CKD是糖尿病的主要并发症。此外，糖尿病仍然是导致终末期肾功能衰竭和需要肾移植的最常见原因。1糖尿病肾病的潜在机制尚不明确。因此，没有有效的基于机械的治疗方法。据推测，糖尿病会导致肾脏氧化应激，即活性氧（ROS）水平升高，导致肾小球损伤。因此，氧化应激越来越被认为是糖尿病肾病发展和进展的主要因素。2ROS的各种肾脏来源被认为与糖尿病肾脏有关。这些包括葡萄糖的自氧化、高级糖基化、糖酵解、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、山梨醇/多元醇途径流量、己糖胺途径流量、线粒体呼吸链、黄嘌呤氧化酶、非偶联一氧化氮合酶和NADPH氧化酶。2,三
在这些来源中，NADPH氧化酶被认为在1型和2型糖尿病肾病动物模型肾损伤的发展和进展中起着关键作用4——6因此代表了一个潜在的重要新目标。NADPH氧化酶是已知唯一专门用于产生ROS的酶。其催化亚基存在七种亚型（Nox1–5；Duox1和2）。氮氧化物亚型在不同程度上依赖于额外的亚单位。7——10在这些亚型中，Nox1、Nox2和Nox4在肾皮质中表达。在链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病中，Nox4、Nox2和另一亚单位p22phox的表达均上调。11——13关于Nox2，我们自己对链脲佐菌素诱导的糖尿病Nox2基因敲除（KO）小鼠的研究表明，在糖尿病20周时，感染的易感性增加，死亡率100%。14因此，在本研究中，我们并不认为Nox2阻断是降低糖尿病肾病的优先策略。
Nox4最初称为Renox，在肾组织中高度表达。15——18Nox4在糖尿病肾病中的作用仍存在争议。在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠中，通过全身注射反义寡核苷酸下调Nox4，虽然只持续了2周，但减少了肾脏和肾小球肥大，并减弱了肾皮质和肾小球中纤维连接蛋白的增加表达。19然而，Nox4反义寡核苷酸对Nox4可能不是绝对特异的。此外，其他作者建议要么没有影响20或Nox4在糖尿病肾病或其他肾纤维化模型中的保护作用。21就Nox1而言，这种亚型似乎在糖尿病大血管疾病中发挥着重要作用14但对Nox1在糖尿病肾病中的作用知之甚少。因此，哪种Nox亚型在糖尿病肾病中起着最关键的作用尚待确定。
在这里，我们首次通过直接比较链脲佐菌素诱导的糖尿病患者的肾损伤，直接比较了Nox1和Nox4缺失在糖尿病肾病发展和进展中的长期影响1号−/年阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−双KO小鼠及其相应的野生型（WT）对照小鼠。此外，基因缺失研究还得到了使用目前最特异的Nox抑制剂GKT137831进行的药物干预研究的补充。22主要调查结果体内研究得到证实在体外使用人类足细胞。
结果
代谢参数
首先，我们研究了Nox1和Nox4缺失以及GKT137831治疗对糖尿病小鼠代谢控制的影响。糖尿病的诱导与糖尿病患者体重减轻、血糖升高和糖化血红蛋白水平升高有关第4个+/+阿波（ApoE）−/−,1号+/年阿波（ApoE）−/−、和阿波（ApoE）−/−将小鼠与其各自的非糖尿病对照组进行比较。与非糖尿病对照组相比，糖尿病动物的血清胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平也显著升高。Nox4或Nox1的基因缺失对糖尿病引起的体重、血糖控制或血脂参数的变化均无任何影响(). 此外，在使用GKT137831抑制Nox的药物时，代谢参数没有变化阿波（ApoE）−/−小鼠20周(). 此外，所有组的收缩压相似。糖尿病小鼠的肾脏重量/体重比显著增加。这在糖尿病患者中趋于减弱第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠与糖尿病的比较第4个+/+阿波（ApoE）−/−老鼠(P（P）=0.08），在GKT137831治疗的糖尿病患者中显著降低阿波（ApoE）−/−小鼠与未经治疗的糖尿病患者的比较阿波（ApoE）−/−老鼠(P（P）<0.05). 然而，糖尿病患者的肾脏重量/体重比没有变化1号−/年阿波（ApoE）−/−小鼠与糖尿病的比较1号+/年阿波（ApoE）−/−老鼠(和)。
表1。
对照组和糖尿病患者20周研究后的一般和代谢参数第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠、对照组和糖尿病患者编号x1+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−老鼠(n个=每组8-15人）
| 参数 | Nox4删除 | Nox1删除 |
|---|
| 第4个+/+阿波（ApoE）−/− | 第4个−/−阿波（ApoE）−/− | 1号+/年阿波（ApoE）−/− | 1号−/年阿波（ApoE）−/− |
|---|
| 控制 | 糖尿病 | 控制 | 糖尿病 | 控制 | 糖尿病 | 控制 | 糖尿病 |
|---|
| 体重（g） | 33±0.6 | 22±0.9一 | 31±0.6 | 25±0.8一 | 32±1 | 23±1一 | 34±1 | 25±1一 |
| 肾重/体重（%） | 0.61±0.01 | 0.94±0.05一 | 0.61±0.02 | 0.82±0.01一 | 0.62±0.02 | 0.87±0.05一 | 0.58±0.01 | 0.90±0.02一 |
| 收缩压（mmHg） | 91±2.7 | 110±7.0 | 93±5.4 | 99±4.7 | 104±4 | 106±4 | 100±3 | 101±2 |
| 血浆葡萄糖（mmol/L） | 10.4±0.6 | 25.0±2.2一 | 11.2±0.6 | 24.3±1.3一 | 13.1±0.9 | 26.2±2.3一 | 12.7±0.4 | 29.6±1.4一 |
| 糖化血红蛋白（%） | 4.9±0.3 | 15.4±0.9一 | 7.8±0.9b条 | 18.9±1.2一 | 4.8±0.4 | 18 0.9±1.5一 | 4.6±0.3 | 18.7±1.8一 |
| 总胆固醇（mmol/L） | 5.8±1.2 | 13.7±1.8一 | 8.2±0.4 | 16.3±1.8一 | 7.6±0.6 | 10.3±1.0一 | 7.3±0.6 | 14.4±1.7一,c（c） |
| 甘油三酯（mmol/L） | 1.2±0.2 | 3.4±0.5一 | 0.8±0.1 | 5.0±0.9一 | 1.0±0.1 | 2.3±0.5一 | 1.2±0.2 | 3.7±0.6一 |
| 高密度脂蛋白（毫摩尔/升） | 1.2±0.3 | 2.5±0.5一 | 1.9±0.1 | 2.3±0.4 | 1.7±0.2 | 1.5±0.2 | 1.7±0.2 | 2.8±0.3一,c（c） |
| 低密度脂蛋白（毫摩尔/升） | 4.0±0.8 | 9.7±1.2一 | 5.9±0.3 | 11.7±1.2一 | 5.4±0.5 | 6.9±1.0一 | 5.0±0.4 | 10.0±1.2一 |
表2。
