斑马鱼成体和胚胎肠神经元的神经化学编码(达尼奥·雷里奥)

摘要

斑马鱼，达尼奥·雷里奥是一种硬骨鱼类，与金鱼和鲤鱼一起属于鲤科。斑马鱼是原产于亚洲南部地区的小型（±3-4厘米）热带淡水鱼，在水族馆中很受欢迎(Spence等人，2008年). 在过去15年中，斑马鱼因其遗传和实验优势而成为生物医学研究中的领先模式生物（综述请参阅格伦沃尔德和艾森，2002年).

斑马鱼的肠道与哺乳动物的肠道非常相似。它是一个巨大的卷曲管，可以细分为三个区域。斑马鱼和其他鲤鱼一样，没有胃；相反，近端肠（PI），也称为肠球，被认为具有类似的功能。中肠（MI）被认为吸收营养并在粘膜免疫中发挥作用，而肠的远端（DI）类似于结肠(Ng等人，2005年). 尽管斑马鱼的胃肠道壁与哺乳动物的胃肠道具有高度相似性，但斑马鱼肠道却表现出一些差异。斑马鱼肠道缺乏高等脊椎动物的粘膜肌层和粘膜下层组织，并且含有上皮褶皱而非绒毛。此外，斑马鱼肠道神经系统（ENS）的组织与哺乳动物相比不太复杂。未见神经节；相反，单个肠神经元在纵、环平滑肌层之间形成肌间神经丛（综述见Wallace等人，2005年;奥尔森，2009).

斑马鱼ENS的发展已被广泛研究（综述见Wallace等人，2005年;Olden等人，2008年;Olsson等人，2008年)并受保守分子程序调节（有关综述，请参阅Burzynski等人，2009年). 斑马鱼的肠道神经元祖细胞来源于迷走神经嵴。受精后30小时，第一个前体细胞进入肠道原基的前部(Bisgrove等人，1997年;Shepherd等人，2004年). 它们以位于肠道两侧的两条细胞链的形式向尾部迁移，在迁移过程中增殖，并以大约60 hpf的速度到达肠道末端(Shepherd等人，2004年;Elworthy等人，2005年). 在这个迁移阶段之后，前体细胞继续增殖和分化。到96 hpf时，肠神经元已经在整个肠壁周围定植(Shepherd等人，2004年). 肠神经元的数量在93至98 hpf之间显著增加，在此期间斑马鱼肠神经元总数的±40%形成(Olden等人，2008年). 斑马鱼幼虫在开始摄食之前观察到有规律的自发繁殖收缩，这些收缩已被证明受神经元控制(Holmberg等人，2004年,2006). 因此，可以假设肠神经支配在喂食开始时发育良好，大约发生在受精后第5天（dpf；Olsson等人，2008年).

ENS是控制胃肠功能的主要系统。为了了解它是如何运作的，有必要确定肠神经元的不同功能类别。表征这些不同类别的一种方法是确定肠道神经元表达的神经化学物质（神经递质、神经肽、酶、钙结合蛋白（CaBP）、载体蛋白、神经内分泌标记物）的组合。肠道神经元的神经化学编码已经在几种哺乳动物中进行了广泛的研究。关于各种功能性肠神经元类别的最详细知识已经在豚鼠回肠中确定，其中已经确定了14个主要神经元类别（综述见Timmermans等人，1997年;Furness，2000年,2006;布鲁克斯，2001年). 以往关于斑马鱼肠道内在神经支配发育的研究已经报道了一些神经化学物质在肠道神经元的体细胞和/或纤维中的表达，包括速激肽、P物质和神经激肽a、血管活性肠肽（VIP）、，垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）、5-羟色胺（5-HT）、钙调素（CR）、钙结合蛋白（CB）、神经元一氧化氮合酶（nNOS）和降钙素基因相关肽(Poon等人，2003年;Holmberg等人，2004年,2006;Holmqvist等人，2004年;Levanti等人，2008年;Nazir等人，2008年;Olden等人，2008年;Olsson等人，2008年). 在2 dpf时可以检测到肠内氮能神经元(Holmqvist等人，2004年;Holmberg等人，2006年)而其他标记则出现在胚胎发生后期(Olden等人，2008年;Olsson等人，2008年). 然而，关于表达特定神经化学标记的肠神经元比例以及与特定肠神经元类型相关的神经化学编码的具体数据尚未报道。此外，关于发育中斑马鱼ENS中5-羟色胺能神经元的比例存在一些模糊性。奥尔森和同事（2008）据报道，5HT表达神经元在5dpf时约占肠道神经元总数的25%，但一项由Olden等人（2008）表明只有约12%的肠神经元在5dpf时表达5HT。

我们研究的目的是确定斑马鱼ENS发育过程中表达特定神经化学标记物的肠神经元的比例分布，特别是在72 hpf（当第一个肠神经元祖细胞开始分化时）的胚胎中，96 hpf（当整个肠壁已被神经元祖细胞定植时）和120 hpf（喂食开始时），以及在成年动物中。此外，为了鉴定斑马鱼ENS中不同的神经元亚型，还测定了神经化学标记物的共表达模式。

