PAKs抑制剂在体内外改善青春期晚期精神分裂症相关树突棘退化

PAK阻断DISC1敲除合法突触改变的化学抑制剂与NMDA-R激活相关。

我们之前报道了一种生物化学机制，其中Rac1/PAK1级联位于脊椎DISC1的下游(10). 然而，这一概念尚未在功能上得到验证。为了实验证明这一概念，我们在本研究中使用了三种新生成的PAK抑制剂(图2). APV停药后20分钟（例如急性NMDA-R激活），与中显示的延时检查观察结果一致图1，我们观察到DISC1 shRNA使脊椎尺寸显著减小，而对照组的脊椎尺寸增加(图3A类和B类). 使用这些新合成的PAK抑制剂进行治疗（FRAX355、FRAX486和FRAX120:250、500和500 nM，分别为1小时，从APV退出前40分钟开始），可以防止在存在DISC1 shRNA的情况下脊椎尺寸减小(图3B类–D类). 在存在W-7（钙调素抑制剂）和KN-62（CaMKs抑制剂）时观察到类似的保护作用(图3B类–D类). 此外，FRAX355和FRAX486以及W-7和KN-62的治疗使DISC1 shRNA处理的神经元免于脊椎密度的显著下降(图3B类–D类). FRAX 120轻度保护神经元免受脊椎密度降低的影响，但效果并不完全。与W-7和KN-62不同，FRAX355和FRAX486在有对照RNAi存在的情况下并没有完全阻断NMDA-R激活介导的脊柱增大，这表明这些FRAX化合物对突触可塑性的作用较小(图3B类,C，以及E类).

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图2。

PAK抑制剂的特性。三大化合物的化学结构(A类)和药理学特性(B类).

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图3。

PAK的化学抑制剂阻断与NMDA-R激活相关的DISC1敲除合法突触变化。(A类)实验设计。在APV WD前1 h添加浓度为10μM的抑制剂（W-7）、10μM（KN-62）、250 nM（FRAX355）、500 nM（BRAX120）或500 nM的FRAX486），然后将含有相同浓度的抑制剂的APV-WD溶液培养20分钟(B类–E类)脊柱形态计量分析显示每种化合物对APV WD诱导的脊柱结构变化的影响。显示了在每种化合物存在的情况下，脊椎大小和密度的绝对值以及APV WD后的相对大小和密度[∆大小（%）和∆密度（%）]。PAK抑制剂对脊柱收缩的有益作用已被证明。特别是，FRAX355和FRAX486对脊椎密度显示出有益的影响，而不会严重影响突触可塑性**P（P）< 0.01. ***P（P）< 0.001. （比例尺，5μm）

PAK抑制剂可阻止DISC1长时间敲除引起的树突状脊柱缺损的发展。

然后，我们假设这些PAK抑制剂也可以防止由于DISC1敲除延长而导致的脊柱恶化，其中DISC1-Kal-7-Rac1级联参与了(10). 因此，我们在应用DISC1或对照shRNA的同时向培养物中添加PAK抑制剂(图4A类). 为了确定对树突棘的保护作用，我们测量了不同浓度这些化合物存在时的棘的大小和密度。所有三种PAK抑制剂(图2)以剂量依赖的方式完全挽救了因长时间敲低DISC1而导致的脊柱萎缩(图4B类和C和图S1A类和B类和S2系列). PAK抑制剂对健康的脊椎几乎没有影响，因为在控制shRNA的神经元中没有观察到恶化的影响，其剂量高达对抗DISC1 shRNA的突触保护有效剂量的100倍以上(图S3). 这意味着这些化合物具有极宽的治疗指数窗口（有益/毒性效应的剂量比）。

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图4。

PAK抑制剂可防止DISC1 RNAi诱导的脊柱退化（预防作用）。(A类)实验设计。在转染DISC1 RNAi时添加PAK抑制剂，并在固定前培养6天。(B类和C)FRAX120、FRAX355和FRAX486对脊柱大小的保护作用的剂量-反应曲线(B类)和脊椎密度(C)在具有DISC1 shRNA（DISC1 RNAi）的神经元中。星号表示带有载体控制和PAK抑制剂的脊髓之间存在显著差异，这意味着每种化合物的治疗有效剂量*P（P）< 0.05. 虚线表示脊椎的平均大小(B类)和脊柱密度(C)在含有对照shRNA的细胞中（基线）。“Veh”在剂量-反应曲线中表示“仅车辆”。电子计算机₅₀，计算了该预防模式中的半最大有效浓度。