对照组和糖尿病患者20周研究后的一般和代谢参数阿波（ApoE）−/−GKT137831治疗前后的小鼠(n个=每组8-15人）
| 参数 | 氮氧化物抑制 |
|---|
| 阿波（ApoE）−/− | 阿波（ApoE）−/−+GKT137831号 |
|---|
| 控制 | 糖尿病 | 控制 | 糖尿病 |
|---|
| 体重（g） | 31±0.5 | 25±0.7一 | 28±0.6 | 24±0.9一 |
| 肾重/体重（%） | 0.60±0.01 | 0.95±0.05一 | 0.58±0.01 | 0.77±0.03一,b条 |
| 收缩压（mmHg） | 105±3.0 | 113±4.7 | 107±3.4 | 98±6.3 |
| 血糖（mmol/L） | 11.8±0.4 | 24.8±1.0一 | 13.6±0.5 | 28.9±1.5一 |
| 糖化血红蛋白（%） | 5.0±0.3 | 17.4±0.9一 | 5±0.07 | 15.7±1.6一 |
| 总胆固醇（mmol/L） | 6.7±0.5 | 13.3±1.9一 | 7.6±0.8 | 11.4±1.2一 |
| 甘油三酯（mmol/L） | 1.2±0.1 | 3.2±0.7一 | 1.2±0.3 | 2.3±0.5一 |
| 高密度脂蛋白（毫摩尔/升） | 1.6±0.2 | 2.0±0.3 | 1.7±0.3 | 1.9±0.2 |
| 低密度脂蛋白（毫摩尔/升） | 4.6±0.3 | 9.8±1.4一 | 5.4±0.5 | 8.4±0.9一 |
肾功能参数
白蛋白尿是糖尿病肾病的主要特征。因此，我们研究了Nox1或Nox4缺失对蛋白尿发展的影响，并比较了Nox抑制剂GKT137831治疗糖尿病的效果阿波（ApoE）−/−老鼠。糖尿病10周后编号4−/−阿波（ApoE）−/−小鼠与糖尿病的比较第4个+/+阿波（ApoE）−/−小鼠，但这种效果没有达到统计学意义(). 然而，糖尿病20周后，糖尿病患者的蛋白尿明显减轻第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠与糖尿病的比较第4个+/+阿波（ApoE）−/−老鼠(P（P）<0.05) (). 类似于删除Nox4，GKT137831治疗糖尿病阿波（ApoE）−/−小鼠在糖尿病10周和20周后预防蛋白尿的发生(). 相反，糖尿病患者的蛋白尿未受影响1号−/年阿波（ApoE）−/−老鼠(). 当数据表示为糖尿病10周和20周后的尿白蛋白/肌酐比率时，也观察到类似的效果()。
Nox4（而非Nox1）基因缺陷和药物Nox抑制可减轻糖尿病患者糖尿病引起的蛋白尿增加阿波（ApoE）−/−老鼠。对照组和糖尿病患者的尿白蛋白排泄（A–C）和ACR（D–F）第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A和D），对照组和糖尿病组1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−小鼠（B和E），或对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−给予和不给予GKT137831（C和F）治疗10周和20周的小鼠(n个=每组10–15人）。数据为平均值±SEM*P（P）与相应对照组相比<0.01第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A和D），对照1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−小鼠（B和E），或对照组阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加上GKT137831小鼠（C和F）；#P（P）与糖尿病患者相比<0.05编号4+/+阿波（ApoE）−/−（A和D）或糖尿病阿波（ApoE）−/−小鼠（C和F）。ACR，白蛋白/肌酐比值；控制；糖尿病；GKT，GKT137831。
肾脏结构评估
糖尿病肾病与结构异常相关，包括肾小球硬化，特别是系膜扩张。事实上，糖尿病20周后，肾小球硬化和系膜面积扩张明显增加第4个+/+阿波（ApoE）−/−小鼠与非糖尿病小鼠的比较第4个+/+阿波（ApoE）−/−老鼠。糖尿病患者第4个−/−阿波（ApoE）−/−与糖尿病相比，小鼠肾小球硬化的发展和系膜扩张的程度显著减轻第4个+/+阿波（ApoE）−/−糖尿病20周后的小鼠(). 糖尿病患者未观察到这些肾保护性结构变化1号−/年阿波（ApoE）−/−小鼠与糖尿病的比较1号+/年阿波（ApoE）−/−老鼠(). 糖尿病的治疗阿波（ApoE）−/−根据肾小球硬化指数评估，服用氮氧化物抑制剂GKT137831 20周的小鼠也与肾小球损伤减轻有关()和系膜区(). 这些结果表明，糖尿病患者中的Nox4基因缺失和GKT137831对Nox的抑制作用阿波（ApoE）−/−小鼠在结构参数方面具有肾脏保护作用。删除Nox1后未观察到这种影响。此外，糖尿病患者肾小管间质面积增加阿波（ApoE）−/−老鼠(补充图1). 事实上，氮氧化物抑制剂GKT137831显著减弱了小管间质区(补充图1、C和D). 糖尿病患者也有类似的趋势第4个−/−阿波（ApoE）−/−老鼠(P（P）=0.07) (补充图1、A和B)。
Nox4（而非Nox1）基因缺陷和药物Nox抑制可减轻糖尿病患者肾小球损伤阿波（ApoE）−/−老鼠。对照组和糖尿病组的肾小球硬化指数（A）和系膜面积扩张（B）第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠(n个=每组7–8人）。对照组和糖尿病组的肾小球硬化指数（C）和系膜面积扩张（D）1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠(n个=每组7–8人）。对照组和糖尿病ApoE患者的肾小球硬化指数（E）和系膜面积扩张（F）−/−给予和不给予GKT137831治疗20周的小鼠(n个=每组7–8人）。数据为平均值±SEM*P（P）<0.01与各自的对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A和B），对照1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号-/年阿波（ApoE）−/−小鼠（C和D），或对照组阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加上GKT137831小鼠（E和F）；#P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−（A和B）或糖尿病阿波（ApoE）−/−小鼠（E和F）。控制；糖尿病；GKT，GKT137831。
Nox4表达式
糖尿病的诱导与肾皮质中Nox4、Nox1和Nox2基因表达增加有关(补充图2A). 此外，糖尿病小鼠肾皮质管状部分的Nox4基因表达也增加(补充图2C). 此外，通过免疫荧光检测，肾小球和肾小管Nox4蛋白表达增加(补充图2、B和D). 相反，在不存在或存在糖尿病的情况下，在Nox4-KO小鼠中没有显著的Nox4表达。