材料和方法

初级抗体

所有的初级抗体都是在先前对斑马鱼进行的形态学研究的基础上选择的。我们使用了两种泛神经标记物，一种针对人类神经元特异性HuC/HuD蛋白（Hu）的抗体，另一种针对乙酰化α-微管蛋白（α-tub）的抗体。Hu蛋白属于RNA-结合蛋白的胚胎致死性异常视觉系统家族，参与神经系统发育和维持的许多转录后机制。三个成员，即HuB、HuC和HuD，是存在于神经元细胞质和细胞核中的神经元特异性蛋白质(Fornaro等人，2007年). 抗Hu抗体以前被证明可以特异性标记斑马鱼的神经元细胞体(Olsson等人，2008年;奥尔森，2009)被认为是哺乳动物中最合适的抗体，可用于可靠估计肠道神经元总数(Lin等人，2002年). 抗α-桶抗体能特异性地检测斑马鱼的神经纤维，在一定程度上也能检测神经元细胞体(Wallace等人，2005年;奥尔森，2009). 大脑冰冻切片染色产生的免疫反应模式（IR）与之前对α-管的描述相同(Pellegrini等人，2007年)和胡(Zupan等人，2005年)蛋白质。

针对PACAP、nNOS和胆碱乙酰转移酶（ChAT）的抗体的特征、特异性和可靠性及其在斑马鱼ENS形态学研究中的应用已经通过Olsson等人（2008）根据供应商的指南，这些初级抗血清的预吸收导致在所有情况下完全消除免疫染色。脑冷冻切片的免疫染色显示IR的分布与先前检测到的PACAP相似(Mathieu等人，2004年)，中国税务局(克莱门特等人，2004年)和nNOS(Holmqvist等人，2000年)斑马鱼大脑中。

抗5HT抗体的特异性在所有脊椎动物物种中都是相似的，因为神经递质5HT在所有脊椎动物物种中是相同的(Olsson等人，2008年). 此外，这种抗体已经被用于检测突变型和野生型斑马鱼胚胎ENS中的血清能神经元(Pietsch等人，2006年). 我们用20μg/ml 5HT/BSA偶联物（Immunostar，Hudson，WI）预孵育抗5HT抗体，完全阻断免疫染色。此外，用这种抗5HT抗体在斑马鱼脑冷冻切片中观察到的IR与斑马鱼大脑中以前的染色相似(Kaslin和Panula，2001年).

针对TH的单克隆抗体可识别从PC12细胞纯化的TH调节性N末端外侧的一个表位，该表位与斑马鱼TH具有70%的同源性。该抗体已用于检测斑马鱼中枢和外周神经系统中的儿茶酚胺能神经元(Chen等人，2009年). 此外，斑马鱼大脑免疫印迹中该抗体标记的条带大小（~62 kD）与虹鳟免疫印迹相似(Linard等人，1998年). 大脑冰冻切片的染色显示出与先前观察结果相似的IR模式(Kaslin和Panula，2001年). 该免疫原尚未上市，无法进行预吸收实验。

根据供应商的说法，针对合成VIP的抗VIP抗体通过碳二亚胺接头与牛甲状腺球蛋白偶联，在斑马鱼中检测到VIP。该抗体已被用于揭示斑马鱼鱼鳔壁中的肽能神经元(Finney等人，2006年). VIP和PACAP一样，在脊椎动物中高度保守(Olsson和Holmgren，2001年). 此外，VIP IR在脑冷冻切片中的分布与之前斑马鱼研究中观察到的类似(Mathieu等人，2001年). 研究还表明，用20μg/ml合成VIP（Sigma-Aldrich）预吸收抗血清可以消除IR，而用20μg/ml牛甲状腺球蛋白（英国牛津AbD Serotec）预吸收对免疫染色没有影响。

