肿瘤抑制因子p16INK4A的下调有助于人类巨噬细胞向脂肪组织巨噬细胞（ATM）样表型的极化

摘要

介绍

巨噬细胞浸润脂肪组织（AT）反映了以肥胖和胰岛素抵抗为特征的低度炎症状态[1]. 肥胖诱导的脂肪细胞肥大导致脂肪细胞炎症和细胞死亡，从而引发巨噬细胞聚集。这些AT巨噬细胞（ATM）在AT中积累，包围死亡的脂肪细胞，形成所谓的冠状结构（CLS）[2]. 巨噬细胞表现出不同的激活状态，使其能够发挥特殊的功能：经典激活的（M1）巨噬细胞产生高水平的炎症介质，如TNF、IL-6和环氧化酶2（COX2），而交替激活的（M2）巨噬细胞则产生抗炎细胞因子[三]. 在体外，单核细胞分化为M2巨噬细胞是通过T辅助因子2（Th2）细胞因子（如IL-4或IL-13）刺激诱导的，或是通过IFNγ或脂多糖（LPS）刺激诱导为M1巨噬细胞[4]. M2标记物包括甘露糖受体、C型1（CD206）、结合珠蛋白-血红蛋白清除剂受体（CD163）和趋化因子-趋化因子（C-C基序）配体18（肺和激活-调节）（CCL18[也称为AMAC1]）[4]. 在肥胖患者中，ATM产生的炎性细胞因子显著增加。根据动物研究，有人提出肥胖促进M1巨噬细胞向AT的募集和/或诱导M2常驻巨噬细胞向M1状态转移[5]. 事实上，小鼠ATM构成了一个异质群体，包括M1和M2亚群[6]. 然而，在人类中，ATM具有更复杂的表型，可能取决于它们在AT中的定位[7,8]. 尽管如此，决定这种特殊极化的分子机制仍然难以捉摸。

第16页^{INK4A（墨水）}，由编码CDKN2A型基因座是一种细胞周期抑制剂，通过与CDK4的催化亚单位结合来阻断细胞周期蛋白D/细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）激酶活性，从而阻止视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化和随后E2F1转录因子的释放。因此，进入S期所需的基因转录受到抑制[9]. 历史上，第16页^{INK4A（墨水）}已经研究了与癌症的关系，许多人类肿瘤显示p16改变^{INK4A（墨水）}级别[10]. 由于其在细胞周期退出中的作用，p16^{INK4A（墨水）}在衰老中起作用。例如，乳腺上皮细胞、成纤维细胞和T淋巴细胞积聚p16^{INK4A（墨水）}老化期间[11]. 最近，第16页^{INK4A（墨水）}被证明在诱导的多能干细胞中不存在，但在细胞重编程过程中被重新诱导，突显了p16的作用^{INK4A（墨水）}细胞内命运测定[12]. 然而，关于p16是否^{INK4A（墨水）}发挥与细胞周期控制无关的功能。有趣的是，一个靠近CDKN2A型基因座与2型糖尿病的发展有关[13]. 由于巨噬细胞浸润和炎症是2型糖尿病和肥胖的关键事件，本研究旨在探讨p16与糖尿病和肥胖之间的关系^{INK4A（墨水）}人类ATM中的水平及其特定表型。

方法

结果

人类p16^{INK4A（墨水）}ATM中的表达式低于MDM或AM中的表达式

的表达式第16页^{INK4A（墨水）}在人类ATM中与从相同肥胖供体的单核细胞分化而来的MDM进行比较。确认以往关于人类ATM表型的报告[8]典型M2标记的mRNA表达(AMAC1型[也称为CCL18号机组]和第10类)以及炎症细胞因子TNF公司ATM与MDM相比更高（未显示数据）。ATM明显降低第16页^{INK4A（墨水）}mRNA水平高于MDM和CD68阳性动脉粥样硬化斑块巨噬细胞（AM）(图1a). 这一观察表明第16页^{INK4A（墨水）}这种表达在ATM中特别减少。有趣的是，体外巨噬细胞分化导致p16的诱导^{INK4A（墨水）}蛋白质水平(图1b)而在IL-4存在下分化的巨噬细胞中，这种诱导被抑制，导致M2极化(图1c). p16中观察到的所有变化^{INK4A（墨水）}细胞周期进展无变化（数据未显示）。

