跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
免疫学杂志。作者手稿；PMC 2015年6月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
免疫学杂志。2014年6月1日；192(11): 5343–5353.
2014年4月25日在线发布。 数字对象标识：10.4049/jimmunol 1400280年
预防性维修识别码：项目经理4033523
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院584340
PMID：24771857

髓系PTEN缺乏通过促进M2巨噬细胞分化保护肝脏免受缺血再灌注损伤

史悦,#* 饶建华,#*† 朱建军,*‡ 罗纳德·布苏蒂尔,* Jerzy W.Kupiec-Weglinski先生,* 玲珑路,† 王学浩,†和袁寨*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

虽然10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN）在调节细胞增殖中的作用已被明确，但其在免疫反应中的作用仍有待充分认识。在当前的研究中，我们分析了骨髓特异性PTEN在小鼠肝脏部分热缺血模型中调节组织炎症免疫反应的功能。骨髓特异性PTEN基因敲除（KO）通过将针对IR的局部固有免疫反应转向调节型，导致肝脏免受缺血再灌注损伤（IRI）的保护：PTEN KO小鼠IR肝脏中促炎基因的表达选择性降低，抗炎IL-10同时升高，与野生型（WT）小鼠相比。PI3激酶抑制剂和IL-10中和抗体（而非外源性LPS）在这些KO小鼠中重建了肝脏IRI。在细胞水平上，从KO小鼠分离出的Kupffer细胞以及腹腔巨噬细胞表达了较高水平的M2标记物，与WT对应物相比，TLR配体反应产生的TNF-α更低，IL-10更高。它们增强了Stat3和Stat6，但减少了对TLR4刺激的Stat1信号通路激活。氯化钆对KC的灭活增强了髓系PTEN KO小鼠肝脏的促炎免疫激活和IRI增加。因此，髓系PTEN缺乏通过促进M2巨噬细胞分化保护肝脏免受IRI的影响。

介绍

近年来，TLR4激活被认为是肝脏炎症免疫反应对抗IR的关键启动步骤(1-三). 由于促炎和抗炎基因程序都是通过多种细胞内信号通路在TLR4参与下游触发的(4,5)，我们是否可以操纵TLR信号通路来减少其组织损伤的促炎症特性，这个问题对于确定潜在的治疗靶点非常重要。PI3K-Akt信号通路被证明是一种内源性门控系统，可以防止过度的先天免疫反应(6). 缺乏PI3K调节亚单位的小鼠表现出增强的Th1反应，这是由于DC产生的IL-12增加(7). 最近的研究表明，糖原合成酶激酶3β（Gsk3β）是TLR反应负调控途径的关键靶点(8,9). 作为一种组成性活性激酶，Gsk3β在Akt对巨噬细胞的固有免疫刺激下失活，Gsk2β的抑制导致NF-kB驱动的促炎作用减弱，但IL-10、基因表达增加(8,10). 我们已经证明，活性Gsk3β对肝脏对IR的促炎性免疫反应至关重要，因为其抑制剂SB216367能够将肝脏免疫反应转变为以IL-10为主的调节型，并保护肝脏免受IRI的影响(11).

由于PI3K-Akt-Gsk3β信号通路涉及不同细胞类型的细胞功能的多个方面，包括增殖、分化、凋亡和趋化性(12,13)，精确定义其在复杂器官（如肝脏）体内的免疫调节功能需要进行细胞类型特异性分析。特别是，通过DAMP引起的组织损伤会触发对IR的免疫反应，任何实质细胞死亡的调节机制都会对免疫学产生间接影响。因此，该信号通路的非细胞选择性靶向方法，如PI3K或PTEN siRNA的化学抑制剂，将无法区分其体内免疫调节作用的细胞机制。在当前的研究中，我们利用Cre-LoxP系统创建了髓系PTEN KO小鼠，专门研究了肝脏IRI髓系细胞中PI3K的活化。PTEN是一种双特异性蛋白/脂质磷酸酶，是PI3K/Akt信号通路的主要负调控因子。PTEN最初被鉴定为一种肿瘤抑制基因，其功能的丧失刺激细胞生长和生存(14). 小分子抑制剂对其抑制作用已广泛应用于梗死模型中，以改善心肌细胞/神经元凋亡和细胞死亡(15-20). 最近在肝脏IR模型中也测试了PTEN敲除及其特异siRNA(21,22)意味着免疫调节。然而，由于靶细胞特异性、不完全的基因抑制/下调以及化学抑制剂和siRNA的非靶向效应等问题，这些研究只能得出相关结论。我们的骨髓特异性KO模型首次使我们能够明确地确定PTEN是否直接参与了针对IR的肝固有免疫激活。

材料和方法

动物

PTEN-LoxP（加州大学洛杉矶分校洪武博士慷慨捐赠）和髓系特异性Cre小鼠（Lyz2-Cre，马萨诸塞州巴尔港杰克逊实验室）用于制造髓系特异的PTEN-KO小鼠。简言之，纯合PTEN液氧磷/液氧磷首先用纯合Lyz2-Cre小鼠繁殖小鼠，杂合子代（PTEN和Cre）与纯合PTEN回交液氧磷/液氧磷老鼠。使用JAX基因分型协议数据库中描述的标准引物进行小鼠基因分型。动物被安置在加州大学洛杉矶分校的动物设施中，处于特定的无病原体条件下，并根据国家科学院编制并由国家卫生研究所出版的《实验动物护理和使用指南》中概述的标准接受人道护理。