抗CR抗体是针对重组大鼠CR的，显示出与斑马鱼CR 71%的同源性。该抗体以前曾被用于标记斑马鱼视网膜中的无分泌细胞(Yeo等人，2009年). 抗CB抗体也曾用于斑马鱼和其他鱼类物种的早期研究，以标记中枢神经系统（CNS；Zupan等人，2005年;Ikenaga等人，2006年;Gra公司$\stackrel{<trans\; data-src="̂">̂</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="n">n个</trans>}}$a等人，2008年)和ENS(奥尔森，2008)尽管目前斑马鱼只有预测的蛋白质序列可用（XP 001341604；网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 脑组织中两种CaBP的免疫染色与之前对斑马鱼进行的研究相似(Zupan等人，2005年;Castro等人，2006年). 当用5μg/ml重组大鼠CB（瑞士贝林佐纳SWant）预吸收一级抗体时，所有CB IR均被废除。当CR抗体与重组大鼠CB预孵育时，未观察到对免疫染色的影响。此外，用免疫印迹法检测两种抗体的特异性。斑马鱼大脑的匀浆根据Levanti等人（2008年）简单地说，将脑组织浸泡在冰镇裂解缓冲液中30分钟，T-PER组织蛋白提取试剂（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA）含有Halt蛋白酶抑制剂一次性鸡尾酒（Thermo-Fisher科学公司）和3%乙二胺四乙酸，在均质之前，在Precellys 24均质机中使用机械研磨和小陶瓷珠（法国蒙蒂尼Bertin Technologies）。在4°C下以14000 rpm的转速离心匀浆60分钟，上清液在−20°C下保存，直到再次使用。接下来，将上清液解冻，在Lane Marker Reducing Sample Buffer（Thermo Fisher Scientific Inc.）中稀释，并在95°C下加热5分钟。然后在梯度凝胶（8–16%Precise Protein gels；Thermo Fisher Scientific Inc.）上通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对样品进行分析，并转移到硝化纤维素膜（Hybond ECL；GE Healthcare，Munich，Germany）上。将这些膜浸入封闭缓冲液Super-Block T20（Thermo Fisher Scientific Inc.）中，并在室温下用稀释在Super-Bock T20中的一级抗体连续培养过夜。在含有0.05%吐温20的PBS中洗涤后，在室温下用辣根过氧化物酶（HRP）结合二级抗体孵育2小时(表1)在PBS中稀释。使用SuperSignal West Pico试剂盒（Thermo Fisher Scientific Inc.）对绑定进行可视化。使用凝胶文件系统G:Box（Syngene Europe，Cambridge，United Kingdom）拍摄图像，并使用GeneTools分析软件（Syngen Europe）进行分析。在斑马鱼大脑的免疫印迹中，观察到大小合适的条带（即CR约28 kD，CB约26 kD）(图1).

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图1

斑马鱼CaBP的蛋白质印迹分析。通道A：生物钛化蛋白梯；B道：用抗CR抗体免疫染色的脑匀浆印迹，显示±28kD的条带；C道：用抗CB抗体免疫染色的脑匀浆印迹显示约26 kD的条带。

结果

斑马鱼胚胎

同时检测Hu和α-tub显示，胚胎肠中肠神经元的数量和密度从72 hpf增加到120 hpf。在每个胚胎期，肠的每个区域都存在肠神经元，约50%位于MI。对三个胚胎期斑马鱼ENS中神经化学标记物的分布进行检查，结果显示神经元胞体中只有nNOS、5HT、CR和CB IR。胚胎发育期间，这四种神经化学标记物在肠神经元中的比例分布的定量数据见图2和​和3。三肠神经元胞体的平均大小（72 hpf:24±8μm²; 96马力：24±8微米²; 120马力：22±8微米²)在测量的不同时间点之间、具有不同神经化学物质含量的神经元之间或肠道区域之间没有显著变化。

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图2

在孵化（72 hpf）和开始口服喂食（120 hpf）期间，斑马鱼ENS中CR、CB、nNOS和5HT的平均比例分布*P（P）<0.05。

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图3

表达nNOS的肠神经元的平均比例分布(一)，5HT(b条)、CR(c（c）)，或CB(d日)斑马鱼肠道近端（PI）、中部（MI）和远端（DI）部分在胚胎发育期间孵化72 hpf到开始口服（120 hpf）。

主要在肠神经元中表达的神经化学标志物是nNOS(图4a–c). 超过40%的肠神经元在72 hpf时表达nNOS IR，并且这一比例在胚胎的进一步发育过程中保持不变。PI中氮能神经元的比例明显低于其他两个肠道区域（合并值PI 36%±7%；MI 44%±9%；DI 48%±11%）。

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图4

斑马鱼胚胎肠道的共焦图像。a–c：用针对Hu（a；绿色）和nNOS（b；品红色）的抗体进行双重免疫标记，显示96 hpf时MI中的氮能神经元（c；合并）。d–f日：用针对Hu（d；绿色）和5HT（e；品红色）的抗体进行双重免疫染色，显示96 hpf时DI中的5-羟色胺能神经元（f；合并）。箭头，5HT-免疫活性肠内分泌细胞。g–i类：在96 hpf MI中Hu（g；绿色）免疫染色的肠神经元胞体（i；融合）中观察到CR IR（h；品红色）。O→A：从口腔到肠道的反口侧。比例尺=50μm。

另外三个标记物，5HT、CB和CR，在72 hpf时也在肠神经元中表达，其比例在后期显著增加。5HT IR主要存在于神经元细胞体中。MI中5HT-免疫活性神经元数量最多，PI中5HT表达神经元比例最高。在检测的每个胚胎期，5HT阳性神经元的百分比从PI到DI显著降低（72 hpf:PI 20%±10%；MI 10%±3%；DI 6%±6%；96 hpf:PI27%±7%；MI 20%±5%；DI 14%±3%；120 hpf:P131%±15%；MI 28%±9%；DI 23%±8%）。我们还观察到肠壁中有5HT阳性Hu阴性细胞，如前所述，这些细胞是5HT产生的肠内分泌细胞(Olsson等人，2008年;图4d–f).