细胞外基质蛋白质类
接下来，我们检查了肾小球IV型胶原和纤维连接蛋白的积聚，这与糖尿病肾病中的肾小球硬化和系膜扩张有关。与肾小球硬化和系膜扩张的结果一致，糖尿病20周后，肾小球中IV型胶原蛋白的积累显著增加第4个+/+阿波（ApoE）−/−小鼠与非糖尿病小鼠的比较第4个+/+阿波（ApoE）−/−控制。重要的是，IV型胶原表达的增加在第4个−/−阿波（ApoE）−/−老鼠(). 相反，在1号−/年阿波（ApoE）−/−小鼠与糖尿病的比较1号+/年阿波（ApoE）−/−老鼠(). 此外，GKT137831对糖尿病患者的Nox抑制作用阿波（ApoE）−/−20周的小鼠与糖尿病诱导的IV型胶原表达增加的显著减弱有关(). 同样，糖尿病20周后，小鼠肾小球中纤维连接蛋白的积累增加，而Nox4缺失的小鼠可以阻止这种情况的发生()但不删除Nox1(). 再次，GKT137831治疗糖尿病阿波（ApoE）−/−20周后，小鼠糖尿病减轻，纤维连接蛋白表达增加()。
Nox4基因缺陷，而Nox1基因缺陷，以及药物Nox抑制减弱糖尿病肾小球中增加的IV型胶原积聚阿波（ApoE）−/−老鼠。正常人和糖尿病患者肾小球IV型胶原的免疫染色第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（A），对照组和糖尿病组1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（B），或对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−给予和不给予GKT137831治疗20周的小鼠（C）(n个=每组6-8人）。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与各自对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A），对照编号x1+/年阿波（ApoE）−/−和编号x1−/年阿波（ApoE）−/−小鼠（B）或对照阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加上GKT137831小鼠（C）；#P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−（A） 或糖尿病患者阿波（ApoE）−/−小鼠（C）。控制；糖尿病；GKT，GKT137831。
糖尿病肾小球中Nox4（而非Nox1）基因缺陷和药物Nox抑制减弱了纤维连接蛋白积累的增加阿波（ApoE）−/−老鼠。正常人和糖尿病患者肾小球纤维连接蛋白的免疫染色第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（A），对照组和糖尿病组1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（B），或对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−给予和不给予GKT137831治疗20周的小鼠（C）(n个=每组6-8人）。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与各自对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A），对照编号x1+/年阿波（ApoE）−/−和1号-/年阿波（ApoE）−/−小鼠（B）或对照阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加上GKT137831小鼠（C）；#P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−（A） 或糖尿病患者阿波（ApoE）−/−小鼠（C）。控制；糖尿病；GKT，GKT137831。
我们之前的研究表明，实验性糖尿病患者肾血管内皮生长因子（VEGF）表达增加，并与蛋白尿相关。23事实上，我们观察到VEGF在糖尿病患者肾小球中的表达较高第4个+/+阿波（ApoE）−/−与非糖尿病对照组相比，在糖尿病患者中这种作用减弱第4个−/−阿波（ApoE）−/−老鼠(). 此外，GKT137831治疗糖尿病阿波（ApoE）−/−20周的小鼠也与糖尿病肾小球中VEGF的表达降低有关阿波（ApoE）−/−老鼠()。
Nox4基因缺陷和药物Nox抑制减弱糖尿病肾小球VEGF表达增加阿波（ApoE）−/−老鼠。正常人和糖尿病患者肾小球VEGF的免疫染色第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（A）、对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−给予和不给予GKT137831治疗20周的小鼠（B）(n个=每组6-8人）。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与各自对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A）或对照阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加上GKT137831小鼠（B）；#P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−（A） ；‡P（P）=0.08与糖尿病阿波（ApoE）−/−小鼠（B）。控制；糖尿病；GKT，GKT137831。
总之，这些结果表明，Nox4基因缺失，而Nox1基因缺失，可以保护小鼠免受与糖尿病肾病相关的肾功能和结构变化的影响通过对肾小球硬化、系膜扩张、IV型胶原和纤维连接蛋白积聚的影响。糖尿病的治疗阿波（ApoE）−/−用特异性氮氧化物抑制剂GKT137831治疗20周的小鼠，其肾脏保护效果与氮氧化物缺乏小鼠相似阿波（ApoE）−/−这为Nox抑制作为糖尿病肾病的新治疗策略提供了概念证明。
肾脏超氧化物和活性氧水平
越来越多的证据表明，糖尿病的肾损伤与ROS的形成增加有关。2,4——6事实上，硝化和氧化应激的标志物硝基酪氨酸在糖尿病20周后肾小球中增加第4个+/+阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−老鼠。重要的是，糖尿病第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠和GKT137831治疗的糖尿病阿波（ApoE）−/−与糖尿病相比，小鼠肾小球中硝基酪氨酸的积累减少第4个+/+阿波（ApoE）−/−和未经治疗的糖尿病阿波（ApoE）−/−分别是小鼠(). 与我们的上述观察结果一致，在糖尿病患者中未观察到硝基酪氨酸的减少1号−/年阿波（ApoE）−/−小鼠与糖尿病的比较1号+/年阿波（ApoE）−/−老鼠()。