小鼠肝脏IRI模型

实验中使用PTEN正常和缺陷小鼠（6-8周龄）。如前所述(23)给戊巴比妥钠（60 mg/kg i.p）麻醉的小鼠注射肝素（100 mg/kg），并用非创伤性夹阻断肝头叶的动脉和门静脉血供。在肝脏部分热缺血90分钟后，取出夹子，开始肝脏再灌注。在不同的再灌注时间（0、6、24小时）后处死小鼠。Sham对照组接受了相同的操作，但没有血管阻塞。在通过门静脉进行肝脏再灌注之前，给药LPS（1μg/只小鼠，LPS-EK，Invivogen，加利福尼亚州圣地亚哥）或Anti-IL-10（JES5-2A5）或对照Ig（300μg/小鼠，BioXCell，西黎巴嫩，NH）。其他治疗方法包括Wortmanin（WM，1μg/g in 200μl，i.p.Tocris Bioscience）1h，氯化钆（GdCl三，10μg/g，在200μl二甲基亚砜中，腹腔注射Sigma，密苏里州圣路易斯）16小时，在肝缺血开始前。

ANTECH Diagnostics（加利福尼亚州洛杉矶）使用自动分析仪测量血清丙氨酸氨基转移酶（sALT）水平。部分肝脏标本固定在10%的福尔马林缓冲液中，并包埋在石蜡中。肝脏切片（4 m）用苏木精和伊红（HE）染色。采用铃木标准对肝脏IRI的严重程度进行0至4分的盲目分级。无坏死、充血/小叶中心膨胀得分为0，严重充血和大于60%的小叶坏死得分为4(24).

分别使用原代大鼠抗鼠F4/80（北卡罗来纳州罗利AbD Serotec）和Ly6G（北卡罗莱纳州圣何塞BD Biosciences）mAb检测肝巨噬细胞和中性粒细胞。次级生物素化山羊抗鼠IgG（Vector，Burlingame，CA）与免疫过氧化物酶（ABC Kit，Vector）孵育。

MPO分析

测定肝髓过氧化物酶（MPO）活性。简单地说，将冰冻组织解冻并置于0.5%十六烷基三甲基溴化铵和50 mM磷酸钾缓冲溶液（pH=5.0）中。将每个样品均匀化，并在4°C下以15000 rpm离心15分钟。上清液与过氧化氢-醋酸钠和四甲基-联苯胺溶液混合。在655nm处用分光光度法测量吸光度的变化。MPO活性的一个单位被定义为25°C/g组织中每分钟降解1μmol过氧化物的酶的数量。

细胞培养

细胞来源于PTEN-loxP+/+（Cre-ptenL/L）小鼠为PTEN正常/WT；或Lyz2-Cre+/−PTEN-loxP公司+/+（Cre+ptenL/L）小鼠在安乐死后表现为PTEN缺乏/KO（戊巴比妥100mg/Kg，i.p.）。

将1mL 2%Bio-Gel P-100（BioRad，Hercules，CA）注入小鼠腹腔，4天后用无菌PBS腹腔灌洗，产生腹腔巨噬细胞。

KCs分离如下：肝脏经门静脉原位灌注无钙无镁HBSS，辅以2%热灭活FBS，然后再灌注0.27%胶原酶IV（西格玛，圣路易斯，密苏里州）。对灌注的肝脏进行解剖，并通过70μm尼龙网细胞过滤器（BD Biosciences，San Diego，CA）进行梳理。用50g×2min离心3次，从肝细胞中分离出非表皮细胞（NPC）。然后将NPC悬浮在HBSS中，并在50 ml锥形离心管中分层至50%/25%两步percoll梯度（西格玛，圣路易斯，密苏里州）上，并在1800g，4°C下离心15分钟。收集中间层的KC，并在37°C下用10%FBS、10mM HEPES、2mM GlutaMax、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素附着在DMEM中的细胞培养板上15分钟。通过替换培养基去除非粘附细胞。通过F4/80免疫荧光染色评估KCs纯度为80%。

根据制造手册，通过使用免疫磁性CD11b阳性选择试剂盒（STEMCELL Tech.Inc.，Vancouver，BC，Canada）分离脾脏巨噬细胞。在开始使用TLR配体刺激之前，隔夜培养巨噬细胞或KC：100ng/ml LPS-EK，或1 ug/ml LAM-MS，或1ug/ml Poly I:C（InvivoGen，加州圣地亚哥）。在不同刺激时间后收集细胞或培养上清液，用于RNA、蛋白质和ELISA分析。

定量RT-PCR

使用SuperScriptTM III第一链合成系统（Invitrogen，Carlsbad，CA）将总RNA（2.0μg）反转录成cDNA。使用DNA引擎和Chromo 4检测器进行定量PCR（MJ Research，Waltham，MA）。在20μl的最终反应体积中，添加以下物质：1×SuperMix（Platinum SYBR Green qPCR Kit，Invitrogen，Carlsbad，CA）、cDNA和每个引物的0.5 mM。扩增条件为：50°C（2分钟），95°C（5分钟），然后是50个95°C循环（15秒），60°C（30秒）。用于扩增特定小鼠基因片段的引物与前面描述的相同(25).

