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BMC癌症。2013; 13: 482.
2013年10月16日在线发布。 数字对象标识：10.1186/1471-2407-13-482
预防性维修识别码：项目经理4016614
PMID：24131658

L型氨基酸转运蛋白1表达作为胆道癌预后标志物的临床意义和新靶向治疗的潜力

Kyoichi Kaira公司,通讯作者1,11,12 Yutaka Sunose公司,#2 大岛康弘,通讯作者#三 Noriko S Ishioka公司,三 荒川县,4 小川哲史,4 Noriaki Sunaga公司,1 清水忠弘（Kimihiro Shimizu）,2 丰田秀吉,5 Noboru Oriuchi公司,6,7 伊藤秀美,8 Shushi Nagamori公司,9 吉田佳美（Yoshikatsu Kanai）,9 山口爱子,10 Atsuki Segawa先生,11 穆内诺里岛,11 森喜朗,1 Tetsunari Oyama公司,11和岩敏武彦（Izumi Takeyoshi）2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景

L型氨基酸转运蛋白1（LAT1）的表达在肿瘤细胞的生长和生存中起着重要作用。然而，LAT1在胆道癌中表达的临床病理意义尚不清楚。本研究旨在确定LAT1表达的生物学意义，并探讨LAT1是否可以作为胆道癌的预后生物标志物。

方法

回顾性分析139例连续手术切除的病理Ⅰ～Ⅳ期胆道腺癌患者。肿瘤标本通过免疫组织化学染色LAT1、Ki-67、CD34测定的微血管密度和p53；与患者的预后相关。LAT1表达的生物学意义通过在体外和体内使用胆管癌细胞系进行LAT抑制剂2-氨基双环-（2,2,1）-庚烷-2-羧酸（BCH）的实验。

结果

在所有患者中，64.0%的患者发现LAT1高表达。LAT1的表达与淋巴结转移、细胞增殖和血管生成密切相关，是预测术后不良预后的重要指标。多元分析显示LAT1表达是一个显著的独立预测因子。两者都有在体外和体内初步实验表明，BCH显著抑制肿瘤生长，并对吉西他滨和5-FU产生附加治疗效果。

结论

LAT1的高表达是预测胆道腺癌患者预后的一个有希望的病理标志物。抑制LAT1可能是治疗这种痛苦疾病的有效靶向治疗。

关键词：LAT1、胆道癌、氨基酸转运蛋白、预后因子、BCH

背景

胆道癌是一种相对少见的恶性肿瘤，是一种预后较差的恶性肿瘤[1]. 胆囊癌和肝外胆管癌（胆管癌）是最常见的胆道癌，胆管癌根据其在胆道树中的解剖位置分为肝内和肝外疾病[2]. 手术切除仍然是唯一可能治愈的治疗选择，然而，超过一半的患者患有无法切除的疾病。即使可以进行根治性切除，肝内胆管癌的5年总生存率为20-32%，肝门部胆管癌为30-42%，远端胆管癌为18-54%[三-5]. 虽然许多患者可能接受辅助化疗以提高治愈率，但目前还没有既定的标准化疗。对于晚期胆道癌，吉西他滨和铂类药物联合化疗被视为标准治疗，然而，治疗后的预后仍然很差[6]. 迄今为止，如果接受化疗或放射治疗，胆道癌患者缺乏生存益处。因此，我们需要一种新的有效治疗方法来提高患者的生存率。因此，为了改善治疗结果，应该建立能够预测特定治疗反应和预后的临床标志物。

氨基酸转运蛋白对正常细胞和转化细胞的生长和增殖至关重要[7,8]. L型氨基酸转运蛋白1（LAT1）是L型氨基酸转运体之一，可转运亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸和组氨酸等大的中性氨基酸[9,10]. LAT1需要与4F2细胞表面抗原（CD98）的重链共价结合，以实现其在质膜中的功能表达[9]. LAT1与癌细胞或增殖细胞密切相关，以前的研究表明LAT1在增殖组织、许多肿瘤细胞系和原发性人类肿瘤中高度表达[10-17]. 在人类肿瘤组织中，LAT1的表达与细胞增殖、血管生成和细胞周期调控密切相关[18,19]. 最近，LAT1的表达被描述为在各种人类癌症中预后不良的一个重要因素[12-17]. 此外，通过使用2-氨基双环-（2,2,1）-庚烷-2-羧酸（BCH）抑制LAT1，提示了肿瘤细胞系中LAT1的靶向治疗潜力[20,21]. 然而，LAT1在胆道癌患者中的表达是否具有临床和病理意义尚不清楚。

在本研究中，我们检测了LAT1在切除组织标本中的表达，以评估LAT1对胆道癌患者的临床病理学和预后意义。LAT1的表达与病理生物标志物如细胞增殖、细胞周期调节器（p53）和血管生成相关。此外，在体外和体内动物实验旨在研究LAT1作为新型靶向治疗中的治疗性生物标记物的潜力。