Nox4（而非Nox1）基因缺陷和药物Nox抑制减弱糖尿病肾小球中硝基酪氨酸的积累阿波（ApoE）−/−老鼠。正常人和糖尿病患者肾小球中硝基酪氨酸的免疫染色第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（A），对照组和糖尿病组1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（B），或对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−给予和不给予GKT137831治疗20周的小鼠（C）(n个=每组6-8人）。结果表示为相对于对照编号4+/+阿波（ApoE）−/−小鼠（A），对照1号+/年阿波（ApoE）−/−小鼠（B）或对照组（未经治疗）阿波（ApoE）−/−小鼠（C），其被任意指定值为1。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与各自对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A），对照编号x1+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−小鼠（B）或对照阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加上GKT137831小鼠（C）；#P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−（A） 或糖尿病患者阿波（ApoE）−/−小鼠（C）。控制；糖尿病；GKT，GKT137831。
我们还使用二氢乙硫铵/高效液相色谱法测量了肾皮质中的超氧物生成()14,24以及使用L-012衍生化学发光法测定肾皮质细胞溶质和线粒体部分的活性氧水平(). 糖尿病与肾皮质中肾脏超氧化物水平增加有关(). 此外，糖尿病与细胞溶质和线粒体的活性氧水平增加有关(). 糖尿病患者阿波（ApoE）−/−患有Nox4基因缺陷症的小鼠没有表现出糖尿病诱导的超氧物增加()或在任一细胞间室中形成ROS(). 在糖尿病患者中也获得了类似的结果阿波（ApoE）−/−GKT137831治疗小鼠20周(). 同样，在Nox1缺乏的糖尿病小鼠中，也没有观察到这种降低超氧物和活性氧水平的作用(1号−/年阿波（ApoE）−/−小鼠）(). 这些结果表明，通过Nox4缺失和药物Nox抑制观察到的肾脏保护与肾ROS形成减少有关。研究结果进一步支持了Nox4（而非Nox1）是糖尿病肾病ROS的病理相关来源的观点。
糖尿病患者中Nox4基因缺陷而非Nox1基因缺陷，以及药物Nox抑制减弱了肾脏超氧化物和活性氧的形成阿波（ApoE）−/−老鼠。对照组和糖尿病组肾皮质（A、C和E）中的超氧化物生成和肾皮质（B、D和F）细胞溶质和线粒体部分中的活性氧生成第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A和B）、对照组和糖尿病患者编号x1+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（C和D），或对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−给予和不给予GKT137831治疗20周的小鼠（E和F）(n个=每组5-6人）。超氧化物数据（A、C和E）显示为2HE（纳米）与DHE（微米）的比值。关于ROS测量，结果是相对于对照组表达的第4个+/+阿波（ApoE）−/−小鼠（B），对照1号+/年阿波（ApoE）−/−小鼠（D）或对照组（未经治疗）阿波（ApoE）−/−小鼠（F），任意指定值100。数据为平均值±SEM*P（P）≤0.05与各自对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−或控制1号+/年阿波（ApoE）−/−小鼠或对照阿波（ApoE）−/−老鼠；#P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−或糖尿病患者阿波（ApoE）−/−老鼠。2HE，2氢乙炔；控制；糖尿病；二氢乙硫醚；GKT，GKT137831；RLU，相对光单位。
巨噬细胞浸润
糖尿病与肾小球中巨噬细胞的募集和滞留有关。25因此，糖尿病小鼠20周后肾小球中巨噬细胞标记物F4/80的表达在糖尿病小鼠中增加第4个+/+阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−小鼠与非糖尿病对照组进行比较。这一参数在糖尿病患者中再次减弱第4个−/−阿波（ApoE）−/−老鼠()糖尿病患者阿波（ApoE）−/−GKT137831治疗小鼠(). 相反，F4/80在糖尿病肾小球中的表达编号x1−/年阿波（ApoE）−/−小鼠与糖尿病小鼠没有区别1号+/年阿波（ApoE）−/−老鼠()。
Nox4基因缺陷而非Nox1基因缺陷以及药物Nox抑制可减轻糖尿病肾小球巨噬细胞浸润阿波（ApoE）−/−老鼠。正常人和糖尿病患者肾小球F4/80的免疫染色第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A）或对照组和糖尿病小鼠1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（B），或对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−给予和不给予GKT137831治疗20周的小鼠（C）(n个=每组6-8人）。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与各自对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A），对照1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号-/年阿波（ApoE）−/−小鼠（B）或对照阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加上GKT137831小鼠（C）；#P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−（A） 或糖尿病患者阿波（ApoE）−/−小鼠（C）。控制；糖尿病；GKT，GKT137831。
人足细胞体外试验研究
足细胞被认为主要参与调节肾小球滤过屏障和蛋白尿的形成。26因此，我们研究了高血糖和TGF的影响-β1是糖尿病环境的关键特征，关于ROS的形成和人类分化足细胞系中糖尿病相关损伤的标志物，如前所述(补充图3)。27在非许可条件下，足细胞会发生生长停滞，表现出典型的足突扩展树状模式，并表达成熟足细胞分化的标志物，包括nephrin、synaptopodin和Wilms肿瘤-1(补充图4)。
将人足细胞在含高糖的培养基（25mM，即。，与链脲佐菌素治疗小鼠血清中观察到的葡萄糖浓度相似）导致Nox4的mRNA水平增加(). TGF的添加-β在这种高血糖环境下，Nox4基因的表达进一步增加，在较小程度上也增加了Nox5，但Nox1、Nox2或其胞质调节因子p47phox没有增加。等渗对照甘露醇没有导致任何Nox亚型水平的变化(). 此外，通过免疫荧光检测，这些足细胞中表达了Nox4蛋白(补充图5)。