西方印记

用冰冷的裂解缓冲液（1%Triton X-100，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，10%甘油，137mM氯化钠，20mM Tris，pH 7.4）提取组织或细胞蛋白。蛋白质（20μg）经12%SDS-PAGE电泳后转移到PVDF硝化纤维素膜上。使用针对PTEN、p-AKT、stat3、foxo1、β-actin（细胞信号技术，加利福尼亚州圣地亚哥）和HO-1（压力基因生物技术，加拿大不列颠哥伦比亚省维多利亚州）的抗体进行Western blot分析。

酶联免疫吸附试验

根据制造商的方案（eBioscience，San Diego，CA），通过ELISA测量细胞培养上清液或血清中的细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-12p40和IL-10）分泌。

统计分析

结果显示为平均值±SD。使用非配对Student t检验进行统计分析，p<0.05（双尾）被视为显著。

结果

髓系PTEN缺乏保护肝脏免受IRI

三种不同的PTEN小鼠，包括PTEN-loxP+/+（Cre-ptenL/L），Lyz2-Cre+/−PTEN-loxP公司+/−（Cre+ptenL/-）和Lyz2-Cre+/−PTEN-loxP公司+/+（Cre+ptenL/L），骨髓细胞中PTEN正常、单倍体或完全缺失，如腹腔巨噬细胞PTEN的Western blots所示(图1a，顶部面板），用于我们的肝脏IRI实验。虽然WT和髓系PTEN KO小鼠的总肝组织PTEN水平相似，但证实了肝脏非实质细胞和实质细胞中的选择性PTEN缺乏(图1a，下部面板）。与其抑癌功能不同，髓系PTEN以单倍体充分的方式调节肝脏IRI的发展：只有PTEN完整，但不是单倍体，缺陷保护小鼠免受肝脏IRI，如sALT水平较低和保存较好的肝脏结构（S/E染色）以及铃木评分较低所示，Cre+ptenL/L小鼠在再灌注6和24小时时，但Cre+ptentL/-或Cre-ptenL/L小鼠没有(图1b). 事实上，与对照组动物相比，PTEN KO小鼠的IR肝脏表现出更少的水肿、最小的窦性充血和细胞质空泡化，并减少了肝细胞坏死。髓系PTEN对IR的肝脏促炎免疫反应也有类似的调节作用，表现为促炎基因（包括TNF-a、IL-6、IL-1b、CXCL10和IL-12p40）的诱导率较低，而抗炎IL-10基因的诱导率较高，仅在完全PTEN KO小鼠（而非单倍体）的肝脏中(图1c).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-584340-f0001.jpg

完全髓系PTEN KO保护肝脏免受IRI的影响。PTEN loxP+/+（无Cre），Lyz-Cre+/−PTEN-loxP公司+/−（Cre+PTEN L/-）和Lyz-Cre+/−PTEN-loxP公司+/+（Cre+PTEN L/L）小鼠用于材料和方法中描述的肝脏IR实验。（a） 从WT或髓系PTEN KO小鼠分离的腹膜巨噬细胞、肝组织、肝细胞和NPC中PTEN的蛋白质印迹。（b） 分别观察假手术组和缺血90m组小鼠血清ALT、肝组织病理学（H/E染色）Suzuki评分，再灌注0、6、24h后的变化。显示典型的水肿（E）、窦性充血（SC）、细胞质空泡化（CV）和肝细胞坏死（N）区域。（c） 定量RT-PCR分析不同时间再灌注后，非手术和缺血肝脏中炎症基因的表达。针对不同的实验组绘制了靶基因与HPRT的比值。条形标签与（b）中的相同。两个不同实验的代表性结果。N=3-4/组*p<0.05，**p<0.01。

由于PTEN是一种肿瘤抑制基因并调节细胞增殖，我们比较了WT和髓系PTEN KO小鼠的髓系细胞组成。外周血（数据未显示）和肝脏（F4/80）中的单核细胞和中性粒细胞数量增加+或Ly6G+与WT对照组相比，KO动物假手术中的细胞）。然而，它们对IR的反应是减少了肝脏的炎症浸润。与PTEN正常细胞显著增加形成鲜明对比的是，PTEN缺乏F4/80+再灌注后6h，IR肝脏中的细胞没有增加（或有减少的趋势）；PTEN缺乏Ly6G+再灌注后6和24小时，IR肝脏中细胞的增加程度均显著低于正常细胞(图2a、b). 再灌注6和24小时，KO小鼠的肝脏MPO活性也降低(图2c). 因此，髓系PTEN缺乏可保护肝脏免受IRI的影响。这可能是由于KO小鼠的髓系细胞功能受损，而非细胞耗竭所致。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms-584340-f0002.jpg

髓样PTEN-KO减少了来自PTEN-loxP的IR.Sham和缺血肝组织中的肝髓样细胞浸润和活化+/+（WT）和Lyz-Cre+/−PTEN-loxP公司+/+再灌注6和24小时后取（KO）小鼠。（a） 用F4/80和Ly6G抗体免疫组织化学染色分析再灌注后6和24小时假肝、IR肝的巨噬细胞和中性粒细胞浸润。箭头表示阳性细胞。（b） F4/80+或Ly6G+细胞通过计数阳性细胞数/面积进行定量。（c） 还测量了这些肝组织中的髓过氧化物酶（MPO）活性。两个不同实验的代表性结果。N=3-4/组*p<0.05，**p<0.01。

PI3激酶激活依赖性IL-10诱导对髓系PTEN KO小鼠的肝脏保护作用

由于PTEN可以通过PI3K依赖性和非依赖性途径发挥作用，我们通过使用PI3K抑制剂沃特曼（wortmanin）来确定髓系PTEN缺乏小鼠的肝脏保护是否依赖于PI3K激活。事实上，注射抑制剂可以恢复KO小鼠的肝脏IRI，其证据是sALT水平增加，肝组织结构受损更严重（H/E染色），铃木得分更高(图3a). 正如我们之前的研究所报告的那样，使用沃特曼的WT小鼠的肝脏IRI没有显著增加（数据未显示）(11). 没有。此外，在抑制剂治疗的骨髓PTEN KO小鼠中，肝内TNF-a、IL-1b、IL-6、IL-12p40和CXCL10转录水平升高，而IL-10降低，从而重新产生了针对IR的肝脏促炎免疫反应(图3b). 因此，PI3K激活对于髓系PTEN缺陷小鼠的肝脏免疫调节免疫应答和IRI保护至关重要。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-584340-f0003.jpg