方法

患者

我们分析了2000年9月至2011年10月间在群马大学医院和前桥红十字医院接受手术切除的157名连续的胆道腺癌患者。排除了10名接受诱导化疗或放射治疗的患者。所有病例均在手术切除前进行磁共振胰胆管造影（MRCP）和内镜逆行胰胆管造影术（ERCP），胰腺导管腺癌和壶腹癌均被排除在研究范围之外。8名患者的标本不可用。由一位经验丰富的病理学家对所有手术标本进行审查，并根据WHO分类进行分类，这位病理学家不知道临床或影像学发现。排除病理诊断为非腺癌的患者。研究中总共分析了139名患者。研究人群包括肝外胆管癌（EHCC）、肝内胆管癌（IHCC）和胆囊癌（GB）患者。病理性肿瘤结节转移（TNM）分期采用美国癌症联合委员会和联合国际癌症中心采用的国际胆管癌分期系统[22].

我们还分析了一个由16名手术切除良性胆道病变的患者组成的对照组。对16例患者的标本进行免疫组织化学染色，并与胆道癌进行比较。对照组的病理诊断如下：胆固醇息肉6例，增生性息肉4例，黄色肉芽肿性胆囊炎3例，腺肌瘤病3例。本研究得到了群马大学医院机构审查委员会（临床研究伦理委员会-群马大学医学院）的批准，并获得了参与本研究的所有患者或其家属的书面知情同意。

免疫组织化学染色

用LAT1抗体（2 mg/mL，抗人单克隆小鼠抗体，4A2，由H.Endou博士提供[J-Pharma，Tokyo，Japan]，稀释度1:3200）通过免疫组织化学染色测定LAT1的表达。先前已经描述了LAT1抗体的产生和表征[15]. 免疫染色的详细方案在别处发布[16]. 通过染色程度评估LAT1表达评分：1、染色面积≤10%；2，11-25%染色；3、26-50%染色；染色≥51%。染色肿瘤细胞评分为3或4的肿瘤被定义为高表达。

对于CD34、Ki-67和p53，根据先前报告中描述的程序进行免疫组织化学染色[23,24]. 使用以下抗体：抗CD34的小鼠单克隆抗体（日本东京日立，1:800稀释）、Ki-67（丹麦格洛斯特鲁普Dako，1:40稀释）和p53（D07；Dako 1:50稀释）。在x 400区域（0.26 mm）的四个选定热点中计算CD34阳性血管的数量2现场区域）。微血管密度（MVD）定义为每0.26 mm微血管的平均计数2现场区域。评估CD34阳性血管的中位数，染色肿瘤细胞所占比例超过每个中位数的肿瘤被定义为高表达。对于p53，对核反应产物进行显微镜检查并评分，超过10%的肿瘤细胞中p53表达被定义为阳性表达[24]. 对于Ki-67，评估免疫染色切片的高度细胞区域。所有核染色强度不同的上皮细胞均被定义为高表达。每张玻片上大约有1000个细胞核。增殖活性评估为样品中Ki-67染色细胞核的百分比（Ki-67标记指数）。评估Ki-67标记指数的中值，大于中值的肿瘤细胞被定义为高表达。至少有两位作者在盲法下使用光学显微镜对切片进行了评估。

生物化学材料

Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）、青霉素和链霉素购自WAKO Pure Chemical Industries（日本大阪）。BCH来自NARD研究所（日本兵库）。3-[4,5-二甲基-2-噻唑基]-2,5-二苯基-2小时-四唑溴（MTT）购自Dojindo Laboratories（日本熊本）。所使用的所有其他化学品都具有可用的最高纯度。

细胞培养

人类胆管癌细胞系HuCCT1（JCRB0425）、OZ（JCRB1032）和HuH28（JCRB00426）购自日本大阪卫生科学研究资源银行[25-27]并常规保存在含有10%热灭活胎牛血清（AusGeneX、Loganholme、QLD、澳大利亚）、青霉素（100单位/ml）、链霉素（100μg/ml）和L-谷氨酰胺（2 mM）的DMEM中，37°C，5%CO295%空气。

LAT mRNA在胆管癌中的表达

此前，已鉴定出4种L型氨基酸转运蛋白亚型（LAT1-4）[8,23-30]. 实时RT-PCR分析检测胆管癌细胞株中LAT1、LAT2、LAT3和LAT4 mRNA的表达。使用Fast Pure RNA试剂盒（Takara Bio，Shiga，Japan）从HuCCT1细胞中分离总RNA。第一链补体DNA由0.5μg总RNA和PrimeScript逆转录酶（Takara Bio）合成。特定引物的序列显示在附加文件中1：表S1（仅在线）。实时PCR分析是通过首先用引物（每个引物0.5μM）和Thunderbird SYBR qPCR Mix（Toyobo，Osaka，Japan）培养每个补体DNA样本来进行的。使用Piko-Real热循环器（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）进行40个周期的放大（95°C 15 s，60°C 30 s）。数据根据2进行分析-ΔΔCT型方法（内部对照：β-actin，校准品：LAT1）。