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图1

第16页^{INK4A（墨水）}ATM和M2巨噬细胞中的水平较低。一从内脏AT活检中提纯人类ATM；从同一肥胖献血者的全血中纯化的单核细胞(n个=9）分化为MDM 7天。CD68型⁺从人类颈动脉斑块中分离出AMs(n个=6）通过激光捕获显微切割。分离mRNA并进行定量RT-PCR以测量第16页^{INK4A（墨水）}在单元格类型中。显示了统计上的显著差异(t吨测试*第页<0.05时**第页与ATM相比<0.01）。b条第16页^{INK4A（墨水）}用westernblot检测健康献血者单核细胞向巨噬细胞分化过程中不同时间点的蛋白表达。c（c）第16页^{INK4A（墨水）}在白细胞介素-4存在下，健康献血者血液单核细胞在交替巨噬细胞分化过程中的不同时间点用western blot检测蛋白质

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）α激活诱导第16页^{INK4A（墨水）}平滑肌细胞的表达[15]当PPARγ活化增强M2极化[16]，我们研究了GW929激活PPARγ是否影响第16页^{INK4A（墨水）}表达式。GW929对成熟MDM巨噬细胞的治疗导致对第16页^{INK4A（墨水）}而GW929处理对第16页^{INK4A（墨水）}成熟M2巨噬细胞的水平(ESM图1a). 因此，第16页^{INK4A（墨水）}不是由人类巨噬细胞中的PPARγ激活引起的。此外，通过在分化开始时向单核细胞中添加GW929来增强M2极化[16]没有进一步减少第16页^{INK4A（墨水）}表达式(ESM图1b)，表明第16页^{INK4A（墨水）}主要依赖IL-4。

这些数据表明第16页^{INK4A（墨水）}人类ATM中的表达较低，体外将原代单核细胞分化为M2巨噬细胞模拟了这种效果。

p16静音^{INK4A（墨水）}MDM诱导类似人类ATM的表型

ATM显示低第16页^{INK4A（墨水）}与MDM相比，M2极化降低p16的表达^{INK4A（墨水）}水平，我们确定p16之间是否存在直接链接^{INK4A（墨水）}水平和巨噬细胞极化。静音p16^{INK4A（墨水）}使用siRNA在MDM中约占60%(图2a)M2标记的mRNA表达增加CD206型（也称为MRC1型)和AMAC1型，而CD163型，当巨噬细胞在体外与IL-4分化时，M2标记物通常下调[4]，减少了(图2c).

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图2

抑制p16^{INK4A（墨水）}MDM中的水平诱导了类似于人类ATM的表型。p16蛋白的蛋白质印迹^{INK4A（墨水）}用对照干扰或siRNA靶向转染MDM中的蛋白质CDKN2A型(一)以及是否进行LPS治疗(b条).c（c）siRNA转染后，分离mRNA，并表达CD206型,AMAC1型,CD163型通过定量RT-PCR定量。d日用LPS处理MDM 2 h，分离RNA并表达TNF公司,COX2型、和IL6（IL6）通过定量RT-PCR定量。e（电子）LPS处理24h后，用ELISA法检测上清液中TNF蛋白。显示了统计上的显著差异(t吨测试***第页<0.001, **第页<0.01和*第页<0.05). Scr，控制加扰，白色条；Si-p16，siRNA靶向CDKN2A型，黑条

使用LPS激活MDM增加p16^{INK4A（墨水）}蛋白质水平(图2b)，提示p16的作用^{INK4A（墨水）}在炎症反应中。确定p16是否^{INK4A（墨水）}敲除还调节巨噬细胞的炎症反应，来自健康供体的MDM在p16后用LPS治疗^{INK4A（墨水）}沉默。尽管p16^{INK4A（墨水）}击倒诱导M2表型(图2c)炎症反应基因的表达TNF公司,COX2型和IL6（IL6）LPS诱导作用更强(图2d). 此外，在转染p16的细胞中，LPS诱导的TNF分泌更高^{INK4A（墨水）}小核糖核酸(图2e). 尽管M2极化，但激活后产生的高水平炎性细胞因子与人类ATM表型相似[8].