两种CaBP在肠段中的比例表达在所检测的每个胚胎阶段都是相似的。心肌梗死各胚胎期CR-表达神经元比例最高（72 hpf:10%±3%；96 hpf:20%±5%；120 hpf:24%±8%；图4g–i). 72 hpf时，PI和DI含有极低百分比的CR阳性神经元（值：PI：4%±5%；DI：3%±4%）。在一些鱼类中，PI和DI中甚至没有CR阳性神经元。96 hpf时，PI显著增加（13%±5%），而DI中CR-表达神经元（2%±3%）仍然很少或完全缺失。尽管整个肠道中CR-表达神经元的比例增加了120 hpf，但与其他肠道区域相比，DI中这些神经元的比例显著降低（PI:20%±8%；MI:24%±8%；DI:10%±9%）。CB在ENS中的表达模式与CR相似；也就是说，MI中CB-阳性神经元的百分比最高（72 hpf:8%±5%；96 hpf:20%±6%；120 hpf:27%±5%），DI中的比例明显较低（72 hpf：3%±4%；96 hpf：3%±3%；120 hpf：12%±5%；图5a–c).

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图5

斑马鱼胚胎肠道的共焦图像。a–c：用针对Hu（a；绿色）和CB（b；品红色）的抗体进行双重免疫标记，显示96 hpf时PI中CB-表达神经元（c；合并）。d–f日：用针对Hu（d；绿色）和VIP（e；品红色）的抗体进行双重免疫标记，显示96 hpf时MI神经纤维中的VIP IR（f；合并）。g–i类：Hu（g；绿色）和PACAP（h；品红色）的双重免疫染色显示120hpf时心肌梗死中PACAP-免疫活性神经纤维（i；融合）。箭头，PACAP-表达上皮细胞。O→A：从口腔到肠道的反口侧。比例尺=50μm。

在72 hpf时，在ENS中也检测到VIP和PACAP IR。然而，在神经元细胞体中没有观察到这两种标志物的免疫染色；相反，IR出现在沿神经纤维的静脉曲张样结构中(图5d–i). 肠中检测到VIP或PACAP表达的细胞体，但这些细胞不表达Hu IR，并且与Hu阳性神经元不位于同一焦平面。这些细胞可能是肠内分泌细胞(Olsson等人，2008年). 尽管在检查的每个胚胎阶段都在中枢神经系统中观察到ChAT IR，但在肠道中没有观察到表达ChAT的神经元细胞体或纤维。此外，在CNS和ENS的三个胚胎阶段中，没有检测到TH-IR。

成年斑马鱼

同时检测成年斑马鱼肠道中Hu和α-tub的结果表明，从PI到DI，肠道神经元密度显著增加(图6,​，7a）。第7页). 此外，与胚胎肠一样，神经元细胞体中未检测到VIP和PACAP IR，而IR存在于肠神经纤维沿线的静脉曲张样结构和一些上皮性肠内分泌细胞中(图7b、c). 此外，在肌间丛神经纤维中观察到TH IR。在PI中，肠壁浆膜侧发现Hu阳性TH表达细胞(图7d). 在神经纤维和神经元细胞体中发现其他神经化学标记物ChAT、CB、CR、5HT和nNOS的免疫染色(图7e–i). 这些标记在成年斑马鱼ENS中的比例分布的定量数据见表2并在中描述图8成人肠中神经元细胞体的平均大小（85±30μm²)表达ChAT、CB、CR或nNOS的神经元之间没有显著变化。5HT阳性神经元胞体的平均大小（101±21μm²)明显大于表达其他神经化学标记物的神经元胞体的平均大小。此外，在DI中，5HT阳性躯体的平均大小（76±17μm²)显著低于PI（112±32μm²)或MI（114±29μm²). 表达ChAT、CB、CR或nNOS的神经元胞体的平均大小在三个肠道区域之间未观察到显著变化。

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图6

计算每平方毫米成年斑马鱼肠道不同区域的神经元数量。图中显示Hu-免疫活性神经元的数量显著增加(**P（P）<0.0001）朝向成人肠道的远端。

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图7

合并成年斑马鱼肠道的共焦图像。一：α-管（品红色）和胡（绿色）双重免疫标记显示ENS。b、 c：VIP或PACAP（洋红色）和Hu（绿色）双重标记，显示成年肠道PI中VIP或帕卡普免疫活性的静脉曲张神经纤维。d日：对成人肠道PI中的TH（绿色）和Hu（洋红色）进行双重免疫染色，显示位于肠道浆膜侧的TH表达神经元。插入：共焦图像在XY平面和XZ平面的投影，显示肌间和浆膜平面都存在Hu-IR神经元，而TH-IR神经元局限于浆膜平面。M→S：从肠壁的粘膜侧到浆膜侧。e（电子）：5HT（洋红色）和Hu（绿色）双重免疫染色。（f）：ChAT（品红色）和Hu（绿色）的双重免疫标记。克：CR（洋红色）和Hu（绿色）双重免疫染色。小时：CB（洋红色）和Hu（绿色）双重免疫染色。我：成年斑马鱼肠道中nNOS（品红色）和Hu（绿色）的双重免疫标记。O→A：从口腔到肠道的反口侧。比例尺=50μm。