LAT1抑制抑制细胞增殖

细胞以1 x 10的浓度进行电镀三细胞/孔置于96周板中，在生长培养基中培养24小时。首先，为了确定LAT1抑制对胆管癌的影响，用BCH（0.1、1、2、3、5、10、20、30或100 mM）处理HuCCT1细胞并培养6天。接下来，评估LAT1抑制剂对吉西他滨（GEM，Eli Lilly，Indianapolis，IN）或5-氟尿嘧啶（5-FU，Kyowa Hakko Kirin，Shizuoka，Japan）抗肿瘤活性的影响。在存在或不存在10 mM BCH的情况下，用GEM（10、20、50或100 nM）或5-FU（1、10或100μM）培养细胞6天。然后，在37°C下用0.5 mg/ml MTT培养细胞4小时。将所得的甲醛溶解，并使用微量滴定板阅读器（Vmax；Molecular Devices，Sunnyvale，CA）在590 nm处读取吸光度。

抑制LAT1抑制细胞摄取氨基酸

BCH对氨基酸转运的抑制作用用[14C] L-亮氨酸（Perkin-Elmer Life Sciences，马萨诸塞州波士顿），LAT底物之一[31]. HuCCT1电池（1.0 x 105细胞/孔）置于24孔板中，并在生长培养基中培养24小时。培养后，用无钠Hunk平衡盐溶液（Na+-免费HBSS；137 mM氯化胆碱、5.3 mM KC1、1.3 mM氯化钙2，0.49 mM氯化镁2，0.41 mM硫酸镁4，0.35毫米K2高性能操作4，0.44 mM千赫2人事军官4，4.2 mM KHCO三，5.6 mM D-葡萄糖（pH 7.4））。细胞在钠中培养+-在37°C下，将含有不同浓度BCH（0.01、0.03、0.1、0.3、1或3 mM）的游离HBSS放置10分钟，然后用Na代替上清液+-含1μM的游离HBSS[14C] 具有相同浓度（0.01、0.03、0.1、0.3、1或3 mM）的L-亮氨酸和BCH。治疗后1分钟[14C] L-亮氨酸，通过去除摄取溶液，然后用冰冷的Na洗涤三次来终止摄取+-免费HBSS。用0.1N NaOH溶解细胞，并通过液体闪烁光谱法（AccuFLEX LSC-7200，Hitachi Aloka Medical，Tokyo，Japan）测量放射性。

免疫印迹法

将细胞溶解在样品缓冲液（25%甘油、1%十二烷基硫酸钠、62.5 mM Tris-Cl、10 mM二硫苏糖醇）中，并在65°C（LAT1）或95°C（CD98和β-actin）下培养15分钟。含有40μg蛋白质的等分样品通过10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。在4°C下将斑点培养在10 mM Tris–HCl、100 mM NaCl、0.1%吐温20、pH 7.5（TBST）、5%脱脂奶中过夜，然后用兔抗LAT1 C末端抗体（1:5000）培养[32]，兔抗CD98抗体（1:200；Santa Cruz Biotechnology）或兔抗肌动蛋白抗体（1:1000；Cell Signaling Technology，Beverly，MA）在4°C下过夜。用TBST清洗后，在室温下用山羊辣根过氧化物酶结合的抗兔IgG抗体（1:20000；细胞信号技术）培养印迹1.5小时。用TBST进一步清洗印迹，并使用增强化学发光western印迹检测试剂（GE Healthcare，Piscataway，NJ）显示特定蛋白质。

抑制LAT1的抗肿瘤作用

从CLEA Japan（日本东京）购买五周龄雄性BALB⁄c裸鼠。这些动物按照我们工厂动物护理和实验委员会的指导方针进行护理和治疗。HuCCT1电池（1 x 107细胞）接种到小鼠的侧面。接种后，用卡尺测量肿瘤的长短直径，肿瘤体积按下式计算：肿瘤体积（mm三)=长直径x（短直径）2/ 2. 肿瘤体积达到约100 mm后三将小鼠分为对照组和治疗组（n=10）。从分组当天（第0天）起每天静脉注射一次盐水或BCH（200 mg/kg），持续14天。每周测量两到三次肿瘤体积和体重，持续42天。没有动物被排除在外，也没有动物因毒性而死亡。

