抑制Hsp90下调突变表皮生长因子受体（EGFR）的表达并使EGFR突变肿瘤对紫杉醇敏感

摘要

介绍

在美国约10%的非小细胞肺癌（NSCLC）和多达25%的东亚人群肿瘤中发现了表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶结构域的激活突变(1–三). 在肺癌中观察到的最常见EGFR突变是外显子19的小的框内缺失和外显子21的L858R点突变。这些突变在成纤维细胞和肺上皮细胞中诱导致癌转化在体外以及通过EGFR的组成性激活在转基因小鼠中(4–6). 外显子19和21的突变也使人对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）敏感，包括吉非替尼和埃洛替尼(4). 虽然最初对许多非小细胞肺癌患者有效，但对吉非替尼和厄洛替尼的耐药性始终在发展(7). 获得性抗性的一个机制是在790位选择第二个苏氨酸到蛋氨酸的替代物（T790M；参考。8). EGFR中的第二个位点突变，类似于T315I“守门人”突变，导致bcr-abl对伊马替尼产生耐药性(9)预测可阻断厄洛替尼和吉非替尼与EGFR-ATP结合域的结合。

Hsp90是一种蛋白质伴侣，在蛋白质折叠、稳定和成熟中发挥作用。Hsp90客户包括激酶、类固醇受体和转录因子的子集，其中许多在人类癌症中失调(10–15). 某些突变的癌蛋白，包括bcr-abl和V600E BRAF，是Hsp90的客户，而它们的野生型对应物要么不依赖于Hsp90，要么仅弱依赖于Hps90(16–18). 假设这些“功能获得”突变在缺乏Hsp90的情况下无法正确折叠。因此，这些癌蛋白获得了诱导转化的能力，但代价是对Hsp90伴侣功能的更大依赖性。

我们对Hsp90生物学的理解在很大程度上源于对格尔德霉素和神经根醇的研究，这是一种天然产物，在蛋白质的N末端结构域中结合一个调节口袋，在物种间是保守的(19–21). 口袋的生理配体是ATP和ADP。格尔德霉素、根霉素或其类似物的结合模拟ADP的作用，导致需要Hsp90才能成熟或稳定的蛋白质降解(22,23). 事实证明，格达那霉素对人类使用毒性过大，但目前正在对几种衍生物进行测试，包括17-烯丙基氨基-17-脱甲氧基格达那霉素（17-AAG(24).

几个小组的研究表明，与HER2相比，野生型EGFR对Hsp90抑制剂的降解相对不敏感(25,26). 据报道，尽管成熟和新生形式的HER2都被格尔德霉素降解，但只有新生的EGFR是Hsp90依赖性的(26). 最近，我们和其他人已经表明，外显子19和21 EGFR激酶结构域突变体被Hsp90抑制剂降解(27,28). 这些数据表明，Hsp90对突变型EGFR依赖性肺癌的发展是允许的，因此，对于肿瘤表达EGFR激活突变的患者，包括对EGFR TKI产生临床耐药性的患者，Hsp90可能是一种有效的临床策略。

我们现在表明，17-AAG（Hsp90抑制剂，在第1和第2阶段临床试验中测试）可以在无毒剂量下诱导异种移植瘤中突变EGFR的降解，但不能诱导野生型EGFR的退化。17-AAG对突变型EGFR表达的最大影响在治疗后6小时观察到，48小时恢复到基线水平。17-AGA在延缓异种移植瘤生长方面有效，但在吉非替尼敏感、EGFR突变驱动的模型中，其效果显著低于吉非替尼布。这可能部分是由于毒性限制，无法用17-AAG持续抑制EGFR信号。虽然在单独使用17-AAG的EGFR突变模型中仅观察到适度的抗肿瘤活性，但可以在没有加性毒性证据的情况下给予全剂量17-AEG和紫杉醇，并且联合用药比单独使用任何一种药物都有效。这些数据表明，Hsp90抑制剂与细胞毒性药物联合使用对TKI耐药EGFR突变的肺腺癌患者最有效。