PI3激酶激活可保护髓系PTEN KO小鼠的肝脏免受IRI的影响。PTEN-loxP公司+/+（WT）和Lyz-Cre+/−PTEN-loxP公司+/+如材料和方法所述，在我们的肝脏IR实验中使用（KO）小鼠。另外还包括一组在肝缺血开始前接受PI3K抑制剂沃特曼（WM）治疗的KO小鼠。（a） 在再灌注后6小时，通过测量sALT、Suzuki Standard评分的肝脏组织学分析（H/E染色）来评估肝脏IRI。显示典型的水肿（E）、窦性充血（SC）、细胞质空泡化（CV）和肝细胞坏死（N）区域。（b） 通过定量RT-PCR分析假手术和IR肝脏中炎症基因的表达，确定肝脏对IR的免疫反应。针对不同的实验组绘制目标基因表达水平与看家基因HPRT的比值。两个不同实验的代表性结果。N=3-4/组*p<0.05，**p<0.01。

为了测试IL-10在髓系PTEN缺乏性肝保护中的功能意义，我们在肝缺血开始前给予抗IL-10抗体。此外，将LPS注射到单独的KO小鼠组中，以确定缺乏TLR激活是否在PTEN缺陷小鼠对IR反应的缺陷炎症免疫反应中起作用。在再灌注后6h测量肝脏损伤和免疫反应。我们的结果清楚地表明，抗IL-10（而非LPS）可以恢复肝脏IRI和促炎性免疫激活。PTEN KO小鼠经抗IL-10而非LPS治疗后，sALT水平显著升高，肝组织病理学（H/E染色）恶化，铃木评分升高(图4a、b). 经qRT-PCR测定，同一组KO小鼠的肝细胞因子/趋化因子诱导也增加，包括TNF-a、IL-6、IL-1b、IL-14p40和CXCL10(图4c). 不同处理对IL-10基因的诱导没有太大差异。因此，髓系PTEN缺乏通过IL-10介导的免疫调节机制保护肝脏免受IRI的影响。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-584340-f0004.jpg

髓系PTEN KO通过IL-10依赖机制保护肝脏抵抗IRI。如材料和方法所述，在KO小鼠肝缺血后和门静脉再灌注开始前，给其注射抗IL-10抗体或LPS。未经任何处理的WT和KO小鼠也被纳入对照组。在再灌注后6小时，通过测量sALT（a）和肝脏组织学分析来评估肝脏IRI（b.H/E染色：显示典型的水肿（E）、正弦充血（SC）、细胞质空泡化（CV）和肝细胞坏死（N）区域）。通过定量RT-PCR分析IR肝脏中炎症基因的表达来确定肝脏对IR的免疫反应（c）。针对不同的实验组绘制目标基因表达水平与看家基因HPRT的比值。两个不同实验的代表性结果。N=3-4/组*p<0.05，**p<0.01，NS：无显著差异。

PTEN调节巨噬细胞分化

由于KCs是IR中肝脏天然免疫激活的主要反应细胞，我们确定髓系PTEN KO是否影响其功能。从对照和KO小鼠的肝脏中分离出KCs和脾巨噬细胞，并在体外用LPS刺激。ELISA结果显示，与WT对照组相比，PTEN KO KCs和脾巨噬细胞在TLR刺激下产生的TNF-α和IL-10显著减少(图5a).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms-584340-f0005.jpg

PTEN缺乏导致M2巨噬细胞发育。（a） KCs和WT和髓系PTEN KO小鼠脾巨噬细胞产生的细胞因子。如材料和方法所述，从WT或KO小鼠中分离出肝和脾巨噬细胞，并在有或无LPS刺激的体外培养24h。ELISA法检测培养上清中TNF-α和IL-10的水平。（b） 从WT和PTEN KO小鼠分离腹腔巨噬细胞，用qRT-PCR检测M1/M2标记基因的表达。注意，左侧Y轴用于Arg.，右侧Y轴用于Mrc和Nos2。（c） 腹腔巨噬细胞产生的炎症细胞因子/趋化因子。在TLR刺激前，细胞在体外培养24小时。用ELISA法测定刺激24h后培养上清液中的细胞因子。两个不同实验的代表性结果。N=3/组*p<0.05，**p<0.01。

巨噬细胞可分为两种不同类型，经典的促炎M1或替代免疫调节M2。为了确定PTEN KO是否导致M2巨噬细胞的发育，我们通过定量RT-PCR测量了KC和腹腔巨噬细胞中巨噬细胞分化标记物的表达。显然，PTEN KO细胞表达的精氨酸酶1、Mrc1水平较高，而Nos2基因水平较低(图5b). 在功能上，这些KO巨噬细胞产生的TNF-a、IL-6、IL-12p40和CXCL10明显少于对LPS反应的WT细胞，但产生的IL-10更多(图5c). 此外，它们对其他TLR配体的反应也变得不那么容易引发炎症：对TLR2配体的TNF-α和IL-6更少；TNF-a、IL-12p40、CXCL10较少，但针对TLR3配体的IL-10较多(图5c). 此外，Western blot结果显示，这些KO细胞对LPS刺激的反应是Stat1的活化（磷酸化）降低，但Stat3和Stat6的活化增强(图6). 与限制PI3激酶激活的作用一致，PTEN KO导致其结构性激活，因为在TLR刺激之前，Akt在S473和T308位点都被磷酸化。刺激后Akt磷酸化进一步升高(图6). 因此，PTEN调节巨噬细胞分化，其缺乏导致M2巨噬细胞的发育。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-584340-f0006.jpg