为了评估BCH对肿瘤葡萄糖代谢的影响，对荷瘤小鼠进行了正电子发射断层扫描（PET）成像[18F] 氟-2-脱氧葡萄糖(18F-FDG）使用动物PET扫描仪（Inveon，Siemens，Knoxville，TN）。18F是使用回旋加速器（CYPRIS HM-18，住友重工，日本东京）和18F-FDG是在我们的工厂合成的。从治疗组和对照组中随机选择小鼠进行PET成像。在成像之前，小鼠禁食8小时，可以自由饮水。18给小鼠静脉注射F-FDG（10 MBq），然后在给药后2小时采集10分钟数据。在给药、摄取期和PET扫描期间，小鼠保持在异氟醚麻醉下。为了分析图像，使用ASIPro-VM（CTI-Concorde Microsystems，田纳西州诺克斯维尔）在肿瘤活动边缘周围绘制感兴趣区域（ROI）。记录了最大和中间活性。标准化摄取值（SUV）用于评估肿瘤的葡萄糖代谢。SUV计算如下：SUV=ROI活性（kBq/ml）/注射剂量（MBq）x体重（kg）。比较BCH处理小鼠和对照小鼠的SUV max和SUV 50%。

统计分析

概率值<0.05表示存在统计显著差异。结果用平均值±扫描电镜表示。差异的显著性通过Student t检验确定。使用非参数Spearman秩检验分析不同变量之间的相关性。采用Kaplan-Meier方法估计生存率随时间的变化，并通过对数库检验分析生存差异。总生存期（OS）是指从肿瘤切除到因任何原因死亡的时间。无进展生存期（PFS）定义为肿瘤切除到首次疾病进展或死亡之间的时间。采用逐步Cox比例风险模型进行多变量分析，以确定独立的预后因素。使用GraphPad Prism 4软件（Graph Pad software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）和JMP 8（SAS，Institute Inc.，美国北卡罗来纳州卡里）进行统计分析。

结果

患者人口统计

分析了139例胆道腺癌患者（EHCC，n=89；GB，n=30；和IHCC，n=20）。表中列出了按肿瘤位置分层的临床病理结果1患者年龄为42至86岁，中位年龄为71岁。大多数肿瘤（n=126，90.6%）为病理I至III期。51名患者接受了GEM、S-1（日本东京太和制药有限公司）或替加氟（氟尿嘧啶衍生物药物）的术后辅助化疗。未对任何患者进行术中治疗。手术当天被视为衡量术后生存率的开始日期。所有患者的中位随访时间为18.6个月（范围为3.0至110.3个月）。

表1

患者特征和病理结果

特性所有患者（n=139）
EHCC（n=89）
GB（n=30）
IHCC（n=20）
对照组（n=16）
患者人数%患者人数%患者人数%患者人数%患者人数%
中位年龄（年）
71
71
74
64
62
男性
86
61.8
65
73
8
26.7
13
65
不适用
R0切除
67
48.2
38
42.7
19
47.4
10
50
不适用
差异化
33
23.7
18
20.2
三
10
12
60
不适用
淋巴渗透
111
79.8
74
83.1
23
76.7
14
70
不适用
血管侵犯
93
66.9
66
74.1
16
53.3
12
60
不适用
淋巴转移
62
44.6
41
46.1
11
36.7
10
50
不适用
UICC p级
 
 
 
 
 
 1
40
28.7
23
25.8
12
40
5
25
不适用
 2
70
50.4
49
55.1
12
40
9
45
 三
16
11.5
8
9
5
16.7
三
15
 4
13
9.4
9
10.1
1
3.3
三
15
乳头形态
32
23
13
14.6
18
60
1
5
不适用
辅助化疗
51
36.7
34
38.2
8
26.7
9
45
不适用
CEA（高）
65
46.7
46
51.7
12
40
7
35
不适用
CA19-9（高）
66
47.5
44
49.4
12
40
10
50
不适用
LAT1（高）
89
64
59
66.3
18
60
12
60
0
0.0%
Ki-67（高）
62
44.6
43
48.3
13
43.3
6
30
0
0.0%
CD34（高）
69
49.6
46
51.7
14
46.7
9
45
0
0.0%
p53（阳性）7151.14449.42066.773500.0%

缩写:EHCC公司肝外胆管癌，GB（英国）胆囊癌，IHCC公司肝内胆管癌，UICC大学国际抗癌联合会，p期病理分期，CEA公司癌胚抗原，拉丁美洲T1L-型氨基酸转运蛋白1，不适用不适用。

免疫组织化学分析

对139例胆管癌原发灶和16例胆管良性病变切除灶进行免疫组化分析。图1表示LAT1表达的免疫组织化学染色。LAT1免疫染色在肿瘤组织中的癌细胞中检测到，主要定位于其质膜上。所有阳性细胞均显示出较强的膜性LAT1免疫染色。细胞质染色很少明显。根据肿瘤位置比较LAT1的高表达率和平均评分（附加文件2：表S2，仅在线）。在所有患者中，LAT1的高表达率和平均得分分别为64.0%和2.7±0.9。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为1471-2407-13-482-1.jpg

对一名79岁肝外胆管癌男性患者（a）和一名66岁黄色肉芽肿性胆囊炎女性患者（B）的组织进行免疫组织化学染色。在胆管癌中LAT1的免疫染色显示出膜免疫染色模式，但在黄色肉芽肿性衣囊炎中没有LAT1染色的证据。