材料和方法

结果

17-AAG导致EGFR突变型下调

我们和其他人之前已经证明Hsp90抑制剂下调EGFR突变形式的表达(27,28). 为了直接比较Hsp90抑制对野生型和突变型EGFR表达的影响，我们使用稳定表达野生型EGFR、L858R突变型EGFR或L747_E749外显子19缺失的EGFR的NIH/3T3细胞。这些研究选择了一个等基因模型，因为DT-二氨基葡萄糖酶和Pgp表达的差异导致不同癌细胞株对17-AAG诱导的降解的敏感性不同(29,30). 如所示图1与野生型EGFR相比，L858R和外显子19缺失EGFR突变体对17-AAG诱导的降解更敏感。EGFR突变形式的下调需要较低的药物浓度，并且发生在明显较早的时间点（3-6小时与12-24小时）。与EGFR突变形式相比，Hsp90客户Raf-1对17-AAG诱导的降解也明显不敏感。在野生型和突变型EGFR-转染NIH/3T3细胞中，未观察到Raf-1或其他Hsp90客户的敏感性差异(图1A类和数据未显示）。

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图1

突变型EGFR比野生型EGFR对17-AAG诱导的降解更敏感。A类，将野生型和突变型EGFR（L858R和ΔL747_E749，A750P）稳定转染NIH-3T3细胞。EGFR、Raf-1和p85磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的免疫印迹显示，经0.1μmol/L 17-AAG处理后，突变型EGFR比野生型EGFR在更早的时间点降解。p85 PI3K是一种不受Hsp90抑制作用影响的蛋白质，作为负荷对照。B类EGFR、Raf-1和p85 PI3K的免疫印迹显示，与野生型EGFR相比，需要较低浓度的17-AAG来下调EGFR突变形式（L858R和ΔL747_E749，A750P）。17-AAG处理24小时后收集细胞。

同样，17-AAG治疗导致肺腺癌细胞株中EGFR突变形式的表达减少(图2和补充图S1). 除了L858R突变体（H3255中发现）和E746_A750缺失突变体（H1650中发现）外，对埃洛替尼耐药的L858R/T790M双突变体（1975年H15中发现）的表达也在17-AAG处理后下调。H1975细胞中L858R/T790M EGFR表达的缺失伴随着MAPK和Akt信号的抑制。这个在体外然而，肺癌细胞系对17-AAG的敏感性与EGFR突变状态无关。突变型和野生型EGFR的肺癌细胞株对含有IC的17-AAG敏感₅₀s范围为3至90 nmol/L。这些结果并不令人惊讶，因为许多蛋白质需要Hsp90，并且可以被17-AAG有效降解在体外例如，在24小时时，尽管17-AAG对Calu-1细胞（野生型EGFR）中EGFR表达的影响最小，但17-AAGT和磷酸化-MAPK的表达均被17-AEG下调。这些途径的抑制可能是通过上游受体酪氨酸激酶的降解介导的，这些激酶需要Hsp90才能稳定或激活，和/或通过下调Raf-1和Akt，这两者都是Hsp90的客户(13,31).

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图2

17-AAG诱导H1975肺腺癌细胞中L858R、T790M、EGFR突变体的降解。A类免疫印迹显示，17-AAG导致突变EGFR降解，并下调H1975细胞中磷酸-MAPK和磷酸-Akt的表达。B类在Calu-1细胞（野生型EGFR）中，17-AAG对EGFR表达的影响最小。然而，其他Hsp90客户端（如Raf-1）在Calu-1中降级。用17-AAG以所指示的剂量处理细胞24小时。C，EGFR突变体和EGFR野生型肺癌细胞株对17-AAG均敏感在体外72小时后用Alamar Blue检测细胞增殖，并以DMSO处理细胞的百分比表示。