巨噬细胞胞内信号通路激活。用LPS刺激腹腔巨噬细胞0、30m、1h或6h，制备细胞裂解物并用Western blots进行分析，以确定细胞内信号分子的活化（磷酸化）。两个不同实验的代表性结果。

PTEN缺乏的KCs保护肝脏免受IRI的影响

测试体内PTEN KO巨噬细胞对IR、GdCl的潜在免疫调节功能三用于在肝缺血开始前使这些细胞失活。与之前的报告一致，GdCl三-治疗后的WT小鼠肝结构保存较好，sALT水平降低（HE染色）(图7a、b). 与载体治疗的对照组相比，肝脏炎症基因诱导，包括TNF-a、IL-1b、IL-6、IL-12b、CXCL10和IL-10，也有所减少(图7c). 相比之下，GdCl三-与对照组相比，经治疗的KO小鼠的sALT和肝脏促炎基因表达水平增加。然而，KO小鼠的IL-10基因水平被治疗下调。因此，与对WT小鼠的保护作用不同，GdCl三治疗导致髓系PTEN KO小鼠肝脏IRI增加，组织促炎免疫激活增强，表明PTEN KO-巨噬细胞在肝脏IRI发病机制中发挥抗炎作用。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms-584340-f0007.jpg

PTEN KO巨噬细胞保护肝脏免受IRI、盐或GdCl的影响三如材料和方法所述，在肝缺血开始前24小时给药。在再灌注后6小时，通过测量sALT（a）和肝脏组织学分析来评估肝脏IRI（b.H/E染色：显示典型的水肿（E）、正弦充血（SC）、细胞质空泡化（CV）和肝细胞坏死（N）区域）。通过定量RT-PCR分析IR肝脏中炎症基因的表达来确定肝脏对IR的免疫反应（c）。针对不同的实验组绘制目标基因表达水平与看家基因HPRT的比值。两个不同实验的代表性结果。N=3-4/组*p<0.05，**p<0.01。

讨论

我们目前的研究提供了强有力的证据，证明PTEN通过调节巨噬细胞的分化和激活，直接参与肝脏对IR的固有免疫反应。髓样PTEN缺乏导致M2型巨噬细胞的发育，M2型细胞通过产生调节性炎症反应，产生较高水平的IL-10，但较低水平的TNF-a、IL-6和CXCL10，对IR诱导的先天性免疫刺激作出反应，从而保护肝脏免受IRI的影响。这些发现确立了PTEN在临床相关疾病模型中的内在免疫调节作用，并为我们选择性靶向该信号通路提供了理论依据，作为一种新的治疗策略来改善组织炎症疾病。

髓系PTEN缺陷小鼠以前曾被用于研究其在先天免疫反应中的作用。体外实验表明，与WT对照组相比，PTEN KO巨噬细胞中TNF-a的生成在Fcγ受体刺激下增加，但在对抗LPS时减少，从而负调控Fcγ感受器，但支持TLR4，发出信号(26). 这些PTEN KO巨噬细胞也表现出增强的吞噬能力。在小鼠肺炎球菌肺炎模型中，髓系PTEN缺乏可抑制肺部炎症，减少中性粒细胞浸润，但增加吞噬作用，从而减少组织损伤，提高生存率(27). 对中性粒细胞（另一种类型的髓细胞）的研究表明，PTEN在体内外均抑制中性粒细胞的趋化性(28-30). 在中性粒细胞减少相关肺炎模型中，PTEN缺陷的中性粒细胞和巨噬细胞事实上在炎症肺部积聚更多，导致促炎细胞因子和趋化因子的产生增加(29)这与我们在肝脏炎症损伤模型中的发现非常不同。因此，髓系PTEN如何调节免疫反应可能会有很大差异，这可能是由于疾病发病的细胞和分子机制不同。

我们的结果表明，IR-诱导的髓系PTEN KO小鼠肝脏炎症得到缓解。尽管在这些KO动物的假肝脏中巨噬细胞和中性粒细胞都处于较高水平，但它们对IR没有反应。肝巨噬细胞是IR的主要反应细胞，负责触发组织炎症，导致中性粒细胞活化和浸润。PTEN KO抑制巨噬细胞促炎反应将导致中性粒细胞浸润/活化减少。事实上，我们发现PTEN KO巨噬细胞成为抗炎M2型，在先天性TLR刺激下积极分泌IL-10。因此，中性粒细胞可能已被PTEN KO巨噬细胞产生的调节性免疫反应灭活。我们的发现支持了这一点，即GdCl3可灭活KCs/巨噬细胞，抗IL-10抗体可逆转髓系PTEN KO小鼠的肝脏免疫反应性质并重建IRI。在这两种情况下，局部先天免疫细胞，DC和中性粒细胞，不受KC/IL-10介导的免疫调节，并在IR反应中被激活。