沉默Nox4可以降低高糖以及高糖和TGF-β1介导的ROS形成和人类足细胞中纤维化前标志物的基因表达。（A） 在糖尿病刺激下，人足细胞中Nox4和Nox5，但Nox1、Nox2或p47phox mRNA水平没有上调。在NG（5 mM）或HG（25 mM）培养的分化人足细胞中以及在TGF存在或不存在的情况下，分析Nox亚型mRNA水平和细胞溶质调节因子p47phox-β1（5纳克/毫升，2天）。甘露醇（20 mM/L+5 mMD类-葡萄糖）用作渗透控制。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与NG相比；#P（P）与HG相比<0.05。（B和C）IV型胶原、纤维连接蛋白、VEGF和α-用Nox4特异性shRNA转染分化的人足细胞中的SMA，然后在NG（5 mM）或HG（25 mM）中生长2天（B和C）。ROS生成的结果表示为相对于非目标加NG，后者被任意赋值为100（B）。数据为平均值±SEM(n个=6/组）。∧P（P）<0.05与非目标加NG相比；§P（P）<0.05与非目标加HG相比。（D和E）IV型胶原、纤维连接蛋白、VEGF和α-用Nox4特异性shRNA转染分化的人足细胞中的SMA，然后在有或无TGF的情况下生长-β1（5 ng/ml），ROS生成（D）4小时，RT-PCR（E）2天。数据为平均值±SEM(n个=6/组）。†P（P）<0.05与非目标，‡P（P）<0.05与非靶向加TGF-β1.HG、高糖；NG，正常葡萄糖；RLU，相对光单位。
接下来，我们用慢病毒Nox4短发夹RNA（shRNA）表达结构感染人类足细胞。这导致Nox4基因表达减少约70%(补充图6). 足细胞的Nox4 shRNA处理没有改变Nox1、Nox2或Nox5的mRNA水平(补充图6). 重要的是，高血糖和转化生长因子-β1–在Nox4敲低细胞中诱导的ROS产生增加减少到正常葡萄糖中足细胞或未经TGF处理的细胞中的ROS水平-β1 ()。
高糖单独增加细胞外基质（ECM）蛋白、IV型胶原、纤维连接蛋白和VEGF的基因表达，而对α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA）未达到统计显著性(). TGF的添加-βIV型胶原、纤维连接蛋白、VEGF和α-座椅模块组件(). 通过用Nox4 shRNA感染足细胞沉默Nox4导致葡萄糖和TGF降低-β–诱导IV型胶原、纤维连接蛋白、VEGF和α-SMA与感染非靶向控制结构的细胞的比较()。
TGF公司-β用Nox抑制剂GKT137831预处理人足细胞，可以减弱高糖诱导的Nox4上调以及ROS形成的相关增加(). 此外，IV型胶原、纤维连接蛋白、结缔组织生长因子、VEGF和α-高糖和TGF导致的SMA-β用GKT137831预处理细胞后，细胞明显减弱()。
抑制Nox改善TGF-β1诱导人足细胞中ROS的生成和纤维化前标志物的基因表达。（A） 抑制Nox改善TGF-β1–诱导人足细胞产生ROS。经GKT137831（10µM） 在有无TGF的情况下持续2小时-β1（5 ng/ml）持续4小时。DMSO用作车辆控制。结果是相对于控件表示的，控件被任意赋值为100。（B） 抑制Nox可降低高糖和TGF-β1-诱导IV型胶原、纤连蛋白、CTGF、VEGF和α-人足细胞中的SMA。在使用和不使用GKT137831（10µM） 在TGF存在或不存在的情况下持续2小时-β1（5 ng/ml），持续2天。DMSO用作车辆控制。数据为平均值±SEM(n个=每组6人）*P（P）与对照组相比<0.05；#P（P）与转化生长因子相比<0.05-β1.COL4，IV型胶原；结缔组织生长因子；GKT，GKT137831；RLU，相对光单位。
炎症参数：单核细胞趋化蛋白-1和NF-κB类
我们进一步研究了Nox4缺失对NF的影响-κB/单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）轴，一种与糖尿病肾病发展相关的途径。25与巨噬细胞渗入肾脏的结果一致()，我们观察到糖尿病小鼠肾皮质中MCP-1基因的上调，而糖尿病Nox4缺乏小鼠肾皮质的上调明显减弱(). 糖尿病诱导的NF上调也有减少的趋势-κNox4 KO小鼠肾皮质中的B亚单位p65(). 为了补充这些体内调查结果，在体外对人足细胞进行了研究。事实上，Nox4的沉默消除了高糖诱导的MCP-1和p65 mRNA水平的上调()。
Nox4基因靶向减轻糖尿病诱导的促炎症标记物MCP-1和NF表达增加-κB第65页在体外和体内（A和B）（A）MCP-1和（B）NF的RT-PCR分析-κ用Nox4特异性shRNA转染人足细胞中的B p65，然后在NG（5 mM）或HG（25 mM）中生长2天。数据为平均值±SEM(n个=6/组）*P（P）<0.05与非目标加NG相比；#P（P）<0.01与非目标加HG相比。（C）MCP-1和（D）NF的（C和D）RT-PCR分析-κ对照组和糖尿病组肾皮质中的B p65第4个+/+阿波（ApoE）−/−和编号4−/−阿波（ApoE）−/−20周后。数据为平均值±SEM(n个=6/组）^P（P）<0.05与对照组第4个+/+阿波（ApoE）−/−；§P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−老鼠。（E和F）ELISA法测定（E）对照组和糖尿病患者肾皮质蛋白提取物中MCP-1编号4+/+阿波（ApoE）−/−和编号4−/−阿波（ApoE）−/−小鼠或（F）对照组和糖尿病患者1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−20周后(n个=5-6/组）或（G）对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−使用或不使用GKT137831号持续20周(n个=5–6/组）。数据为平均值±SEM。†P（P）<0.05与各自对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（E）或对照1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−小鼠（F）或对照阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加GKT137831小鼠（G）；‡P（P）<0.05与糖尿病阿波（ApoE）−/−小鼠（G）。控制；糖尿病；GKT，GKT137831；HG，高糖；NG，正常葡萄糖。
此外，糖尿病患者20周后肾皮质蛋白提取物中MCP-1的表达增加第4个+/+阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−小鼠与其非糖尿病对照组的比较。这一参数在糖尿病患者中再次减弱第4个−/−阿波（ApoE）−/−老鼠()糖尿病患者阿波（ApoE）−/−GKT137831治疗小鼠(). 相反，糖尿病患者肾皮质中的MCP-1蛋白1号−/年阿波（ApoE）−/小鼠与糖尿病小鼠没有区别编号x1+/年阿波（ApoE）−/−老鼠()。
讨论