17-AAG下调突变型EGFR的表达并抑制具有外显子19和21突变的肺腺癌异种移植物的生长

Hsp90抑制剂在组织培养的细胞模型中降解广泛的客户蛋白。然而，许多Hsp90客户在肿瘤中仅受到轻微影响或根本不受影响体内当17-AAG以其最大耐受剂量给药时。这可能是该药物的治疗指数和早期临床试验中在人体中观察到的相对窄的抗肿瘤活性谱的原因。到目前为止，被确定为对17-AAG诱导降解最敏感的蛋白质是HER2，17-AEG在HER2依赖性乳腺癌中显示出良好的活性(32). 相比之下，突变型BRAF对17-AAG介导的降解的敏感性低于HER2，并且体内BRAF依赖性黑色素瘤模型对17-AAG的敏感性也相应低于HER2依赖性乳腺肿瘤(补充图S2; 参考文献。17,33).

为了检测Hsp90抑制剂是否与突变型EGFR驱动的肿瘤的治疗相关，我们测定了17-AAG对肺癌异种移植物中突变型和野生型EGFR表达的影响体内在这些研究中使用了携带H1650（ΔE746_A750 EGFR）、H3255（L858R EGFR），H1975（L858 R，T790M EGFR）和A549（野生型EGFR）异种移植物的小鼠。小鼠最初通过静脉注射单次剂量为50至100 mg/kg的17-AAG进行治疗。对照组小鼠仅用EPL稀释液载体治疗。药物治疗后6h处死小鼠，比较治疗组和对照组小鼠EGFR的表达。在6小时时，17-AAG在H1650异种移植物中有效降低突变EGFR（ΔE746_A750）的表达>95%(图3). EGFR的下调伴随着MAPK信号的抑制和肿瘤中cyclin D1表达的降低。还观察到磷酸化Akt表达的部分下调。在携带H3255和H1975异种移植物的小鼠中观察到类似的效果(图3C和数据未显示）。

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图3

17-AAG在无毒剂量下可下调异种移植瘤中突变EGFR的表达。在剂量反应研究中，给小鼠服用50或75 mg/kg 17-AAG，6小时后处死。在时间过程实验中，用单剂量75 mg/kg的17-AAG处理小鼠，并在指定的时间点（0-48小时）处死。A类用17-AAG处理的H1650异种移植物中EGFR、Raf-1、Akt和cyclin D1的免疫印迹。17-AAG治疗导致H1650异种移植物中突变EGFR表达减少>95%，AKT和MAPK活性受到抑制。Raf-1对17-AAG处理的敏感性低于突变型EGFR，Akt的表达不受17-AEG的影响。B类定量17-AAG对H1650异种移植物中EGFR、Raf-1和Akt表达的影响。MAPK是一种不受Hsp90抑制作用影响的蛋白质，作为负荷控制。C，在H3255和H1975异种移植物中观察到类似的结果(C和数据未显示）。D类，17-AAG不诱导野生型EGFR降解，但下调A549异种移植物中HER2的表达。

为了评估17-AAG治疗对突变EGFR表达和下游信号的影响的动力学，用单剂量75 mg/kg的17-AEG治疗小鼠，并在治疗后1至48小时处死。17-AAG对EGFR表达的最大影响出现在3到12小时之间，EGFR在48小时后恢复到基线表达水平。然而，17-AGA对EGFR通路活性的影响，如磷酸化MAPK和Akt的表达以及cyclin D1的表达所评估的，在12小时后恢复不太持久(图3和数据未显示）。在这些模型中，Hsp90客户蛋白Raf-1和Akt对17-AAG诱导的降解明显不敏感。具体而言，在这些模型系统中，Raf-1仅被17-AAG部分降解（6小时时下调55%），Akt表达不受17-AAG处理的影响(图3). 最后，17-AAG治疗对A549异种移植物中野生型EGFR的表达没有影响。野生型EGFR对17-AAG的这种不敏感性并不是因为该化合物不能抑制Hsp90，因为17-AEG能有效降解A549异种移植物中的HER2。这些结果突出了敏感性的广泛差异体内各种Hsp90客户端。