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图8

表达CR、CB、ChAT、nNOS或5HT的肠神经元在成人肠道近端（PI）、中部（MI）和远端（DI）的平均比例分布。除5HT显著降低外，大多数标记物在三个肠道部位的比例分布保持不变(*P（P）<0.05）。

表2

神经化学标记物在斑马鱼Hu-Labeled肌间神经元中的比例表达

	PI（%）	MI（%）	DI（%）	平均值（%）
5HT（高温）	25 ± 8	18 ± 4	11 ± 3	18
无操作系统	24 ± 2	24 ± 3	23 ± 3	23
中国税务局	39 ± 6	39 ± 6	40 ± 7	39
立方英尺	41 ± 7	46 ± 5	40 ± 6	43
铬	44 ± 4	49 ± 5	42 ± 9	45

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5HT IR不仅在神经元细胞体和神经纤维中观察到，而且在一些上皮细胞中也观察到(图7e). 根据轴突小丘和轴突的方向，也清楚地表明，大多数5HT阳性神经元（52%±12%）将轴突向口腔方向发送，而13%±2%主要向流产方向投射。正如在胚胎肠中观察到的那样，从肠的近端（25%±8%）到远端（11%±3%），5-羟色胺能神经元的比例显著降低。

与胚胎肠相反，成年肠中可见胆碱能神经元。在神经元细胞体和神经纤维中发现ChAT IR(图7f)和ChAT阳性神经元在三个肠道区域平均分布（胆碱能肠道神经元的平均百分比为39%±6%）。

与胚胎斑马鱼的ENS相比，成年肠道中CB（43%±6%）和CR（45%±7%）的表达模式相似(图7g，h). 在三个肠道区域之间的比例分布没有观察到显著差异。在MI和DI中，也发现一些CB和CR表达的上皮细胞。

与胚胎肠相比，氮能神经元的百分比下降至23%±3%(图7i). 与胚胎肠相比，成年斑马鱼肠的每个区域都均匀分布着氮能神经元。

双重免疫标记显示肠神经元中神经化学标记物的共表达。这些染色的定量结果见表3免疫染色如图9和​和10。10。没有发现任何共存的区域差异。最显著的结果是CB和CR出现在相同的神经元中(图9a–c; 即CB和CR的共定位为100%），5HT未与任何其他神经化学标记物共存(图9d–i). 此外，84%±11%的CB-阳性神经元和85%±11%CR-阳性神经元显示ChAT-IR，相反，93%±1%的胆碱能神经元似乎表达CB-IR，而96%±5%表达CR-IR(图10a–c). 此外，37%±15%的CB-表达神经元和39%±15%CR-表达神经元对nNOS进行了免疫染色(图10d–f). 少数胆碱能神经元（7%±4%）表达nNOS IR，而11%±1%的氮能神经元表达ChAT IR(图10g–i). 根据这些数据，确定了五个肠神经元亚群：表达1）CB、CR、ChAT和nNOS的神经元（占所有肠神经元的±3%）；2） CB、CR和nNOS（所有肠神经元的±15%）；3） CB、CR和ChAT（所有肠神经元的±35%）；4） 仅ChAT（所有肠神经元的±5%）；或5）只有5HT（所有肠神经元的±18%）。

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图9

共焦图像显示成年斑马鱼ENS中神经化学标记的共存。a–c：CR（a；绿色）和CB（b；品红色）在相同的神经元（c；合并）中表达。d–f日：未检测到CR（d；绿色）和5HT（e；品红色）的共定位（f；合并）。g–i：未观察到5HT（g；绿色）和ChAT（h；品红色）的共表达（i；合并）。O→A：从肠道的口侧到流产侧。比例尺=50μm。

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图10

显示成年斑马鱼ENS中神经化学标记物共同表达的共焦图像。a–c：CB（a；绿色）和ChAT（b，品红色；c，合并）的着色。箭头，神经元只表达CB。d–f日：CR（d；绿色）和nNOS（e，洋红；f，合并）的着色。g–i类：nNOS（g；绿色）和ChAT（h，洋红；i，合并）的着色。O→A：从口腔到肠道的反口侧。比例尺=50μm。

表3

斑马鱼成年肠道神经元中神经化学标记物的比例共表达

使用Colocalizing	神经元表达
	CB（%）	CR（%）	现金流量（%）	nNOS（%）	5HT（%）
立方英尺	—	100	93 ± 2	100	0
铬	100	—	94 ± 5	100	0
中国税务局	86 ± 9	85 ± 11	—	11 ± 1	0
无操作系统	37 ± 14	39 ± 14	7 ± 4	—	0
5HT（高温）	0	0	0	0	—

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此外，双重免疫染色显示VIP和PACAP在肠神经纤维中完全共定位(图11a–c). 此外，几乎所有的nNOS-免疫活性神经纤维都同时表达VIP和PACAP-IR(图11d–f). 这一结果表明，上述氮能神经元亚群也同时存在VIP和PACAP。然而，并非所有VIP和PACAP免疫活性神经纤维都同时表达nNOS IR。