这项研究提供了证据，证明Nox4衍生的而不是Nox1衍生的ROS与糖尿病肾病的发展和进展有因果关系。这一证据基于第一次直接比较Nox4或Nox1缺失阿波（ApoE）−/−老鼠。我们使用阿波（ApoE）−/−小鼠因为链脲佐菌素诱导糖尿病阿波（ApoE）−/−小鼠是一种典型的晚期肾损伤模型，具有显著的ECM蓄积。28,29重要的是，我们将这些发现转化为一种潜在的临床治疗，通过显示糖尿病患者的Nox抑制阿波（ApoE）−/−使用药理学策略的小鼠的肾脏保护程度与Nox4缺失的小鼠相似。
先前的研究已经表明，氮氧化物衍生的活性氧在糖尿病肾病的发展和进展中起作用，但这些实验是短期的，并且/或者只研究了一种氮氧化物亚型。4——6,19在药物干预方面，以前的研究依赖于非特异性ROS形成抑制剂，如apocynin，一种也被报道干扰Rho激酶的药物。30,31因此，我们假设这项长期研究可能与临床靶点验证更相关。
在这项研究中，我们能够使用目前可用的最特殊的化合物GKT137831，将遗传性删除Nox4的肾脏保护作用与对Nox的药物抑制结合起来。糖尿病患者阿波（ApoE）−/−小鼠，Nox4缺失或用GKT137831治疗可减轻肾小球损伤的各种参数，包括蛋白尿和肾小球结构改变，包括ECM积聚。此外，使用新型氮氧化物抑制剂GKT137831可显著减轻糖尿病引起的肾小管间质面积增加。此外，糖尿病Nox4 KO小鼠巨噬细胞浸润减少，这些变化与趋化因子MCP-1和关键促炎转录因子NF的表达减弱有关-κB.此外，这些肾脏保护作用与肾皮质超氧化物生成减少、细胞溶质和线粒体ROS水平降低以及肾小球内硝基酪氨酸积累减少有关。相反，Nox1基因缺失阿波（ApoE）−/−小鼠并没有减弱糖尿病小鼠肾脏ROS的生成，也未能预防肾小球损伤。
与使用1型和2型糖尿病模型的其他研究一致，11,12,32我们观察到糖尿病小鼠肾皮质中Nox4 mRNA增加。在解释有关Nox4蛋白表达的结果时必须谨慎，因为目前还没有完全验证的单特异性Nox4抗体可用。在这些局限性的背景下，我们发现糖尿病患者对Nox4的免疫反应增强阿波（ApoE）−/−小鼠，尤其是肾小球，这是Nox4 KO小鼠中未观察到的现象。这些发现与其他小组在短期研究中报告的结果类似。19
戈林之前的研究等提示通过全身注射反义寡核苷酸短期下调Nox4可减轻肾脏和肾小球肥大，并减少糖尿病肾脏中常见的纤维连接蛋白表达增加。19该小组最近进一步探索了Nox4和ECM生成之间的联系，并表明Nox4可以被基质金属蛋白酶ADAM（一种去整合素和金属蛋白酶）-17调节。33
巴贝洛娃等人。20研究了Nox4在各种肾损伤模型中的作用，包括链脲佐菌素诱导的糖尿病模型，尽管是在C57BL/6中，而不是在阿波（ApoE）−/−老鼠。因此，与我们的发现相反，这些作者没有观察到Nox4的上调20而Nox4缺乏并不能减轻肾病。然而，C57BL/6小鼠对糖尿病肾病典型形态学特征的发展具有相对抵抗力。34实验模型持续时间和所用小鼠品系的这些差异可能解释了该研究与我们和其他研究的冲突结果。11,19,32
鉴于足细胞不仅在蛋白尿中的重要性，而且在糖尿病肾病的形态学表现中也很重要，为了将我们的研究结果从小鼠转化为人类环境，我们进行了在体外使用人类足细胞的研究。符合体内使用小鼠进行的观察表明，Nox4和较小程度的Nox5在高糖下被上调，并且这种上调在TGF的存在下进一步放大-β1暴露，这两个是糖尿病环境的关键特征。35,36GKT137831对Nox4的沉默和对Nox的抑制都降低了人足细胞中的ROS水平，这与与肾纤维化相关的关键途径的减弱有关，包括IV型胶原、纤连蛋白、结缔组织生长因子和α-SMA。这些发现证实了先前的一份报告，其中显示Nox4在小鼠足细胞高血糖诱导的ROS形成中起重要作用37; 然而，我们的研究重要地证实了这些发现并将其扩展到人类细胞，并强调了Nox4对前巩膜通路的影响。
Nox4衍生活性氧形成对VEGF表达的影响，VEGF是一种由包括足细胞在内的肾细胞表达的生长因子，38我们的体内糖尿病肾病的研究。Nox4缺失和GKT137831对Nox的抑制都与糖尿病诱导肾小球VEGF表达增加的减弱有关，这也与蛋白尿减少有关在体外研究表明，GKT137831治疗可降低高血糖环境下足细胞VEGF的表达。重要的是，这可能是Nox4依赖性的，因为人类足细胞中Nox4的下调也与VEGF表达的减弱有关。与我们的发现一致，其他研究人员报告了视网膜中VEGF与Nox4之间的联系，其中Nox4与血管通透性相关，39以及中风模型中的类似发现。40
糖尿病肾病被认为至少部分是一种炎症性疾病，其中进行性肾小球损伤与巨噬细胞浸润有关。25与此观点一致，我们的研究中糖尿病的诱导与肾小球内巨噬细胞积聚的显著增加有关。这些变化在糖尿病Nox4缺乏小鼠和糖尿病小鼠中减弱阿波（ApoE）−/−用氮氧化物抑制剂GKT137831治疗但不治疗糖尿病的小鼠1号−/年老鼠。虽然在非肾背景下，但先前提出了Nox4与炎症之间的联系。具体而言，使用小干扰RNA方法下调Nox4可减弱LPS诱导的人类内皮细胞的促炎反应。41与Nox4缺失对肾巨噬细胞浸润的影响一致，我们观察到关键促炎转录因子NF的表达降低-κB以及表征良好的NF-κB依赖性趋化因子MCP-1对肾皮质基因和蛋白水平的影响。互补的在体外对人类足细胞的研究证实，高糖诱导NF的上调-κ通过沉默Nox4可以阻止B亚单位、p65和MCP-1的表达。
阻止等人。表明线粒体中存在Nox4，线粒体Nox4沉默与线粒体氧化应激和损伤降低有关。15因此，我们不仅在细胞溶质部分，而且在肾皮质线粒体部分检测了活性氧的形成。事实上，我们证明糖尿病Nox4缺乏小鼠肾皮质线粒体和细胞溶质ROS生成减少。GKT137831治疗糖尿病阿波（ApoE）−/−小鼠引起线粒体ROS生成的类似减少。这些发现加强了这样一种观点，即至少在糖尿病肾脏中，Nox4不仅是ROS的细胞溶质，还是ROS的线粒体来源。其他研究小组表明，在高血糖状态下，电子传递链的改变是线粒体活性氧的主要来源。42,43然而，我们的发现通过证明Nox4可能是减少线粒体氧化应激的替代或额外靶点，特别是在肾脏中，扩展了这些结果。
Nox1在糖尿病肾病中的作用之前尚未明确描述。Nox1在肾皮质，包括正常肾脏的肾小球中表达，尽管几乎无法检测到。据报道，在高血压相关的肾脏疾病中，如在血管紧张素II输注模型和Dahl盐敏感性高血压大鼠中，Nox1的肾脏表达增加。44,45这些发现具有相关性，因为糖尿病肾脏中肾素-血管紧张素系统的激活已被证明会促进肾损伤。46,47血管紧张素II诱导Nox1上调。48因此，有人推测Nox1可能在糖尿病肾病的发展和进展中发挥重要作用。44,45然而，在我们的研究中，Nox1缺失与糖尿病相关肾损伤的改善无关。因此，我们的研究结果反驳了Nox1在糖尿病肾病中的关键作用，但正如最近提出的，Nox1可能在糖尿病相关大血管疾病中更为重要。49
我们将研究重点放在Nox1和Nox4上，并没有专门针对Nox2，而此前研究表明Nox2在糖尿病肾病中不起关键作用。50此外，据报道，Nox2缺失与糖尿病感染易感性增加有关。14然而，不能排除部分Nox2抑制的潜在作用，但在高血糖状态下严重Nox2缺乏的致命性可能会缩小这种方法的治疗窗口。也有越来越多的数据表明，另一种Nox亚型Nox5在病理性ROS生成中发挥作用。7,51然而，由于Nox5在大鼠和小鼠中不存在，我们无法描述这种特殊的Nox亚型在我们的研究中的作用体内模型。然而，在人类足细胞中，经糖尿病相关刺激（如高糖和TGF）治疗后，Nox5上调-β1.因此，我们不能排除Nox5在人类糖尿病肾病中的额外作用。