由于17-AAG可以在无毒剂量下有效下调异种移植瘤中EGFR突变形式的表达，因此我们评估了17-AEG长期治疗H3255（L858R EGFR）、H1650（ΔE746_A750 EGFR）和H1975（L858 R、T790M EGFR）以及A549（野生型EGFR）异种移植小鼠的抗肿瘤作用(图4和补充图S3). H3255对TKI吉非替尼受体敏感（IC₅₀0.1 nmol/L），而H1650和H1975对吉非替尼（IC₅₀s>10μmol/L）。采用两种方案中的一种方案，给小鼠服用75 mg/kg的17-AAG：交替日（每周第1天、第3天和第5天）或每周连续三天（第1-3天）。这些方案是根据我们之前的研究选择的，研究表明17-AAG的更频繁给药方案具有不可接受的毒性(11,33). 使用H3255（L858R EGFR，吉非替尼敏感）异种移植物的小鼠也接受吉非替尼布150 mg/kg的剂量治疗（每周1-5天）。17-AAG治疗H3255小鼠导致明显的生长延迟(P（P）=0.01），但效果不如吉非替尼，吉非替尼可诱导显著的肿瘤消退(P（P）< 0.01). 17-AAG在H1650和H1975小鼠中活性较低，在EGFR野生型A549模型中无活性(图4和补充图S3). 由于H1650和H1975模型对吉非替尼具有耐药性，因此这些模型对17-AAG的相对耐药性可能归因于额外的基因改变，从而降低了它们对EGFR的依赖性。例如，H1650细胞不表达肿瘤抑制因子PTEN，这是一种与胶质母细胞瘤患者对EGFR-TKIs耐药性相关的基因改变(34,35).

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图4

17-AAG抑制EGFR突变型肺癌异种移植瘤的生长。采用两种方案中的一种方案对小鼠进行17-AAG治疗：每周三次，每次75 mg/kg，交替使用一天（第1天、第3天和第5天）或连续使用两天（第1-3天；n个=每组5只小鼠）。仅H3255异种移植物小鼠接受吉非替尼150 mg/kg，5×/wk（第1-5天）的治疗。A类，17-AAG显著延缓H3255的生长，但在该模型中不如吉非替尼有效，吉非替尼可诱导显著的肿瘤消退(P（P）17-AAG与对照组或17-AAG-吉非替尼组的比较<0.01）。B类和C，17-AAG单独抑制H1650和H1975异种移植物的生长。将小鼠随机分组，在第0天开始治疗。酒吧，东南。

17-AAG使EGFR突变型肺腺癌异种移植物对紫杉醇敏感。

如上所述，17-AAG可以有效下调突变型EGFR的表达，并抑制EGFR突变型异种移植物的生长。然而，由于毒性限制及其短半衰期，EGFR持续抑制体内无法使用此代理。正如我们和其他人之前已经证明的17-AAG可以增强细胞毒试剂的活性(33,36,37)，我们询问17-AAG是否可以增强EGFR突变肺癌异种移植物中紫杉醇的活性。对H1650和H1975异种移植物小鼠每周给予25 mg/kg紫杉醇（每周第1天）和/或75 mg/kg 17-AAG（每周第1-3天）。对照组小鼠单独使用载具进行治疗。在携带H1650和H1975异种移植物的小鼠中，紫杉醇和17-AAG的联合用药比单独用药更有效(图5). 为了进一步评估这种作用的机制，在紫杉醇、17-AAG或其组合开始治疗前24小时和48小时处死小鼠，并对肿瘤进行快速冷冻。17-AAG下调突变EGFR在17-AAG-单药和17-AAG/紫杉醇联合用药臂中的表达(图6). 紫杉醇单独对突变的EGFR表达没有影响。在17-AAG单独和17-AAG/紫杉醇臂中均观察到PARP切割测量的细胞凋亡，但在紫杉醇单独治疗的小鼠中未观察到。值得注意的是，联合用药组小鼠的这种作用持续时间更长(图6). 这些数据表明，17-AAG可以与紫杉醇安全地联合使用，并且对于肿瘤表达EGFR突变形式的患者，联合使用可能比单独使用17-AEG更有效。