作为生存前PI3K-Akt信号通路的关键负调控因子，PTEN在脑和心肌缺血再灌注损伤模型中得到了广泛研究。PTEN短暂下调被证明是对这些组织缺血的一种生理反应。PTEN的翻译后修饰，包括蛋白水解降解、磷酸化和泛素介导的核重定位，是导致其脂质磷酸酶活性降低的原因，这与PI3K活化有关(15,31,32). PI3K/Akt激活与缺血预处理密切相关，缺血预处理是一种最有效的IRI保护程序。因此，PTEN的药物抑制剂，如双过氧钒（bpv），可以在功能上模拟缺血预处理。事实上，多项研究表明PTEN抑制可保护大脑/心脏免受中风/梗死(16,18,20,33-35). 抑制胱天蛋白酶3的激活和促进mTOR的激活与bpv的有益作用有关(16,36). 在体外，PI3K的激活对肝细胞预处理抗缺氧/再灌注至关重要(37)它可以被bpv模仿并转化为体内对肝脏IRI的保护(38). 最近，使用siRNA敲低PTEN的研究表明，可以促进肝脏中的Akt/beta-catenin/Foxo1信号传导，导致抗凋亡基因诱导的局部增强(21). 虽然肝脏炎症免疫反应也降低了，但这可能不是对肝脏固有免疫细胞的直接影响，而是通过减少坏死实质细胞释放DAMP的间接影响，而坏死实质细胞通过PTEN抑制/下调保护其免受IR诱导的细胞死亡。有趣的是，我们观察到髓系PTEN缺乏并不影响肝脏总PTEN水平，只有巨噬细胞中完整的PTEN KO表现出显著的免疫调节作用。这表明肝细胞PTEN在肝脏中占主导地位。只有细胞特异性遗传方法才能使我们在不受肝细胞干扰的情况下，对肝固有免疫细胞中的PTEN功能产生异议。因此，我们的研究是首次在组织缺血再灌注模型中记录PTEN的免疫调节功能。

PTEN以“单倍体充足”的方式调节肝脏对IR的免疫反应：仅在总骨髓PTEN缺乏的动物中观察到显著作用。这与它的抑癌功能形成鲜明对比，即杂合性的丧失或其表达/活性的部分抑制足以促进致癌。肝细胞特异性PTEN KO随着年龄增长诱导肝细胞肥大、肝细胞腺瘤和肝细胞癌，并促进脂肪性肝炎和肝纤维化的发展(39,40). 在我们的髓系PTEN缺乏小鼠中，外周血和肝组织中中性粒细胞和单核细胞的细胞数量增加，这与其在细胞增殖中的作用一致。然而，这些细胞的功能发生了改变。肝脏和脾脏的组织巨噬细胞以及腹膜的组织巨噬细胞在TLR配体的促炎免疫激活方面都存在缺陷。PTEN正常的同一种动物的DC仍然能够产生与野生动物相似的先天免疫反应（数据未显示）。我们的体内KC耗竭实验的结果支持了这一点，在该实验中，PTEN KO小鼠在服用GdCl后肝脏炎症和损伤被重新制造三治疗。

由于PTEN负性调节PI3激酶的激活，其缺陷导致该激酶途径的组成性激活，正如Akt磷酸化水平升高所证明的那样。我们的结果表明，PI3K激活对PTEN KO小鼠的肝脏保护表型至关重要，这实际上促进了M2型巨噬细胞的分化。M2巨噬细胞可以保护肾脏、大脑和后肢免受缺血损伤(41-43)通过促进组织炎症的消退或愈合/恢复。我们的研究扩展了其在肝脏IRI中的作用。从机制上讲，PI3K-Akt-mTOR通路已被证明调节巨噬细胞分化(44,45)，通过部分miR-155上调。在PTEN KO细胞中M2分化程序的分子细节尚待确定。

总之，我们的数据记录了PTEN在肝脏炎症反应中对IR的先天免疫调节作用。其在巨噬细胞中的基因失活导致其分化为抗炎M2型，通过IL-10依赖机制保护肝脏免受IRI的影响。

致谢

拨款支持：NIH拨款RO1 DK083408（YZ），杜蒙特研究基金会；和中国自然科学基金（批准号：81100270、81070380、30872390、1310108001、81210108017）（XW）

缩写

PTEN公司10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物
红外线缺血再灌注
爱尔兰共和国缺血再灌注损伤
KC公司库普弗电池
击倒对手淘汰赛
重量野生型
国家石油公司非鳃上皮细胞
PI3K系列磷酸肌醇3激酶
盐血清丙氨酸氨基转移酶
重量野生型