根据胆管癌的分析结果，高CD34表达和高Ki-67标记指数的截止点定义如下。CD34阳性血管的中位数为21（范围为4-52），21的值被选为截止点。Ki-67标记指数的中位数为35%（范围2-76），35%的值被选为截止点。p53阳性表达率为51.1%（71/139）。表1根据肿瘤位置显示这些生物标记物的表达状态。胆管癌中这些生物标记物的高表达率或阳性率明显高于胆道良性病变（表1). 表中列出了根据LAT1表达状态得出的患者人口统计数据2LAT1的表达与淋巴渗透、血管浸润、淋巴结转移、CA19-9、Ki-67和MVD显著相关。

表2

根据LAT1表达状态的患者人口统计学

参数所有患者（n=139）
肝外CC（n=89）
胆囊癌（n=30）
肝内CC（n=20）
高（n=89）低（n=50） 第页 -价值高（n=59）低（n=30） 第页 -价值高（n=18）低（n=12） 第页 -价值高（n=12）低（n=8） 第页 -价值
年龄
≤65 / >65
24/65
11/39
0.549
17/42
4/26
0.121
3/15
2/10
>0.999
5/7
5/3
0.649
性别
男/女
55/34
31/19
>0.999
43/16
22/8
>0.999
4/14
4/8
0.677
8/4
5/3
>0.999
肿瘤大小（mm）
≤35 / >35
48/41
28/22
0.862
34/25
22/8
0.170
11/7
10/2
0.248
4/8
4/4
0.647
切除状态
R0/R1级
42/47
25/25
0.859
25/34
13/17
>0.999
12/6
8/4
>0.999
5/7
5/3
0.649
病理分化
WD或MD/PD
67/22
39/11
0.572
46/13
25/5
0.780
16/2
11/1
0.377
5/7
3/5
>0.999
淋巴渗透
是/否
78/11
33/17
0.003
53/6
9/21
<0.001
16/2
7/5
0.459
9/3
5/3
0.642
血管侵犯
是/否
68/21
25/25
0.002
49/10
17/13
0.011
11/7
4/8
0.263
8/4
4/4
0.647
淋巴结转移
是/否
51/38
11/39
<0.001
33/26
8/22
0.013
9/9
2/10
0.121
9/3
1/7
0.019
疾病分期
I或II/III或IV
64/25
45/5
0.098
43/16
27/3
0.099
12/6
12/0
0.056
9/3
6/2
>0.999
乳头状花纹
是/否
18/71
14/36
0.302
8/51
5/25
0.755
10/8
8/4
0.708
0/12
1/7
0.400
辅助化疗
是/否
40/49
11/39
0.009
28/31
6/24
0.012
7/11
1/11
0.099
5/7
4/4
>0.999
CEA公司
≤2.1 / >2.1
45/44
29/21
0.479
26/33
13/17
>0.999
11/7
7/5
>0.999
8/4
5/3
>0.999
CA19-9号
≤45.1 / >45.1
32/57
37/13
<0.001
22/37
23/7
<0.001
9/9
9/3
0.259
5/7
5/3
0.649
基-67
高/低
47/42
15/35
0.012
33/26
10/20
0.072
10/8
3/9
0.141
4/8
2/6
>0.999
第53页
零件号
48/41
23/27
0.383
32/27
12/18
0.263
12/6
8/4
>0.999
4/8
3/5
>0.999
CD34型高/低51/3818/320.02134/2512/180.12411/73/90.0716/63/50.669

缩写:拉丁美洲T1L型氨基酸转运蛋白1，科科斯群岛胆管癌，男/女男性/女性，CEA公司癌胚抗原，WD或MD/PD高分化或中等分化/低分化，零件号积极/消极，粗体数字统计上的显著差异。

LAT1表达与其他生物标志物的相关性

Spearman秩相关分析显示，除IHCC中的CD34外，LAT1的表达与所有肿瘤部位的Ki-67和CD34显著相关（附加文件三：表S3，仅在线）。

单变量和多变量生存分析

在所有患者中，OS的5年生存率和中位生存时间（MST）分别为35.6%和1073天，PFS的3年存活率和MST分别为45.1%和840天。由于术后复发，39名患者接受了使用GEM或S-1的全身化疗。表三显示了所有患者的单变量和多变量分析（n=139）。单变量分析显示，OS的重要变量是切除状态、肿瘤分化、淋巴渗透、血管浸润、淋巴结转移、LAT1和Ki-67。通过单变量分析，PFS的重要预后标志物包括切除状态、肿瘤分化、淋巴渗透、血管浸润、淋巴结转移、肿瘤分期和LAT1。根据单变量log-rank检验的结果，我们筛选了预后因素第页 < 0.05. 多变量分析证实，淋巴渗透和LAT1高表达、淋巴渗透和Ki-67是预测OS差的独立预后因素，以及预测PFS差的淋巴渗透和血管浸润的独立预后因子。图2显示了LAT1高表达和低表达患者的Kaplan-Meier生存曲线。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为1471-2407-13-482-2.jpg