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图11

a–f：共聚焦图像显示肠神经纤维中VIP（a；绿色）和PACAP（b；品红色）以及VIP（d；绿色）和nNOS（e；品红色）的共表达（c，f：合并）。O→A：从口腔到肠道的反口侧。g–j：冷冻切片的合并图像——成年斑马鱼的MI。g： 用针对nNOS（品红）和Hu（绿色）的抗体进行双重免疫标记，显示肌层（M）中的氮能神经纤维。h： 用针对5HT（品红色）和Hu（绿色）的抗体进行双重免疫染色，显示肌层和固有层（L）中的5-羟色胺能神经纤维。i： 用针对VIP（洋红）和Hu（绿色）的抗体进行双重免疫标记，显示肌层和固有层中VIP表达的神经纤维。j：对Hu（绿）和CR（洋红，固有层内的免疫反应性神经纤维；箭头，免疫反应性上皮细胞。比例尺=50μm。

最后，冰冻切片的免疫染色清楚地表明，在每个肠段中，表达nNOS IR的神经纤维主要存在于肌层中(图11g). 在固有层的血管附近观察到氮能神经纤维。肌层中检测到血清素能神经纤维，但固有层中也有丰富的血清素神经纤维(图11h). 表达VIP的神经纤维(图11i)、PACAP、CB或CR(图11j)在固有层和肌层中观察到。然而，在PI的固有层中，与其他肠道区域一样，CaBP表达纤维数量较少。这些结果表明，在斑马鱼肠道中，氮能神经元主要支配肠平滑肌，而5-羟色胺能和胆碱能非氮能神经元则支配肠平滑肌、固有层和上皮。

讨论

本研究试图确定斑马鱼发育早期和成年期表达特定神经化学标记物的肠神经元的比例分布。在胚胎肠中，除ChAT和TH外，我们研究的所有标记物均在72 hpf中表达。神经元细胞体中仅检测到nNOS、5HT、CB和CR，从而可以确定这些标记物的比例分布，但VIP和PACAP仅在神经纤维中发现。观察到高百分比的氮能神经元，它们的数量在胚胎发育过程中保持不变。相比之下，其他三个标记的比例较低，在后期增加，并且具有区域差异的特点。在成人肠道中，所有神经化学标记物均表达，但神经元细胞体和神经纤维中仅存在ChAT、CB、CR、nNOS和5HT，而VIP、PACAP和TH仅在神经纤维上观察到。成人肠道中大部分肠神经元显示CaBP IR，但5HT是唯一在三个肠道区域显示显著分布差异的标记。Colocalization研究表明，CB和CR均在同一神经元中表达，5HT未与任何其他标记物共存。至少有五个神经元亚群具有特征：CB⁺/CR公司⁺/中国税务局⁺/无操作系统⁺-，CB⁺/CR公司⁺/无操作系统⁺/中国税务局⁻-，立方英尺⁺/CR公司⁺/ChAT公司⁺/无操作系统⁻-，中国税务局⁺/立方英尺⁻/CR公司⁻/无操作系统⁻-和5HT⁺-表达神经元。神经纤维免疫染色分析显示，氮能神经元也同时表达VIP和PACAP。此外，氮能神经元主要支配肠平滑肌，而5-羟色胺能和胆碱能非氮能神经元则支配肠平滑肌、固有层和上皮。

虽然我们在胚胎和成人肠的肠神经纤维中检测到VIP和PACAP，但在神经元细胞体中未观察到IR。在哺乳动物中也有类似的观察结果。为了克服哺乳动物胃肠道中缺乏VIP和PACAP IR的问题，在固定之前，在含有秋水仙素的培养基中对胃肠道整体支架进行体外培养，以增加神经细胞体中的IR(Furness等人，1984年). 众所周知，秋水仙碱会导致细胞微管紊乱，从而抑制轴突运输并在神经元细胞体内积聚轴突运输物质(CeccatelLi等人，1991年;Boyer等人，1994年). 我们试图在斑马鱼中使用这种方法，但它没有产生神经元细胞体的免疫染色。然而，以前的斑马鱼研究表明，VIP和PACAP在肠道神经元中共存，正如在其他非哺乳动物中观察到的那样(奥尔森和霍姆格伦，1994年,2001;Olsson等人，2008年). 本研究清楚地证明VIP和PACAP在成年斑马鱼的ENS中共存。一些VIP和PACAP表达的神经纤维被认为是肠道固有的(Olsson等人，2008年). 此外，斑马鱼迷走神经也可能是肠道中VIP和PACAP阳性神经纤维的来源。对于其他硬骨鱼类，已经报道了表达VIP和PACAP的迷走神经细胞(奥尔森和霍姆格伦，1994年). 虽然我们在斑马鱼胚胎72 hpf时观察到VIP和PACAP免疫活性肠神经纤维，但含有PACAP的肠神经纤维似乎已经在48 hpf时出现在PI和MI中(Holmberg等人，2004年). 通过使用数字运动分析，PACAP对顺行传播波的波频率的抑制作用已在5dpf时得到证实(Holmberg等人，2004年). 这些数据表明，VIP/PACAP抑制途径在喂食开始之前已经形成。先前对鲈鱼的研究也表明VIP可能在胚胎发育期间肠上皮的生理成熟中发挥作用(Pederzoli等人，2004年).