工具书类

1Fiorini RN、Shafizadeh SF、Polito C、Rodwell DW、Cheng G、Evans Z、Wan C、Belden S、Haines JK、Birsner J、Lewin D、Wasiluk KR、Dunn DL、Schmidt MG、Chavin KD。抗内毒素单克隆抗体对脂肪变性小鼠的肝脏缺血/再灌注损伤具有保护作用。《美国移植杂志》。2004;4:1567–1573.[公共医学][谷歌学者]
2Tsung A、Sahai R、Tanaka H、Nakao A、Fink MP、Lotze MT、Yang H、Li J、Tracey KJ、Geller DA、Billar TR。核因子HMGB1介导小鼠肝脏缺血再灌注后的肝损伤。《实验医学杂志》。2005;201:1135–1143. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
三。翟Y、沈XD、奥康奈尔R、高F、拉斯曼C、布苏蒂尔RW、郑G、库皮切·维格林斯基JW。前沿：TLR4激活通过IFN调节因子3依赖性MyD88依赖性通路介导肝脏缺血/再灌注炎症反应。免疫学杂志。2004;173:7115–7119.[公共医学][谷歌学者]
4Takeda K，Kaisho T，Akira S.Toll样受体。免疫学年度回顾。2003;21:335–376.[公共医学][谷歌学者]
5.Akira S，Takeda K。Toll样受体信号。Nat Rev免疫学。2004;4:499–511.[公共医学][谷歌学者]
6Fukao T、Koyasu S.PI3K和TLR信号的负调控。趋势免疫。2003;24:358–363.[公共医学][谷歌学者]
7Fukao T、Tanabe M、Terauchi Y、Ota T、Matsuda S、Asano T、Kadowaki T、Takeuchi T、Koyasu S.PI3K介导的DC IL-12产生的负反馈调节。自然免疫学。2002;三:875–881.[公共医学][谷歌学者]
8Martin M，Rehani K，Jope RS，Michalek SM。糖原合成酶激酶3对Toll样受体介导的细胞因子产生进行差异调节。自然免疫学。2005;6:777–784. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
9.Beurel E，Michalek SM，Jope RS。糖原合成酶激酶-3（GSK3）调节的先天性和适应性免疫反应。趋势免疫。2010;31:24–31. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
10Ohtani M、Nagai S、Kondo S、Mizuno S、Nakamura K、Tanabe M、Takeuchi T、Matsuda S、Koyasu S。雷帕霉素和糖原合成酶激酶3的哺乳动物靶点对树突状细胞中脂多糖诱导的白细胞介素-12的产生进行差异调节。鲜血。2008;112:635–643. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
11任F，段Z，程Q，沈X，高F，白L，刘J，Busuttil RW，Kupiec-Weglinski JW，Zhai Y.抑制糖原合成酶激酶3β通过白细胞介素-10介导的免疫调节机制改善肝脏缺血再灌注损伤。肝病学。2011;54:687–696. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12她的I，Vincent EE，Tavare JM.Akt在健康和疾病中发出信号。细胞信号。2011;23:1515–1527.[公共医学][谷歌学者]
13Hemmings BA、Restuccia DF。PI3K-PKB/Akt途径。冷泉Harb Perspect生物。2012;4：a011189。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Song MS，Salmena L，Pandolfi PP。PTEN肿瘤抑制剂的功能和调节。Nat Rev Mol细胞生物学。2012;13:283–296.[公共医学][谷歌学者]
15Cai Z，Semenza GL.PTEN活性在缺血和再灌注期间受到调节：参与预处理的诱导和衰退。圆形Res。2005;97:1351–1359.[公共医学][谷歌学者]
16Keyes KT，Xu J，Long B，Zhang C，Hu Z，Ye Y.PTEN的药理抑制限制心肌梗死面积，改善梗死后左心室功能。美国生理学杂志心脏循环生理学。2010;298：H1198–1208。[公共医学][谷歌学者]
17Li D，Qu Y，Mao M，Zhang X，Li J，Ferriero D，Mu D.PTEN-AKT-FOXO3a通路在发育期大鼠缺氧缺血性脑损伤后神经元凋亡中的作用。大脑血流代谢杂志。2009;29:1903–1913. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Mao L，Jia J，Zhou X，Xiao Y，Wang Y，Mao X，Zhen X，Guan Y，Alkayed NJ，Cheng J。延迟服用PTEN抑制剂BPV可改善实验性卒中后的功能恢复。神经科学。2013;231:272–281. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
19Siddall HK，Warrell CE，Yellon DM，Mocanu MM。缺血再灌注损伤与心脏保护：利用PTEN单倍体不足的先天模型研究PTEN，即负性调节PI3K的磷酸酶。基础研究心脏病学。2008;103:560–568.[公共医学][谷歌学者]
20赵J，瞿Y，吴杰，曹M，Ferriero DM，Zhang L，Mu D.PTEN抑制可预防缺氧缺血后大鼠皮层神经元损伤。神经科学。2013;238:242–251.[公共医学][谷歌学者]
21Kamo N、Ke B、Busuttil RW、Kupiec-Weglinski JW。PTEN介导的Akt/beta-catenin/Foxo1信号调节小鼠肝脏缺血/再灌注损伤的固有免疫反应。肝病学。2013;57:289–298. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Ke B、Shen XD、Ji H、Kamo N、Gao F、Freitas MC、Busuttil RW、Kupiec-Weglinski JW。小鼠肝脏缺血/再灌注损伤中HO-1-STAT3轴：通过PI3K/PTEN信号调节TLR4先天性反应。肝素杂志。2012;56:359–366. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Shen XD、Ke B、Zhai Y、Amersi F、Gao F、Anselmo DM、Busuttil RW、Kupiec-Weglinski JW。CD154-CD40 T细胞共刺激通路在肝脏缺血/再灌注损伤的机制中是必需的，其阻断促进并依赖于血红素氧化酶-1介导的细胞保护。移植。2002;74:315–319.[公共医学][谷歌学者]
24Suzuki S、Toledo-Pereyra LH、Rodriguez FJ、Cejalvo D.中性粒细胞浸润是肝脏缺血和再灌注损伤的重要因素。FK506和环孢素的调节作用。移植。1993;55:1265–1272.[公共医学][谷歌学者]
25翟Y、沈XD、高F、赵A、弗雷塔斯MC、拉斯曼C、卢斯特AD、布苏蒂尔RW、库皮埃克·韦格林斯基JW。CXCL10调节肝脏对缺血和再灌注损伤的固有免疫反应。肝病学。2008;47:207–214.[公共医学][谷歌学者]
26Cao X，Wei G，Fang H，Guo J，Weinstein M，Marsh CB，Ostrowski MC，Tridandapani S。肌醇3-磷酸酶PTEN负调节Fcγ受体信号，但支持小鼠腹腔巨噬细胞中Toll样受体4信号。免疫学杂志。2004;172:4851–4857.[公共医学][谷歌学者]
