、Delhommeau F、Constantinescu SN、Bernard OA。骨髓增生性肿瘤的新突变和发病机制。鲜血。2011;118(7):1723–1735.[公共医学][谷歌学者]
47Shih AH、Abdel-Wahab O、Patel JP、Levine RL。表观遗传调控因子突变在髓系恶性肿瘤中的作用。Nat Rev癌症。2012;12(9):599–612.[公共医学][谷歌学者]
48Ko M，Huang Y，Jankowska AM，等。TET2突变的髓系肿瘤中5-甲基胞嘧啶的羟化受损。自然。2010;468(7325):839–843. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
49Pronier E、Almire C、Mokrani H等。抑制TET2介导的5-甲基胞嘧啶向5-羟甲基胞嘧啶的转化会干扰人类造血祖细胞的红系和肉芽肿细胞分化。鲜血。2011;118(9):2551–2555. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
50Ko M，Bandukwala HS，An J，等。Ten-Eleven-Translocation 2（TET2）负调节小鼠造血干细胞的稳态和分化。美国国家科学院程序。2011;108(35):14566–14571. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
51Moran-Crusio K、Reavie L、Shih A等。Tet2缺失导致造血干细胞自我更新和髓样转化增加。癌细胞。2011;20(1):11–24. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
52Quivoron C，CouronnéL，Della Valle V等人。TET2失活导致小鼠多效性造血异常，是人类淋巴结病期间的复发事件。癌细胞。2011;20(1):25–38.[公共医学][谷歌学者]
53Li Z，Cai X，Cai CL，等。小鼠中Tet2基因的缺失导致造血干细胞失调，继而发展为髓系恶性肿瘤。鲜血。2011;118(17):4509–4518. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
54Jamieson CH、Gotlib J、Durocher JA等。真性红细胞增多症患者的造血干细胞中发生JAK2 V617F突变，易导致红细胞分化。美国国家科学院程序。2006;103(16):6224–6229. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
55Akada H，Yan D，Zou H，Fiering S，Hutchison RE，Mohi MG。内源性启动子杂合或纯合Jak2V617F的条件表达诱导真性红细胞增多症。鲜血。2010;115(17):3589–3597. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
56Tefferi A、Lasho TL、Schwager SM等。真性红细胞增多症野生型、杂合型和纯合型JAK2V617F的临床表型。癌症。2006;106(3):631–635.[公共医学][谷歌学者]
57Carbuccia N、Murati A、Trouplin V等。骨髓增生性肿瘤中ASXL1基因的突变。白血病。2009;23(11):2183–2186.[公共医学][谷歌学者]
58Delhommeau F、Dupont S、Della Valle V等。髓系肿瘤TET2的突变。N英格兰医学杂志。2009;360(22):2289–2301.[公共医学][谷歌学者]
59Tefferi A，Lim KH，Levine R.髓系癌TET2突变。N英格兰医学杂志。2009361（11）：1117，作者回复1117-1118。[公共医学][谷歌学者]
60Schaub FX、Looser R、Li S等。TET2和JAK2突变的克隆分析表明，TET2可能是骨髓增生性肿瘤进展的晚期事件。鲜血。2010;115(10):2003–2007.[公共医学][谷歌学者]
61Zhang SJ，Rampal R，Manshouri T，等。骨髓增生性肿瘤白血病转化患者的基因分析显示与不良结果相关的复发性SRSF2突变。鲜血。2012;119(19):4480–4485. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
62Beer PA、Delhommeau F、LeCouédic JP等。JAK2突变阳性骨髓增生性肿瘤后白血病转化的两种途径。鲜血。2010;115(14):2891–2900.[公共医学][谷歌学者]
63Abdel-Wahab O、Manshouri T、Patel J等。慢性骨髓增生性肿瘤转化为白血病的转化事件的遗传分析。癌症研究。2010;70(2):447–452. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
64Fiskus W、Verstovsek S、Manshouri T等。双重PI3K/AKT/mTOR抑制剂BEZ235协同增强JAK2抑制剂对培养和原代人类骨髓增生性肿瘤细胞的活性。摩尔癌症治疗。2013;12(5):577–588.[公共医学][谷歌学者]
65Bartalucci N、Tozzi L、Bogani C等。共同靶向PI3K/mTOR和JAK2信号通路可产生协同作用，对抗骨髓增生性肿瘤。细胞分子医学杂志。2013;17(11):1385–1396. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
66Guglielmelli P、Barosi G、Rambaldi A等。AIRC-Gruppo Italiano Malattie Mielopliferative（AGIMM）研究人员。在一项1/2期骨髓纤维化患者研究中，mTOR抑制剂伊维莫司作为单一药物的安全性和疗效。鲜血。2011;118(8):2069–2076. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自血液由以下人员提供美国血液学会