与研究一致奥尔森及其同事（2008）尽管斑马鱼胚胎的药理学研究明确表明，乙酰胆碱释放可能从4dpf以后调节肠道运动，但我们在胚胎肠道中没有发现任何ChAT IR(Holmberg等人，2004年,2007). 成年斑马鱼肠道胆碱能神经元群的比例大小（±39%）与从哺乳动物获得的数据无关。对于小鼠回肠，发现60-70%的肌间神经元具有胆碱能(Sang and Young，1998年;Qu等人，2008年)然而，在人类胃肠道中，胆碱能神经元占所有固有神经元的50-70%(Anlauf等人，2003年).

与之前的研究一致，我们没有在胚胎肠道中观察到TH IR(郭等，1999;Olsson等人，2008年). 然而，与这些其他研究一样，我们在肌间神经丛中观察到TH免疫反应神经纤维的存在，在成年肠浆膜侧观察到TH-IR迷走神经神经元的存在。假设TH阳性神经纤维来源于外源性，由TH表达的迷走神经细胞产生。然而，不能排除某些神经纤维是肠道固有的。几种哺乳动物的粘膜下神经丛和肌间神经丛中都有TH表达神经元(Schemann等人，1995年;Sann等人，1998年;Anlauf等人，2003年;Chiocchetti等人，2004年;Li等人，2004年,2006;Chevalier等人，2008年;Qu等人，2008年;Tian等人，2008年;Mongardi Fantaguzzi等人，2009年). 它们在ENS围产期发育较晚，其确切功能尚不清楚。

表达nNOS IR的斑马鱼肠道神经元首先出现在40至55 hpf的DI和MI中，1天后也出现在胚胎斑马鱼肠的PI中(Holmqvist等人，2004年;Holmberg等人，2006年). 与之前的研究一致，我们发现氮能神经元构成了胚胎肠中的主要神经元亚群。在我们检测的发育时间点（72–120 hpf）内，氮能神经元的百分比保持不变，肠的近端包含的氮能神经元比例明显低于肠的其他两个区域。尽管在这一早期阶段存在肠内氮能神经元，但据报道，仅在外源性喂养开始之前或开始时才存在NO-介导的抑制性张力(Holmberg等人，2006年). 这与其他脊椎动物物种的建议类似(Timmermans等人，1994年;Van Ginneken等人，1998年,2001;Bagyanszki等人，2000年;Belai和Burnstock，2000年;Bayram等人，2002年;Pederzoli等人，2007年). 此外，还提出了nNOS在斑马鱼胚胎肠道的发育和分化中的额外作用(Holmqvist等人，2004年). 在成年斑马鱼肠道中，氮能神经元的百分比（±23%）与小鼠肌间神经丛中获得的比例值（±29%；Qu等人，2008年)和大鼠（±27%；Belai等人，1995年)回肠。

体内5HT的主要来源是肠道，在肠嗜铬细胞和固有神经元中表达。5HT作为肠神经递质和粘膜信号分子发挥作用。它参与启动运动和分泌反射。对于胚胎斑马鱼，我们观察到，在开始口服之前，肠道中已经存在72 hpf时表达5HT的肠神经元，正如之前的报告所述Olden等人（2008）5HT阳性神经元的百分比从PI到DI显著降低。在120 hpf条件下获得的比例值与Olsson等人（2008）以前对豚鼠的研究表明，在开始口服营养之前，肠道中的5HT信号是出生后运动模式发展所必需的(卞等人，2007). 对于成年斑马鱼肠，我们观察到5HT表达神经元的类似分布模式，尽管5HT表示神经元的百分比低于胚胎肠。与哺乳动物肠道相比，表达5HT的肠内分泌细胞稀疏分布在斑马鱼肠道中，这与之前的研究一致(Olsson等人，2008年). 这表明肠道神经元是斑马鱼肠道5HT的主要来源。