根据LAT1和CD98的表达对总生存率（OS）和无进展生存率（PFS）进行Kaplan-Meier分析，显示手术切除后的结果。OS的统计显著差异（A）和PFS（B）在LAT1高表达和低表达患者之间观察到。

表3

总生存率和无进展生存率的单变量和多变量分析

变量总体生存率
无进展生存
5年生存率（%） 第页 -值（单变量） 第页 -值（多元）危险比95%置信区间3年生存率（%） 第页 -值（单变量） 第页 -值（多元）危险比95%置信区间
解剖位置
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 EHCC公司
38.1
0.837
 
 
 
48.3
0.395
 
 
 
 IHCC公司
28
 
 
 
 
28.2
 
 
 
 
 GB（英国）
34.5
 
 
 
 
45.6
 
 
 
 
年龄
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 ≤65岁
39.9
0.095
 
 
 
48.4
0.707
 
 
 
 ≻65岁
27.5
 
 
 
 
54.7
 
 
 
 
性别
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 男性
30.2
0.267
 
 
 
49.7
0.634
 
 
 
 女性
33.5
 
 
 
 
58.6
 
 
 
 
切除
 
 
 
 
0.974至1.752
 
 
 
 
0.875至1.535
 R0级
42.5
0.026
0.075
1.300
64.2
0.016
0.310
1.154
 R1或R2
29.8
 
 
 
40.1
 
 
肿瘤分化
 
 
 
 
0.881至1.593
 
 
 
 
0.729至1.307
 良好或中等
47.3
0.017
0.251
0.190
55.2
0.008
0.845
0.971
 糟糕
7.8
 
 
 
39.6
 
 
 
淋巴渗透
 
 
 
 
1.057至7.629
 
 
 
 
1.212至10.72
 是的
19.9
0.002
0.036
2.555
44.9
<0.001
0.016
3.139
 不
79.9
 
 
 
81.7
 
 
 
血管侵犯
 
 
 
0.939
0.468至1.939
 
 
 
 
1.073至5.057
 是的
20.5
0.011
0.862
 
40.2
<0.001
0.031
2.244
 不
58.7
 
 
 
74.8
 
 
淋巴结转移
 
 
 
0.977
0.552至1.706
 
 
 
 
0.517至4.534
 积极的
20.5
0.041
0.935
 
41.3
0.003
0.454
1.507
 否定
44
 
 
 
63.2
 
 
 
肿瘤分期
 
 
 
 
 
 
 
 
 
0.922至2.980
 I或II
38.2
0.051
 
 
 
60.1
0.003
0.088
1.685
 III或IV
29.5
 
 
 
 
26.8
 
 
 
拉丁美洲T1
 
 
 
 
1.196至5.321
 
 
 
 
0.785至2.837
 高
20.3
<0.001
0.013
2.414
41.1
0.005
0.242
1.449
 低
59.3
 
 
 
71.3
 
 
 
基-67
 
 
 
 
1.030至3.093
 
 
 
 
 
 高
29.6
0.021
0.038
1.781
49.2
0.192
 
 
 
 低
36.2
 
 
 
53.6
 
 
 
 
第53页
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 积极的
21.3
0.119
 
 
 
54.1
0.831
 
 
 
 否定
38.1
 
 
 
 
51.6
 
 
 
 
CD34型
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 高
28.6
0.349
 
 
 
51.1
0.696
 
 
 
 低42.8    52.2    

缩写:95%置信区间95%置信区间，EHCC公司肝外胆管癌，IHCC公司肝内胆管癌，GB（英国）胆囊癌，CEA公司癌胚抗原，拉丁美洲T1L型氨基酸转运蛋白1，粗体数字统计上的显著差异。

人胆管癌细胞系中LAT1和CD98的表达

如附加文件所示4：图S1（仅在线），LAT1和CD98均在所有三种人类胆管癌细胞系HuCCT1、OZ和HuH28中表达。LAT1在OZ细胞中的表达水平低于其他细胞系。HuCCT1细胞因其在裸鼠体内LAT1的高表达和肿瘤发生而用于以下实验。

LAT抑制通过LAT1抑制细胞氨基酸转运和增殖

细胞对[14C] 在存在不同浓度BCH的情况下测量L-亮氨酸，并通过BCH治疗抑制浓度依赖性（图三A） ●●●●。实时RT-PCR检测的HuCCT1中LAT1-4的表达谱表明，LAT1的表达量远远高于其他LAT（图三B） ●●●●。这些结果表明，BCH抑制HuCCT1细胞中氨基酸通过LAT1的转运。此外，BCH浓度依赖性地减少了细胞数量（图三C） 表明BCH可以通过抑制氨基酸摄取来抑制HuCCT1细胞的增殖。