PAK抑制剂逆转因长时间DISC1敲除引起的预先存在的树突状脊柱收缩。

在大多数治疗环境中，旨在治疗疾病的药物应该能够逆转已经存在的缺陷，而不是简单地阻止缺陷的发展。为了在体外重建这种情况，我们检测了PAK抑制剂是否可以逆转DISC1敲除诱导的预先存在的树突状棘缺陷(图5A类和图S1A类和C和S4系列). 用DISC1或对照shRNA对皮层神经元培养物进行5天的预处理，我们之前已经证明这一时间框架足以充分表达树突状棘缺损，然后测试PAK抑制剂的作用(图5A类). 所有三种化合物对脊椎大小都有剂量依赖性的有益影响：FRAX355和FRAX486逆转了树突棘缩小的大小，尽管FRAX120没有完全逆转到野生型水平，但确实显示出一些有益的作用(图5B类). 相比之下，没有任何化合物能够恢复先前存在的DISC1敲低已经降低的脊柱密度(图5C). 在这些条件下，即使在高浓度下，这三种化合物对带有对照shRNA的神经元的脊椎结构的影响也可以忽略不计(图S5).

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图5。

PAK的化学抑制剂可逆转DISC1 RNAi引发的现有脊柱退化（治疗效果）。(A类)实验设计。在对照或DISC1 RNAi转染5天后添加PAK抑制剂，然后在固定前进行3天的培养。(B类和C)FRAX120、FRAX355和FRAX486对脊柱大小逆转作用的剂量-反应曲线(B类)和脊椎密度(C)在神经元中显示DISC1 shRNA。星号表示带载体控制的脊髓和带PAK抑制剂的脊髓之间的显著差异*P（P）< 0.05. 虚线表示脊椎的平均大小(B类)和脊柱密度(C)在含有对照shRNA的细胞中（基线）。“Veh”在剂量-反应曲线中表示“仅车辆”。电子计算机₅₀计算了该治疗模式中的半最大有效浓度。

质粒构建和转染。

先前描述了H1-RNA聚合酶III启动子驱动的抗DISC1的shRNA，其也携带CMV启动子下游的EGFP(10). 使用LipofectAMINE2000（Invitrogen）将培养细胞转染质粒。在原代大鼠皮层神经元培养中，将2μg pSuper-Venus RNAi转染到1.5×10⁵细胞。

神经元培养与治疗。

如前所述制备分离的大鼠皮层神经元培养物(10). 无套管和电生理实验的程序如所述SI材料和方法简单地说，为了测量uEPSC，用补充有5 mM MNI-谷氨酸的氨基-5-磷酸细胞外液（APV-ECS）灌注细胞（Tocris Bioscience）。将双光子非相干激光（720 nm，锁模Ti-Sapphire激光）传输至脊柱头部，对笼状谷氨酸盐进行2 ms的光解。物镜后孔径处的非相干激光强度为20 mW。提取DL-APV（Ascent Scientific）用于NMDA受体的急性化学激活(23,46). 简言之，在APV退出（APV WD）前2天将200μM APV添加到培养皿中，并保存在培养基中。为了治疗APV WD，将细胞预培养在人工脑脊液（ACSF）中（单位：mM:125 NaCl，2.5 KCl，26.2 NaHCO_三，1 NaH₂人事军官₄，11葡萄糖，5肝素，2.5氯化钙_2,和1.25 MgCl₂)使用200μM APV在37°C下保持1小时。然后在提取介质（ACSF加30μM）中清洗盖玻片d日-丝氨酸、100μM苦毒毒素和1μM士的宁），转移到新的提取培养基中20分钟。然后立即固定细胞进行免疫荧光，并如前所述测定脊椎形态。在进行统计分析之前，在不了解转染条件的情况下，至少进行了两次独立分析，通常是三次(图S1). 使用GFP（Invitrogen）抗体和Alexa 488-结合二级抗体（Invit罗gen）。

PAK抑制剂。

小分子嘧啶酮类抑制剂FRAX355和FRAX486是通过传统的结构-活性关系方法设计的，从高通量筛选（HTS）活动中确定的不同化学系列开始。为了找到第1组PAK的抑制剂，我们筛选了12000个化合物的激酶聚焦库。在10μM条件下，检测到符合>50%抑制的标准阈值。所有撞击均以7 pt剂量反应进行随访。HTS活动的结果确定了一类未经取代的嘧啶酮类，表现出中度的第1组抑制作用。进一步优化确定FRAX355和FRAX486为第1组PAK抑制剂。FRAX120是从已发表的文献中鉴定出来的，是一种PAK抑制剂。