27Schabbauer G、Matt U、Gunzl P、Warszawska J、Furtner T、Hainzl E、Elbau I、Mesteri I、Doninger B、Binder BR、Knapp S.髓样PTEN在小鼠肺炎球菌肺炎期间促进炎症，但损害杀菌活性。免疫学杂志。2010;185:468–476.[公共医学][谷歌学者]
28Sarraj B、Massberg S、Li Y、Kasorn A、Subramanian K、Loison F、Silberstein LE、von Andrian U、Luo HR。肿瘤抑制因子PTEN的髓细胞特异性缺失增强了炎症过程中中性粒细胞的跨内皮迁移。免疫学杂志。2009;182:7190–7200. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
29Li Y，Jia Y，Pichavant M，Loison F，Sarraj B，Kasorn A，You J，Robson BE，Umetsu DT，Mizgerd JP，Ye K，Luo HR。靶向性删除抑癌基因PTEN可增强中性粒细胞减少相关肺炎的中性粒细胞功能，增强宿主防御。鲜血。2009;113:4930–4941. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30Subramanian KK、Jia Y、Zhu D、Simms BT、Jo H、Hattori H、You J、Mizgerd JP、Luo HR。肿瘤抑制剂PTEN是趋化因子介导的中性粒细胞功能的生理抑制剂。鲜血。2007;109:4028–4037. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Choi JS、Park HJ、Kim HY、Kim SY、Lee JE、Choi YS、Chun MH、Chong JW、Lee MY。短暂前脑缺血后大鼠海马星形胶质细胞PTEN和Akt的磷酸化。细胞组织研究。2005;319:359–366.[公共医学][谷歌学者]
32Howitt J、Lackovic J、Low LH、Naguib A、Macintyre A、Goh CP、Callaway JK、Hammond V、Thomas T、Dixon M、Putz U、Silke J、Bartlett P、Yang B、Kumar S、Trotman LC、Tan SS。Ndfip1在体内调节核铂的输入，以促进脑缺血后神经元的存活。细胞生物学杂志。2012;196:29–36. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Wu J，Li J，Hu H，Liu P，Fang Y，Wu D.Rho激酶抑制剂fasudil通过大鼠脑缺血半暗带中Akt激活和PTEN失活防止神经元凋亡。细胞分子神经生物学。2012;32:1187–1197.[公共医学][谷歌学者]
34Guo JY，Ding J，Yuan F，Chen H，Chen SW，Tian HL。双过氧钒对大鼠缺血/再灌注损伤模型急性脑缺血的剂量依赖性保护作用。国际分子科学杂志。2013;14:12013–12022. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35吴丹恩，裴丹生，王强，张国荣。在大鼠海马脑缺血期间，正钒酸钠下调PTEN通过PI3-K/Akt抑制ASK1激活。神经科学快报。2006;404:98–102.[公共医学][谷歌学者]
36石光东，欧阳毅，石继刚，刘毅，袁伟，贾力士。PTEN缺失通过激活mTOR信号通路预防缺血性脑损伤。生物化学与生物物理研究委员会。2011;404:941–945.[公共医学][谷歌学者]
37Carini R、Grazia De Cesaris M、Splendore R、Baldanzi G、Nitti MP、Alchera E、Filigheddu N、Domenicotti C、Pronzato MA、Graziani A、Albano E。磷脂酰肌醇3-激酶在肝细胞预适应发展中的作用。胃肠病学。2004;127:914–923.[公共医学][谷歌学者]
38Dal Ponte C、Alchera E、Follenzi A、Imarisio C、Prat M、Albano E、Carini R。药物后处理可防止肝脏缺血/再灌注损伤。肝脏转运。2011;17:474–482.[公共医学][谷歌学者]
39Horie Y、Suzuki A、Kataoka E、Sasaki T、Hamada K、SasakiJ、Mizuno K、Hasegawa G、Kishimoto H、Iizuka M、Naito M、Enomoto K、Watanabe S、Mak TW、Nakano T。肝细胞特异性Pten缺乏会导致脂肪性肝炎和肝细胞癌。临床投资杂志。2004;113:1774–1783. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
40Stiles B，Wang Y，Stahl A，Bassilian S，Lee WP，Kim YJ，Sherwin R，Devaskar S，Lesche R，Magnuson MA，Wu H.阴性调节物Pten的肝特异性缺失导致脂肪肝和胰岛素超敏反应[已纠正]。美国国家科学院院刊。2004;101:2082–2087. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
41Zhang MZ、Yao B、Yang S、Jiang L、Wang S、Fan X、Yin H、Wong K、Miyazawa T、Chen J、Chang I、Singh A、Harris RC。CSF-1信号调节急性肾损伤的恢复。临床投资杂志。2012;122:4519–4532. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
42武田Y、科斯塔S、德拉马雷E、隆卡尔C、莱特·德·奥利维拉R、斯夸德里托ML、菲尼斯格拉V、德斯霍梅克尔S、布鲁耶尔F、韦内斯M、哈姆A、塞尔内尔斯J、马加特J、巴塔查里亚T、阿尼西莫夫A、乔丹BF、阿利塔罗K、麦克斯韦P、加勒兹B、庄ZW、赛托Y、西蒙斯M、德帕尔马M、马佐尼M。Phd2单倍型噬菌体倾斜通过诱导动脉生成预防缺血。自然。2011;479:122–126. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
43Lee S、Huen S、Nishio H、Nishio S、Lee HK、Choi BS、Ruhrberg C、Cantley LG。不同的巨噬细胞表型有助于肾脏损伤和修复。《美国肾脏病杂志》。2011;22:317–326. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
44Byles V、Covarrubias AJ、Ben-Sahra I、Lamming DW、Sabatini DM、Manning BD、Horn T。TSC-mTOR途径调节巨噬细胞极化。国家公社。2013;4:2834. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
45.Arranz A、Doxaki C、Vergadi E、Martinez de la Torre Y、Vaporidi K、Lagoudaki ED、Ieronymaki E、Androulidaki A、Venihaki M、Margioris AN、Stathopoulos EN、Tsichlis PN、Tsatsanis C.Akt1和Akt2蛋白激酶对巨噬细胞极化有不同贡献。美国国家科学院院刊。2012;109:9517–9522. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]