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LAT抑制对在体外GEM和5-FU的细胞增殖和抗肿瘤活性：（A）BCH抑制[14C] HuCCT1细胞中L-亮氨酸摄取浓度依赖性（n=4）。纵坐标显示的百分比为[14C] 作为对照，在没有BCH的情况下摄取L-亮氨酸。（B）HuCCT1细胞中LAT1、LAT2、LAT3和LAT4 mRNA的表达（n=4）。纵坐标显示由LAT1 mRNA校准的mRNA的相对数量。（C）BCH降低HuCCT1细胞的数量与浓度有关（n=4）。纵坐标显示控制百分比中的单元格数（不含BCH）。添加10 mM BCH增强GEM的抗肿瘤作用（D）和5-FU（E）在HuCCT1细胞上。坐标显示控件百分比中的单元格数（n=4）。***表示与对照组的统计显著差异（P<0.001）。

LAT抑制增强GEM和5-FU的抗肿瘤活性

如图所示三D和E，BCH和化疗药物联合使用可减少HuCCT1细胞的数量。GEM和5-FU的细胞毒性与10 mM BCH联合使用显著增强，表明LAT抑制剂对HuCCT1中GEM和5-FU的抗肿瘤活性具有加性作用。

LAT抑制抑制裸鼠移植瘤生长

检测BCH对胆管癌的抗肿瘤活性体内使用携带HuCCT1的小鼠。连续14天每天服用BCH（200 mg/kg），在给药完成后的3周内，肿瘤生长出现统计学上显著的延迟（图4A） ●●●●。BCH治疗后体重没有变化（图4B） ●●●●。BCH的抗肿瘤作用也使用18F-FDG PET测定肿瘤代谢的减少。SUV最大值和SUV 50%18在BCH治疗的小鼠中，F-FDG在第17天下降，随后增加（图4C） ●●●●。

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体内抑制LAT对胆管癌异种移植瘤的抗肿瘤作用。（A）静脉注射BCH显示HuCCT1肿瘤生长延迟（n=10）。与对照组相比，差异具有统计学意义，分别为*（P<0.05）、**（P<0.01）和***（P<0.001）。（B）服用BCH后HuCCT1荷瘤小鼠的体重变化（n=10）。（C）代表性冠状切面18HuCCT1小鼠出生后2小时的F-FDG PET图像18F-FDG注射。分组后指定的第二天进行PET成像（n=2）。校准条显示在图像的右侧。图片下方显示了SUV max和SUV 50%。

讨论

这是首次阐明胆道癌患者LAT1表达的临床病理意义的研究。肿瘤组织中LAT1的表达与淋巴结转移、细胞增殖和血管生成密切相关；是预测手术切除后不良预后的重要指标。因此，LAT1的高表达可能在胆管癌的生长中起重要作用。LAT1未观察到与解剖位置相关的差异。我们的初步实验结果表明，LAT1的抑制作用对胆管癌具有显著的抗肿瘤作用，毒性可接受，并且对GEM和5-FU具有加性治疗效果。我们的数据表明LAT1抑制抑制胆管癌的生长，LAT1可能是局部晚期或转移性胆管癌的潜在靶点。

最近，两项研究表明LAT1表达在胰腺癌预后预测中的意义[33,34]. 在胰腺癌中，LAT1的高表达率为52.6%[33]. 在胆道癌中，所有解剖部位（EHCC、IHCC和GB）LAT1高表达的比率具有相似的趋势。这些结果表明，LAT1在胆道癌中的表达高于胰腺癌。LAT1在人类癌症中的表达是可变的，在腺癌中相对较低，例如在肺腺癌中为29%[12]前列腺癌占22%[15]乳腺癌中43%[17]胃癌占43%[16]. LAT1在胆道腺癌中的表达水平似乎高于其他器官腺癌。因此，LAT1可能在促进胆道癌细胞增殖和肿瘤生长方面发挥重要作用。

最近，我们通过免疫组织化学方法评估了肺神经内分泌肿瘤患者LAT1的蛋白表达[35]. 我们的数据表明，LAT1的表达有从低度恶性肿瘤向高度恶性肿瘤增加的趋势。此外，我们证实了胰腺癌和胰腺腺瘤之间LAT1的表达不同，表明LAT1在胰腺腺瘤中没有表达，而LAT1则在胰腺癌中高表达[33]. 先前的实验数据也表明，LAT1在肿瘤细胞中过度表达，LAT2在正常细胞中主要表达[9,10]. 在人类组织标本的蛋白表达水平上，没有证据表明LAT1在正常组织中表达。因此，我们认为LAT1是肿瘤特异性氨基酸转运蛋白，具有潜在的癌症治疗靶点。