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图5

17-AAG对Hsp90的抑制使H1650和H1975异种移植物对紫杉醇敏感。已建立H1650的小鼠(A类)和H1975(B类)每周（第1天）用25 mg/kg的紫杉醇和17-AAG治疗异种移植物，每周连续三天（第1-3天）。对照组小鼠单独使用载具进行治疗。用这些药物治疗小鼠最多30天，然后进行监测。在已建立H1650异种移植物的小鼠中，紫杉醇和17-AAG的联合作用明显优于17-AEG或紫杉醇单独作用(P（P）=0.02（紫杉醇/17-AAG vs.紫杉醇）。每组治疗5只小鼠，结果与第二组小鼠一致（数据未显示）。将小鼠随机分组，在第0天开始治疗。B类17-AAG和紫杉醇联合用药对已确诊H1975肿瘤的小鼠也比单独用药更有效。酒吧，SE。

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图6

紫杉醇和17-AAG联合诱导H1650异种移植物凋亡。EGFR、裂解的PARP和p85 PI3K的免疫印迹显示，17-AAG单独以及紫杉醇和17-AEG联合诱导凋亡，如PARP裂解所示。然而，与单独使用17-AAG的小鼠相比，联合治疗小鼠的凋亡持续时间更长。单用紫杉醇治疗后未观察到细胞凋亡。p85 PI3K是一种不受Hsp90抑制作用影响的蛋白质，作为负荷对照。用第二组小鼠重复并确认结果（数据未显示）。在时间零点用紫杉醇（25 mg/kg）或在4和24小时用17-AAG治疗小鼠，剂量为75 mg/kg。

讨论

Hsp90是一种丰富的细胞伴侣蛋白，用于未折叠蛋白的重折叠、细胞在应激条件下的存活以及在传递增殖和抗凋亡信号中起关键作用的各种蛋白质的构象成熟。Hsp90抑制剂的临床开发基于两个基本的临床前观察。首先，我们和其他人已经证明抑制Hsp90对肿瘤细胞具有选择性毒性(38,39). 在肿瘤细胞中，大多数Hsp90存在于与耳蜗酮的活性复合物中，而正常组织中的大多数Hsp90则以游离、非复合或潜伏状态存在(39). 与游离的、未结合的Hsp90相比，活性的、与可卡因结合的复合物中的Hsp90-对格尔德霉素和其他Hsp90抑制剂具有更高的亲和力(38,39). 这些数据可能部分解释了17-AAG和其他Hsp90抑制剂在肿瘤中的积聚。这些观察结果还表明，Hsp90可能在肿瘤细胞中“受限”，因此可以部分解释肿瘤细胞与正常细胞相比对Hsp90抑制剂更敏感。基于这些数据的一个预测是，Hsp90抑制剂可能在多种癌症类型中具有广泛的抗肿瘤活性。Hsp90局限于肿瘤细胞的发现也可能解释了Hsp90抑制剂与化疗、放疗和低氧应激诱导剂之间的协同作用。

一个相互竞争的模型是，Hsp90抑制剂仅在一小部分肿瘤类型中具有活性，其中转化的关键方面依赖于敏感的Hsp90依赖客户，如突变的EGFR。为了支持后一种可能性，我们发现单个Hsp90客户蛋白对Hsp90抑制剂降解的敏感性存在显著差异。尽管100多种转录因子、激酶、类固醇受体和其他调节蛋白已被证明与Hsp90相互作用，但我们的动物研究表明，这些Hsp90客户端中只有一小部分实际上被Hsp90抑制剂降解体内无毒剂量。这种客户敏感性层次结构的机制基础（即HER2>突变型EGFR>Raf-1>Akt>突变型BRAF>野生型EGFR的敏感性）尚待确定，但可能是由于客户之间的内在差异（即客户半衰期）或他们与单个Hsp90家族成员或同系物结合的差异。因此，确定“最敏感”Hsp90客户的子集可能有助于选择最有可能受益于Hsp90抑制剂的患者。