重要的是，第16页^{INK4A（墨水）}腺病毒介导的基因转移导致生产过剩(图3a)显示了与p16观察到的表达模式相反的表达模式^{INK4A（墨水）}沉默，即下调CD206型和AMAC1型，上调CD163型(图3b)对脂多糖的反应减弱(图3c). 总之，这些数据表明p16的下调^{INK4A（墨水）}水平导致M2样表型，与炎症反应加剧相关，反映ATM的表型，而p16^{INK4A（墨水）}生产过剩抑制ATM表型。

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图3

p16的过度生产^{INK4A（墨水）}MDM可减少M2极化和LPS诱导的炎症反应。MDM感染了对照LacZ或p16^{INK4A（墨水）}.一第16页^{INK4A（墨水）}蛋白质检测采用westernblot。b条,c（c）感染后，分离mRNA并表达CD206型,AMAC1型和CD163型 （b）或液化石油气-诱导TNF，COX2型和IL6（IL6） （c）通过定量RT-PCR进行定量。显示了统计上的显著差异(t吨测试***第页<0.001和**第页<0.01). Ad-LacZ，MDM感染对照LacZ，白色条；Ad-p16，受p16感染的MDMs^{INK4A（墨水）}腺病毒，黑条

第16页^{INK4A（墨水）}干扰NFκB上游的TLR4反应而不影响TLR4水平

调节M2基因的主要途径涉及STAT6信号[三]. 然而，p16的调制^{INK4A（墨水）}在基础条件下或IL-4治疗后，这些水平并不影响STAT6的磷酸化（数据未显示）。LPS信号涉及TLR4介导的p38磷酸化和核因子κB激酶抑制剂（IKK）α、β[17]. 后者磷酸化B细胞抑制剂α（IκBα）中κ轻多肽基因增强子的核因子，导致IκB-α降解，随后释放和核转位B细胞中κ重多肽基因增强子的核因素（NFκB），从而启动炎症基因的转录激活[17]. TLR4蛋白活化后被降解[18]. 尽管p16^{INK4A（墨水）}生产过剩降低了对LPS的反应(图3c)在基础或LPS刺激条件下，这种效应与TLR4蛋白水平无关，后者导致TLR4完全降解(图4)指出了这条途径的下游效应。事实上，脂多糖诱导的p38和IKKα、β磷酸化在过度产生p16的细胞中不太明显^{INK4A（墨水）}(图4). 总之，IκBα抑制NFκB的核移位[17]，在LPS处理下降解较少(图4). 值得注意的是，在非模拟条件下，p16^{INK4A（墨水）}过度表达导致抗炎IκBα水平降低(图4). 肥胖与NEFAs水平增加有关，如棕榈酸酯[19]，作为TLR4配体[20]. 与LPS治疗的观察结果一致，MDM过度产生p16^{INK4A（墨水）}用棕榈酸酯刺激后，p38和IKKα，β的磷酸化降低(ESM图2). 这些结果表明p16^{INK4A（墨水）}直接干扰TLR4–NFκB信号传导，导致炎症改变。

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图4

第16页^{INK4A（墨水）}干扰NFκB上游的TLR4信号传导。MDM感染了对照lacZ或p16^{INK4A（墨水）}腺病毒和LPS处理1h后，使用所示抗体通过western blot研究信号通路。Ad-LacZ，MDMs感染对照LacZ；Ad-p16，MDM感染p16^{INK4A（墨水）}腺病毒。磷

讨论

我们发现，肥胖患者的ATM以及体外IL4极化的人类M2巨噬细胞的特点是第16页^{INK4A（墨水）}分别与MDMs或AM以及体外LPS诱导的M1巨噬细胞进行比较。此外，siRNA介导的p16下调^{INK4A（墨水）}MDM诱导M2表型，同时增加对LPS的炎症反应，从而诱导ATM样表型。p16的过度生产^{INK4A（墨水）}导致了相反的表型，提供了p16效应的证据^{INK4A（墨水）}具体而言。

虽然人类ATM的显性表型是M1/M2混合表型[8,21]，最近的报告描述了肥胖AT中存在不同的巨噬细胞亚群[7,22]. 与M1标记CD11c为阴性、M2标记MR为阳性的常驻ATM相比，冠状结构（CLS）-ATM显示出混合的极化标记（即它们对CD11c和MR均为阳性），并且比常驻实质ATM产生更多的促炎介质[22],因此类似于p16下调时观察到的表型^{INK4A（墨水）}有趣的是，这些CLS巨噬细胞表达较低水平的CD163型比常驻ATM机[22]. 结合我们的结果，p16的抑制^{INK4A（墨水）}水平导致以低水平为特征的混合表型CD163型表达，这些观察结果表明p16^{INK4A（墨水）}可能特别参与肥胖期间血单核细胞向CLS-ATM的分化。因此，确定p16所在的ATM亚群是很有意思的^{INK4A（墨水）}沉默，其表达水平是否与CLS形成、AT炎症或代谢紊乱相关。