本研究探讨抑制LAT1对胆管癌的治疗潜力。我们发现BCH作为一种竞争性LAT抑制剂抑制胆管癌细胞的增殖，并对GEM和5-FU产生额外的治疗效果在体外此外，体内实验证明，该药物对肿瘤有明显的生长抑制作用，且毒性可接受。最近的报告还表明，BCH对LAT活性的抑制导致了各种癌症中细胞增殖的抑制[9,13,19,20]. 纳瓦西罗等。表明BCH降低了C6胶质瘤荷瘤大鼠模型的死亡率，提示LAT1抑制剂可能是治疗高级别胶质瘤的有效选择[14]. 基姆等。据报道，BCH可通过诱导癌细胞生长所需氨基酸的细胞内消耗而导致细胞凋亡[20]. 线路接口单元等。描述了BCH在不影响增殖的血管平滑肌细胞中的DNA合成的情况下诱导细胞凋亡，而它对静止的平滑肌细胞没有影响。因此，LAT1的抑制引起需要增加氨基酸代谢的高增殖细胞的生长抑制作用[36]. 另一种被提出的作用机制是通过抑制LAT1使细胞周期阻滞在G1期[37]. 然而，对于体内尽管有两项临床前研究调查了LAT1抑制剂在肿瘤异种移植（胶质瘤）中的潜力，但LAT1抑制物的抗肿瘤作用[13]和胆管癌（当前研究）。进一步体内这项研究有必要评估GEM联合LAT1抑制剂与目前仅使用GEM的胆道癌异种移植相比是否有效在体外这项研究已经证明了GEM加BCH的效果。

最近的一项系统综述表明，p53突变、细胞周期蛋白、增殖指数（Ki-67）、粘蛋白、CA19-9和CEA有可能成为胆管癌的预后预测因子[38]然而，目前还没有针对这些分子的靶向治疗。近年来，抗表皮生长因子受体（EGFR）药物、有丝分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MEK）抑制剂和抗血管生成药物被认为是治疗胆道癌的潜在靶向药物[39]. 然而，临床试验结果表明，对提高晚期胆道癌患者的生存率没有疗效[39].

结论

总之，LAT1的高表达在促进肿瘤生长和细胞增殖方面起着重要作用，是预测胆道癌患者预后不良的一个很有前景的病理标志物。LAT的抑制显著抑制胆管癌的生长，GEM和5-FU与LAT抑制剂联合使用的抗肿瘤效果增强。由于LAT1的表达是一个重要的预后标志物，LAT1抑制可能具有抗肿瘤作用，因此选择性抑制LAT1分子靶向药物将有助于胆管癌的治疗策略。

缩写

LAT1:L型氨基酸转运蛋白1；BCH:2-氨基双环-（2,2,1）-庚烷-2-羧酸；磁共振胰胆管成像；ERCP：内镜逆行胰胆管造影；EHCC：肝外胆管癌；IHCC：肝内胆管癌；GB：胆囊癌；TNM：病理性肿瘤结节转移；MVD：微血管密度；DMEM：Dulbecco改良的Eagle介质；MTT:3-[4,5-二甲基-2-噻唑基]-2,5-二苯基-2小时-溴化四唑；GEM：吉西他滨；5-FU:5-氟尿嘧啶；18F-FDG：[18F] 氟-2-脱氧葡萄糖；PET：正电子发射断层成像；ROI：感兴趣的地区；SUV：标准化摄取值；OS：总生存率；PFS：无进展生存；MST：中位生存时间；表皮生长因子受体；MEK：丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶。

竞争性利益

我们，所有作者，与其他人或组织没有任何可能不适当影响我们工作的财务或个人关系。作者声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

KK、YS、YO、NSI、HT、NO和KA对概念和设计、数据采集、数据分析和解释做出了重大贡献；KK、YO、YK、TO、KS、NS、HI、SN、AY、AS和MI参与了手稿的起草或重要知识内容的关键修订；KK、YO、TO、MM和IT已最终批准发布版本。所有作者阅读并批准了最终手稿。

发布前历史记录

本论文的出版前历史可从以下网址获取：

http://www.biomedcentral.com/1471-2407/13/482/prepub

补充材料

附加文件1：表S1：

本研究中使用的实时RT-PCR引物。

单击此处获取文件（35K，文档）
附加文件2：表S2：

LAT1高表达百分比与平均得分的比较。

单击此处获取文件（35K，文档）
附加文件3：表S3：

LAT1表达与各种生物标志物的相关性。

单击此处获取文件（40K，文档）
附加文件4：图S1：

LAT1和CD98在人胆管癌细胞系（HuCCT1、OZ和HuH28）中的表达。显示了三个独立实验的代表性图像。β-actin作为对照。

单击此处获取文件（579K，jpg）

致谢

这项工作得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部23591750（K.K）和25461801（N.O）拨款以及国家医院组织基于政策的医疗服务的部分支持。我们感谢斋藤雅子女士在免疫组织化学分析方面的技术援助。国家生物医学创新研究所（NIBIO）医疗产品开采项目的高级研究。

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