根据制造商的方案，使用Z'Lyte激酶分析平台（Invitrogen）进行PAK生化分析。简言之，分析系统由50 mM Hepes（pH 7.5）组成；0.01%BRIJ-35；10 mM氯化镁₂; 1 mM EGTA；2μM底物Ser/Thr19肽用于PAK1，Ser/Thr20肽用于PAK2、PAK3和PAK4（专有生命技术序列）；PAK酶（PAK1为2.42–30.8 ng，PAK2为0.29–6 ng，PAK13为1.5–20 ng，PAK 4为0.1–0.86 ng；实际酶量取决于酶制剂的批量活性）；DMSO中的试验化合物，试验反应中DMSO的最终浓度为1%；和ATPK（K）_米表观（PAK1试验50μM ATP，PAK2试验75μM ATP、PAK3试验100μM ATP和PAK4试验5μM ATP）。总分析体积为10μL。将反应混合物在室温下培养1 h。在激酶反应后，添加5μL显影液A（Life technologies），并在室温下再培养反应混合物1 h。使用400 nm的激发波长和445 nm和520 nm的发射波长在标准荧光板阅读器（Tecan）中分析板。激酶反应的抑制作用由445 nm发射比/520 nm发射比测定。化合物FRAX120、FRAX355和FRAX486的药代动力学数据是使用禁食的雄性C57BL/6小鼠在以下条件下获得的：对于FRAX486，使用1 mg/mL 20%（wt/vol）2-羟丙基-β-环糊精水溶液静脉注射剂量为3 mg/kg，每次口服（o.s.）（PO）在3mg/mL水溶液中的剂量为30mg/kg。对于FRAX355，在10%（vol/vol）二甲基乙酰胺（DMA）水溶液中使用0.6 mg/mL溶液时，静脉注射剂量为3 mg/kg，在2%（vol/vol）DMA水溶液中，PO剂量为10 mg/kg。对于FRAX120，在10%（vol/vol）DMA的盐水中使用0.1 mg/mL溶液，静脉注射剂量为3 mg/kg，在20%（vol/vol）PEG400、1%（vol/VO）吐温80和79%（vol/vo）[0.5%（wt/vol）羧甲基纤维素的水溶液中的2 mg/mL溶液中，PO剂量为10 mg/kg。在体内实验中，从P35到P60每天腹腔注射FRAX486[10μg/BW（g）]一次，大脑水平>175nM。

子宫电穿孔。

该程序是根据已公布的方案进行的，并进行了细微修改(24,25). 简单地说，怀孕的C57BL/6小鼠在胚胎第14.5天（E14.5）被异氟烷麻醉，shRNA质粒（对照或DISC1 shRNA）连同CAG:：Venus载体一起注射到双侧心室。电极脉冲（35V，50ms）双向充电。在两个半球的前额叶皮层表达强烈金星荧光的幼犬被用于进一步的实验。

颅窗手术和活体双光子脊柱成像。

在出生后第35天（P35），用异氟醚麻醉小鼠，腹腔注射甘露醇（4μg/g体重）和地塞米松（7μg/g重量）以防止脑肿胀，并皮下注射酮洛芬（40μg/g重）。根据立体定向坐标，头骨暴露在与前额叶皮层相对应的区域。使用钻头（φ1.8 mm）生成打开的颅骨窗口，该窗口对应于圆形玻璃盖玻片（φ1.8毫米，厚度<0.1毫米）的大小（Matsunami glass）。盖玻片的边缘是用牙胶固定的。使用配备有FV1000激光扫描显微镜系统（FV1000；Olympus）和浸水物镜（60×，N.a.1.0）的立式显微镜（BX61WI；Olymbus）进行体内双光子成像。飞秒脉冲钛蓝宝石激光器（MaiTai）在950nm处用于成像。对于树枝晶图像的三维重建，通过每个像素处荧光值的总和来堆叠步长为0.8μm的XY图像。

我们感谢帕梅拉·塔拉莱博士对这份手稿的批判性阅读，感谢尤基科·莱马女士对手稿和图形的准备。这项工作得到了Silvio O.Conte中心拨款MH-084018（给A.S.）、MH-094268（给A.S，国家精神分裂症和抑郁症研究联盟（A.S.和A.H.-T.）、约翰·霍普金斯大学脑科学研究所（A.S..）、马里兰干细胞研究基金（A.S.:）、日本科学促进会（Y.A.和A.H./T.）、霍华德·休斯医学研究所（R.L.H.）和普雷斯托（A.H.-T）。