我们的数据显示p16^{INK4A（墨水）}在人类巨噬细胞中干扰TLR4–NFκB信号传导，确定p16通过的机制^{INK4A（墨水）}调节这些细胞的炎症状态。同样，之前已经显示p16的本地传输^{INK4A（墨水）}成骨关节抑制类风湿关节炎小鼠模型中的促炎细胞因子[23]E2F1转录因子是p16的靶点^{INK4A（墨水）}是某些NFκB靶基因转录激活所必需的[24]. 此外，至少在小鼠中，NFκB通路已被证明在ATM表型和功能中发挥作用。NFκB应答启动子驱动的荧光素酶构建小鼠在饮食诱导肥胖期间ATM簇中显示信号富集[25]Ikkβ造血水平的调节影响肥胖和胰岛素抵抗的发展[26,27]. 同时，在人类ATM中发现的促炎症表型涉及许多NFκB靶基因，例如TNF公司,IL6（IL6）,MCP1（MCP1）（也称为CCL2级),IL8号机组和COX2型[21].

p16的过度生产^{INK4A（墨水）}导致IKKα、β磷酸化降低。此外，在TNF受体相关因子6（TRAF-6）水平上，LPS诱导的信号通路与NFκB信号汇合的另一组分p38的磷酸化[17]，被削弱了。尽管p16^{INK4A（墨水）}已经证明通过与NFκB的p65亚单位的负相互作用诱导抗增殖反应[28]，我们的结果表明p16^{INK4A（墨水）}干扰NFκB p65亚基的上游，可能在TRAF6的水平或上游。值得注意的是，TLR4水平不受p16的影响^{印度航空公司}生产过剩。

有趣的是，控制M2极化的主要途径，即STAT6磷酸化，在p16的调节上没有改变^{INK4A（墨水）}级别（未显示数据）。然而，在基础条件下，p16的过度生产^{INK4A（墨水）}也对NFκB通路产生影响，如较低的IκBα蛋白水平所示。已知IκBα具有抗炎作用[17]脂联素抑制IκBα磷酸化和随后的降解促进M2极化[29]表明IκBα的抗炎作用可以增强选择性极化。术后基础状态下较低的IκBα水平第16页^{INK4A（墨水）}因此，过度表达可能（至少部分）导致M2基因的表达减少。另外，NFκB已被证明在肿瘤相关巨噬细胞中维持M2极化状态[30]表明NFκB信号本身的减少也可能导致巨噬细胞过度表达M2谱的降低第16页^{INK4A（墨水）}.

沉默第16页^{INK4A（墨水）}基因座与癌症发展风险增加有关。例如，在某些血液系统恶性肿瘤中，p16^{INK4A（墨水）}功能丧失导致细胞增殖失控[31]. 然而，人类MDM是终末分化细胞，这意味着它们处于与细胞周期退出密切相关的细胞状态。总之，无论其极化状态如何，成熟巨噬细胞均处于G0期（数据未显示）。因此，我们建议第16页^{INK4A（墨水）}表达和巨噬细胞表型，独立于细胞周期控制。与肺癌和造血癌白血病等几种癌症并行CDKN2A/B型基因组甲基化状态调节p16^{INK4A（墨水）}用作早期诊断标记[31]，第16页^{INK4A（墨水）}ATM中的水平可以作为ATM功能的诊断标志。

尽管对小鼠的研究表明p16随年龄增长而增加^{INK4A（墨水）}水平阻碍β细胞增殖，导致葡萄糖稳态受损[32]，p16是否^{INK4A（墨水）}在人类胰腺功能中起着类似的作用。我们的数据显示p16的新作用^{INK4A（墨水）}在另一种细胞类型，即人类ATM中，这在2型糖尿病的发展过程中非常重要[1]. 与胰腺β细胞一样，p16增加^{INK4A（墨水）}水平导致造血干细胞增殖的年龄依赖性下降[33]，产生免疫细胞。如我们的结果所示，p16^{INK4A（墨水）}生产过剩抑制了非扩散ATM的表型，即p16的年龄相关增加^{INK4A（墨水）}水平可能会干扰正常的ATM功能，可能导致AT稳态紊乱。作为编码p16的位点^{INK4A（墨水）}与2型糖尿病风险相关[13]，我们的结果表明p16^{INK4A（墨水）}ATM中的水平可能部分解释了2型糖尿病与糖尿病之间的联系不平衡CDKN2A型轨迹。

总之，本研究表明p16的下调^{INK4A（墨水）}是巨噬细胞成熟为ATM期间的一个重要事件，充当细胞炎症状态的调节剂。

补充材料

致谢

缩写

脚注

参考列表