考虑到这一目标，我们比较了野生型和突变型EGFR对Hsp90抑制剂17-AAG下调的敏感性。我们选择17-AAG进行这些研究，因为它目前正在进行人体临床试验。我们观察到，与野生型EGFR相比，外显子19缺失突变和L858R外显子21突变对17-AAG诱导的降解更敏感。在使用稳定表达野生型或突变型EGFR的等基因细胞的研究中，突变型比野生型蛋白降解得更快，抑制剂浓度更低。我们进一步证明，使用异种移植模型系统，17-AAG可以在无毒剂量下诱导异种移植瘤中EGFR突变形式的下调，但不能诱导野生型蛋白的下调，并且在EGFR突变模型中伴随着抗肿瘤作用。Akt也是一种Hsp90客户蛋白，其表达不受无毒剂量17-AAG治疗的影响。然而，Akt的活性，通过Ser的表达来衡量⁴⁷³磷酸化AKT被17-AAG处理下调。在这种情况下，17-AAG对Akt活性的抑制可能特别重要，因为Akt激活已被证明是EGFR依赖性的，并可促进EGFR突变肺癌细胞系的细胞存活(40).

值得注意的是，在H3255（L858R-EGFR）异种移植模型中，以其最大耐受剂量使用17-AAG只能减缓肿瘤生长，并且17-AEG在该模型中的效果不如EGFR-TKI吉非替尼，后者能够诱导肿瘤完全退化。17-AAG在这种情况下疗效有限的可能解释是，在小鼠中无法实现突变EGFR和EGFR信号的持续下调。无法持续下调EGFR活性可能是由于17-AAG在小鼠体内的半衰期短，并且由于其肝毒性，无法每天长期给药(11). 因此，我们的数据为开发新型Hsp90抑制剂提供了有力的理论依据，该抑制剂具有更好的口服生物利用度和更少的肝毒性，可以采用每日连续给药。现已开发出几种具有这些特性的合成小分子Hsp90抑制剂，并已开始对两种此类药物CNF-2024和SNX-5422进行第一阶段试验(38,41).

尽管17-AAG作为单一药物在EGFR突变肿瘤中的活性是适度的，但我们确实观察到17-AAG和紫杉醇可以安全地联合使用，而不会产生附加毒性，并且在已建立H1650和H1975肿瘤的小鼠中，该联合使用比单独使用任何一种药物都更有效。我们和其他人之前已经使用多种模型系统，包括HER2依赖性乳腺癌和卵巢癌，证明17-AAG和紫杉醇的联合作用是协同作用的(37,42,43). 在HER2扩增的乳腺癌中，增强依赖于时间表，并由17-AAG诱导的Akt活性下调介导(33). 值得注意的是，在这些研究中，17-AAG对Hsp90的持续抑制并不需要通过联合用药达到最大效果。在EGFR-TKI吉非替尼的研究中，当该药物与紫杉醇联合使用时，脉冲给药也显示优于连续给药(44). 因此，虽然17-AAG作为单一药物的疗效可能会因其毒性而无法持续抑制Hsp90功能而受到限制，但当这种抑制剂间歇使用以使肿瘤对细胞毒性物质（如紫杉醇）敏感时，Hsp90抑制的全部潜在益处在临床上可能是可以实现的。

总之，我们的数据表明，对于肿瘤依赖EGFR突变形式的患者，Hsp90抑制剂可能是一种有效的临床策略。然而，我们的数据表明，17-AAG单独对此类患者的活性可能有限，与细胞毒联合治疗可能是一种更有效的临床策略。基于这些数据，我们在晚期癌症患者中启动了多西紫杉醇和17-AAG的1期试验。在这项研究中，这两种药物可以每3周安全地联合用药，并且在非小细胞肺癌患者中观察到有希望的临床活性(45). 因此，我们建议在肿瘤表达EGFR激活突变的肺癌患者中进一步研究Hsp90抑制剂与紫杉烷的联合应用。

补充材料

致谢

脚注

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