为了测试临床转化我们实验研究的可能性，我们给糖尿病患者服用了GKT137831阿波（ApoE）−/−老鼠。这种Nox抑制剂被认为对Nox1和Nox4具有双重功效。研究表明，它具有终末器官保护作用，尽管是在肝脏中。22,52重要的是，在我们的研究中，糖尿病的治疗阿波（ApoE）−/−GKT137831小鼠模拟了Nox4缺失对肾小球损伤、蛋白尿、ROS生成、ECM积累和巨噬细胞浸润的影响。因此，GKT137831的肾脏保护作用可能由Nox4而非Nox1抑制介导。根据我们的研究结果，另一种氮氧化物抑制剂GKT136901最近被报道对2型糖尿病模型db/db小鼠具有肾保护作用。这种肾脏保护作用与蛋白尿减少、硫代巴比妥酸（反应性物质）在尿液中的排泄减少以及肾细胞外信号调节蛋白激酶1/2磷酸化的减弱有关。8在该研究中观察到的最初抗白蛋白尿作用在糖尿病16周后没有持续。我们研究中观察到的持续时间更长的抗白蛋白尿作用可能与两种化合物的效力差异有关，或者更可能与Nox抑制剂的给药方式有关。在之前的研究中，药物被混合在食物中，8而在本研究中，该药物是通过灌胃给药的。
总之，有令人信服的证据表明，在导致相对晚期糖尿病肾病的胰岛素缺乏型糖尿病长期模型中，Nox4（而非Nox1）是ROS的主要病理肾源。我们的实验已经确定Nox4是一个有吸引力的基于机制的治疗糖尿病肾病的靶点。此外，我们提供了原理证明，这种机制可以转化为一种新的药物治疗，具有重要的未来临床意义。因此，我们的研究加强了开发Nox4特异性抑制剂的必要性，该抑制剂可用于预防和治疗这种主要的糖尿病并发症。
简明方法
动物
研究糖尿病患者糖尿病引起的肾功能变化和肾脏形态学损伤第4个+/+阿波（ApoE）−/−,编号4−/−阿波（ApoE）−/−双KO，1号+/年阿波（ApoE）−/−,1号−/年阿波（ApoE）−/−双KO，以及阿波（ApoE）−/−雄性小鼠，并与相应的非糖尿病对照小鼠进行比较。1号+/年阿波（ApoE）−/小鼠的产生如前所述。53,54为了产生双KO小鼠，Nox4 KO小鼠41与阿波（ApoE）−/−小鼠品系（澳大利亚西澳大利亚州默多克动物资源中心）。最初我们交配了阿波（ApoE）−/−（F） 带有第4个−/−（M） 小鼠在F1代产生杂合子(第4个+/负极阿波（ApoE）+/负极)。从F2代开始，我们建立了第4个+/负极阿波（ApoE）−/−×第4个−/−阿波（ApoE）+/负极和第4个−/−阿波（ApoE）+/负极×第4个−/−阿波（ApoE）−/−产生了F3代，包括WT第4个+/+阿波（ApoE）−/−和双KO第4个−/−阿波（ApoE）−/−老鼠。从那一代开始，我们进行了雌雄交配第4个−/−阿波（ApoE）−/−老鼠和现在是第16代。
通过每天五次腹腔注射链脲佐菌素（Sigma-Aldrich，St Louis，MO），在柠檬酸缓冲液中以55 mg/kg的剂量，在6周龄小鼠中诱导糖尿病，而对照小鼠仅接受柠檬酸缓冲。没有一只患有糖尿病的动物需要补充胰岛素来保持体重或预防酮症。糖尿病和非糖尿病亚组阿波（ApoE）−/−从最后一次注射链脲佐菌素开始，用氮氧化物抑制剂GKT137831每日灌胃给药，剂量为60 mg/kg，持续20周。GKT137831是吡唑并吡啶二酮家族的成员，是Nox4和Nox1亚型的特异性抑制剂(K我在ROS生产的无细胞分析中，在100–150 nM范围内）。当浓度为10时，它没有清除活性氧µM。52,55
20周后，用戊巴比妥钠腹腔内麻醉动物（100 mg/kg体重）（Euthatal；Sigma-Aldrich，Castle Hill，NSW，Australia）。对肾脏进行快速解剖、称重，并进行snap冷冻或加工成石蜡进行后续分析。所有动物研究均由阿尔弗雷德医学研究与教育区动物伦理委员会根据澳大利亚国家卫生与医学研究委员会的指导方针批准。所有动物都被安置在Baker IDI心脏与糖尿病研究所的动物中心。在研究期间，动物可以不受限制地获得水和食物，并在无致病性的环境下，在标准的鼠食（澳大利亚西澳大利亚州珀斯市的特种饲料公司）中保持12小时的光/暗循环。
代谢参数测量
在糖尿病诱导10周和20周后，将小鼠分别置于代谢笼中24小时（法国阿尔布雷斯的Iffa Credo）。收集尿液进行后续分析。使用血糖仪连续测量血糖（Accutrend；德国曼海姆Boehringer-Manheim生化公司）。通过HPLC（CLC330 GHb分析仪；Primus，Kansas City，MO）测量从全血分离的红细胞裂解液中的糖化血红蛋白。56使用计算机化无创尾剪断法评估收缩压。57在20周的研究结束时，由一名经验丰富的技术人员对清醒小鼠进行读数，使小鼠熟悉该设备。在糖尿病诱导后10周和20周，使用小鼠白蛋白ELISA定量试剂盒（Bethyl Laboratories，Montgomery，TX）测量尿白蛋白浓度。如前所述，采用HPLC测定尿肌酐浓度。56,58计算尿白蛋白/肌酐比值。
在体内基因表达分析
如前所述，将肾皮质（Polytron PT-MR2100；Kinematicca，Littau/Lucerne，Switzerland）在TRIzol试剂（Invitrogen Australia，Mt Waverly，VIC，Australia）中均质后提取总RNA。56使用中描述的探针和引物进行基因表达补充表1用于Nox1、Nox2、Nox4、MCP-1和NF-κ使用TaqMan系统（ABI Prism 7500；PerkinElmer，Poster City，CA）对B p65进行定量分析，并将其与看家基因18S（18S核糖体RNA Taq Man控制试剂盒）的表达相对应。14,56结果与非糖尿病ApoE相关−/−小鼠，任意指定值为1。
组织学评估
用周期性酸-希夫染色三微米肾切片，以测量肾小球硬化损伤和系膜扩张。如前所述，使用Image-Pro plus 6.0软件（Media-Controlnetics，马里兰州贝塞斯达）从肾小球的数字图片（每只动物每肾20个肾小球）分析肾小球系膜面积（肾小球面积百分比）。56,58根据肾小球损伤的严重程度对肾小球硬化性损伤进行分级，包括肾小球系膜基质扩张、伴有局灶性粘连的玻璃样变、毛细血管扩张、肾小球簇闭塞和硬化，如前所述。12,29,59以盲法评估每个肾脏20个肾小球。
免疫组织化学