CB和CR是CaBP的EF-hand（E-helix-loop-F-helix）家族的成员，也包括小白蛋白、钙调素和S100蛋白，广泛分布于中枢和外周神经系统(Christakos等人，1989年). 虽然它们在神经元中的假定作用尚待阐明，但众所周知，它们参与了细胞功能的各个方面的调节(格拉巴雷克，2006年). 一份报告强调了CB作为神经保护蛋白的作用(Iacopino等人，1994年). 在哺乳动物肠道中，CR和CB在几个神经元亚群中表达。在小鼠和豚鼠回肠的肌间神经丛中，CB仅存在于固有初级传入或感觉神经元（IPAN；Timmermans等人，1997年;Furness，2000年,2006;布鲁克斯，2001;Qu等人，2008年;Mongardi Fantaguzzi等人，2009年). 在绵羊回肠中，CB也在其他神经元类型中表达(Chiocchetti等人，2004年)然而，在兔回肠中，CB主要表达于胆碱能中间神经元(Dénes和Gábriel，2004年). 在猪小肠中，CB与5HT在中间神经元和内脏阜神经元中共存(Timmermans等人，1997年). 人类小肠中绝大多数IPAN表达CR，少数表达CB(Brehmer等人，2004年a). 在大鼠小肠中，IPAN表达CR，但CB在其他神经元类型中表达(Sayegh和Ritter，2003年). 在小鼠中，在IPAN中也发现CR(Qu等人，2008年). 在豚鼠回肠中，CR在中间神经元、分泌型神经元和兴奋性运动神经元中表达，而在猪小肠中，CR在中间神经元和抑制性运动神经元中表达(Timmermans等人，1997年;Furness，2000年,2006;布鲁克斯，2001). 我们的结果显示，CB和CR在胚胎和成年斑马鱼肠道中的分布模式相似。据报道，在金鱼的迷走神经叶中，CB和CR也有类似的神经元共定位(Ikenaga等人，2006年). 据报道，小鼠肠道神经元中CB和CR部分共表达(Qu等人，2008年)和绵羊(Chiocchetti等人，2004年)回肠和大鼠小肠(Sayegh和Ritter，2003年). 斑马鱼肠道神经元显示CR或CB IR的百分比与哺乳动物获得的这两种CaBP的比例值无关(Chiocchetti等人，2004年;Qu等人，2008年).

在哺乳动物中，神经化学标记物的共表达被用来确定不同的神经元类别，这些神经元在功能上分为运动神经元（兴奋性或抑制性）、感觉神经元、中间神经元、分泌运动神经元、血管扩张神经元和内脏嗅神经元(Timmermans等人，1997年,2001;Furness，2000年,2006;布鲁克斯，2001;Qu等人，2008年). 对成年斑马鱼肠道中的五种神经化学物质CB、CR、ChAT、5HT和nNOS进行的定殖研究，使我们能够区分五种神经元亚群，涵盖大约75%的肠神经元。一个亚群包含仅表达5HT的神经元，并且主要通过口腔投射。血清素能神经元通常存在于鱼肠中(沃森，1979年;古德里奇等人，1980年;安德森，1983年;Jensen和Holmgren，1985年;安德森和坎贝尔，1988年;Kiliaan等人，1989年;Karila等人，1998年;Olden等人，2008年;Olsson等人，2008年)并被认为在调节肠道运动和上皮功能中发挥作用(Jensen和Holmgren，1985年;Kiliaan等人，1989年;Karila等人，1998年). 在哺乳动物中，5-羟色胺能神经元被指定为降中间神经元(Timmermans等人，1997年,2001;Furness，2000年,2006;布鲁克斯，2001年;Qu等人，2008年). 对于鱼类，有人认为口服5-羟色胺能神经元是上行兴奋性神经元，肛门投射神经元是下行中间神经元(Karila等人，1998年).

我们对一小部分仅显示ChAT IR的内在神经元的鉴定需要进一步研究，以便将特定功能归于该神经元亚群。其余三个亚群显示CB和CR IR。最小的亚群也表达ChAT和nNOS。在哺乳动物中，ChAT和nNOS在少数下降中间神经元中同时表达(Timmermans等人，1997年,2001;Furness，2000年,2006;波特等人，2002年;Brehmer等人，2004年b;Qu等人，2008年). 哺乳动物中的非肾上腺素能、非胆碱能氮能神经元被描述为抑制性运动神经元，也表达VIP(波特等人，1997年;Timmermans等人，1997年;Furness，2000年;布鲁克斯，2001;Jungbauer等人，2006年;Qu等人，2008年). 对于斑马鱼，我们观察到氮能神经纤维主要存在于肌层中，并与VIP和PACAP共存。在这种情况下，我们认为斑马鱼肠道中的CB/CR/nNOS表达神经元调节肠道运动。在一些固有感觉神经元的小鼠肠道中观察到CB和CR与ChAT在哺乳动物中的共表达(Qu等人，2008年)，在绵羊回肠的一小部分形状不规则的肠神经元中(Chiocchetti等人，2004年)和豚鼠胃体的推测运动神经元(Reiche等人，2001年). 在其他哺乳动物的胆碱能神经元中未观察到CaBP的共表达。因此，需要进一步的神经化学特征来确定斑马鱼CB/CR/ChAT编码类型对应的神经元类型。

总之，这是首次对斑马鱼进行研究，以显示胚胎发育期间ENS中神经化学标记物的比例表达以及成年肠道肠神经元中神经化学标志物的共定位。从胚胎发育的早期阶段开始，我们研究的几乎所有神经化学标记物都得到了表达。在胚胎发育期间，肠神经元的主要比例为氮能，我们在本研究中检测的神经化学标记物的比例分布在发育中的肠中显示出区域差异。神经化学标记物在成人肠道中的共表达揭示了一个5-羟色胺能、一个氮能和两个胆碱能神经元亚群，以及一个同时表达ChAT和nNOS的亚群。我们在斑马鱼肠道中发现的这些不同神经元亚群的神经元功能需要进一步研究。此处提供的信息也将作为未来研究的基础，以调查突变、有毒物质、药物和炎症对斑马鱼ENS发育和功能的影响。

致谢

引用的文献