肾石蜡切片（4-µm） 对IV型胶原（1:600，兔多克隆抗胶原IV；Abcam，马萨诸塞州坎布里奇）、纤维连接蛋白（1:800，多克隆兔抗纤维连接到蛋白；Dako Cytomation，Glostrup，丹麦）、硝基酪氨酸（1:100，兔多群抗硝基酪氨酸；Millipore，Billerica，马萨诸塞诸塞州）、F4/80（1:50，大鼠单克隆抗-F4/80；Abcam）进行染色和VEGF（小鼠单克隆抗人VEGF；Millipore，Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）。简单地说，对型材进行脱蜡、水合和3%H淬火2O（运行）2在Tris缓冲盐水（TBS）中抑制内源性过氧化物酶活性。用0.4%胃蛋白酶（Sigma-Aldrich）在37°C的0.01 M HCl中消化IV型胶原蛋白和纤维连接蛋白切片。然后用0.5%的牛奶在TBS中稀释培养，以阻止非特异性结合。随后，将切片与一级抗体在4°C下孵育过夜，然后进行亲和素/生物素封闭。硝基酪氨酸切片在与一级抗体孵育之前，用10%的正常马血清在TBS中孵育，而不是用0.5%的牛奶孵育。同样，F4/80的切片在与一抗F4/80抗体在4°C孵育过夜之前，用蛋白阻断剂（Dako CSA Kit）孵育，根据制造商的说明，染色也用Dako催化信号扩增试剂盒进一步放大。此后，将IV型胶原的生物素化抗兔Ig（1:500）、纤维连接蛋白、硝基酪氨酸和F4/80（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories，Burlingame，CA）的生物素化抗鼠Ig（1:200）用作二级抗体，然后使用辣根过氧化物酶结合链霉亲和素（VECTASTAIN Elite ABC染色试剂盒；Vector Laboratories）。随后使用3,3′-二氨基联苯胺四氯化物（Sigma-Aldrich）在0.08%H中观察过氧化物酶结合物2O（运行）2/待定。对于VEGF免疫染色，遵循小鼠初级抗体Dako ARK过氧化物酶方案。对切片进行脱蜡、水合处理，并用过氧化物酶块培养，然后在室温下用生物素化的一级抗血管内皮生长因子抗体培养1小时，并用链霉亲和素过氧化物酶培养。随后使用3,3′-二氨基联苯胺底物显色剂显示过氧化物酶偶联物。
最后，用迈尔苏木精对切片进行复染，脱水后装裱。所有切片均在光学显微镜下进行检查（奥林巴斯BX-50；日本东京奥林巴斯光学公司），并用高分辨率相机进行数字化。为了量化染色比例区域，使用Image-Pro plus 6（媒体控制论）分析了20个肾小球（×400）。56,58所有评估均以盲法进行。每组研究六个或八个肾脏。
MCP-1酶联免疫吸附试验
从每组肾皮质获得的蛋白质提取物中鉴定了MCP-1的浓度(n个=每组5-6个），使用ELISA试剂盒（1:3；澳大利亚新南威尔士州Kirrawee的研发系统）的说明。ELISA结果与蛋白质浓度相关。
肾皮质超氧化物和活性氧生成的测量
使用经校准的高效液相色谱法（HPLC）测量冷冻肾皮质中的肾脏超氧化物水平，以通过先前建立的方法测量二氢乙硫铵。14,24此外，在冷冻肾皮质中测量ROS水平。简单地说，肾皮质在Krebs缓冲液中均质，细胞溶质和线粒体部分通过前面描述的差速离心制备。24在透明96 well板和预先加热的Krebs-HEPES（补充L-012（Wako Chemicals，Richmond，VA）中，以100的浓度对细胞质和线粒体分离物进行了两次分析µ在黑暗中向每个孔中添加M，并在37°C下培养10分钟。培养后，在光度计（MicroLumat Plus；Berthold Technologies，Pforzheim，德国）中读取平板，并在37°C下用1秒的单次测量时间和111秒的循环时间测量发光20分钟。从每个读数中减去缓冲区空白。根据试剂盒说明，进行了双茚二酸蛋白质分析（Pierce/Termo Scientific，Scoresby，VIC，Australia）（PBS中的样品1:10），并将结果表示为相对于总蛋白质浓度（毫克）。
体外试验实验
条件永生化人足细胞用于在体外研究。60足细胞在含有10%FCS和1×ITS培养基补充剂（Sigma-Aldrich）的RPMI中生长，该补充剂含有来自牛胰腺的1.0 mg/ml胰岛素、0.55 mg/ml人转铁蛋白和0.5 mg/ml人胰岛素μg/ml亚硒酸钠，置于5%CO的增湿培养箱中2温度为33°C。将大约60%的融合细胞转移到2%的FBS培养基中，并在37°C下培养2周。27在这些条件下，足细胞发生生长停滞，表现出典型的足突伸展树状结构(补充图3)，表达成熟足细胞分化标记体内包括Wilms的肿瘤-1和nephrin(补充图4). 然后在RPMI中用5mmol/L葡萄糖或25mmol/L的葡萄糖在有无TGF的情况下培养细胞-β1（5 ng/ml；研发系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州），带或不带GKT137831（10µM） 溶解在0.1%二甲基亚砜中，并在37°C下培养48小时。
shRNA到Nox4
如前所述，使用表达MISSION shRNA的慢病毒载体（Sigma-Aldrich）在人足细胞中敲除Nox4。61靶向Nox4敲除的序列对应于5′-GCTGTATTGATGTGCTT-3′（TRCN0000046089）。用MISSION非靶向shRNA控制载体颗粒（Sigma-Aldrich）转导的细胞作为对照。未分化足细胞接种于1×106100 mm培养皿中每个培养皿的细胞数，在8个培养皿中感染慢病毒颗粒μg/ml聚布伦，然后在嘌呤霉素中进行筛选（1µg/ml；Sigma-Aldrich）持续4天。RT-PCR验证了细胞中的敲除效率，Nox4的敲除率约为70%。然后将非靶向和Nox4-shRNA感染的细胞培养在含有5mmol/L葡萄糖或25mmol/L糖的RPMI中，或在有无TGF的情况下培养-β1（5 ng/ml），并在37°C下培养48小时。在每个实验结束时，收集细胞，用TRIzol法提取RNA，合成cDNA用于定量RT-PCR。
体外试验基因表达分析
使用基于实时荧光检测的TaqMan系统（ABI Prism 7500；PerkinElmer），通过实时RT-PCR分析基因表达。通过ABI Prism 7500序列检测系统（PerkinElmer）定量分析每个循环的荧光。为了控制不同样品中可用于PCR的DNA量的变化，将靶序列的基因表达相对于内源性对照18S核糖体RNA（18S rRNA TaqMan对照试剂盒，ABI Prism 7500；PerkinElmer）的表达进行标准化。进行了三个重复实验，每个重复六次。结果是相对于对照（未处理）细胞表达的，该细胞被任意赋值为1。用于定量RT-PCR的人类探针和引物序列如所示补充表2。
ROS的测量体外试验
对完全分化的正常、非靶向和Nox4-shRNA感染的人足细胞进行胰蛋白酶消化，并于200年再次悬浮µl密度为10的RPMI介质4每孔96个白色微孔板（PerkinElmer）中的细胞数，并在37°C下培养24小时。然后将正常人足细胞与GKT137831（10µM） 2小时，然后用或不用TGF处理-β1（5 ng/ml）在37°C下持续4小时。然而，非靶细胞和Nox4-shRNA感染细胞在正常葡萄糖（5 mM）或高糖（25 mM）中培养2天，或在有无TGF的情况下培养2天-β1（5 ng/ml）在37°C下持续4小时。每口井都用Krebs-HEPES清洗µ补充l-012（100）的Krebs-HEPESµM） 随后添加（Wako Chemicals），并在37°C下培养10分钟。孵化后，在光度计上读取平板（Berthold Technologies）。
统计分析
使用GraphPad Prism 5软件（加利福尼亚州拉霍亚市GraphPad-software公司）通过单向方差分析对所有参数进行多重平均值比较，或由双尾非配对Mann–Whitney进行分析U型需要时进行测试。A类P（P）值<0.05被认为具有统计学意义。除非另有规定，否则结果表示为平均值±SEM。
