小鼠外周手术创伤与年龄相关性神经炎

摘要

介绍

术后认知功能障碍（POCD）是老年患者术后最常见的并发症之一[1]与成本、发病率和死亡率增加有关[2],[3],[4]然而，POCD的神经病理学仍有待确定，这一知识差距阻碍了POCD的进一步研究。

在我们之前的研究中，我们建立了一个小鼠局部麻醉下腹部开放手术的临床前模型，以确定在不受全身麻醉影响的情况下外周手术创伤对aβ积累和认知障碍的影响[5]我们发现，不受全身麻醉影响的外周手术创伤可导致年龄依赖性Aβ蓄积和认知障碍[5].

据报道，神经炎症，包括促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）水平的升高，以及小胶质细胞的激活，都会导致麻醉下手术引起的认知功能障碍([6],[7],[8],[9]，在中审阅[10]). 然而，未受全身麻醉影响的外周手术创伤是否会诱发年龄依赖性神经炎症尚不清楚。

因此，我们通过评估不受全身麻醉影响的外周手术创伤是否会在小鼠中诱发年龄依赖性神经炎来研究POCD的神经发生。最后，布洛芬是一种非甾体抗炎药（NSAID）。因此，我们评估了布洛芬是否能够减轻18个月龄小鼠的外周手术创伤诱导的认知功能障碍。

我们在目前的研究中选择了TNF-α和IL-6，因为这两种炎症前细胞因子已被证明与麻醉下手术相关的神经炎症有关([6],[7],[8],[9],[11]，在中审阅[10]). 最后，CD33型是一个新发现的AD相关基因[12]蛋白CD33是SIGLEC凝集素家族的成员，可以与唾液酸结合并调节先天免疫系统[13]此外，最近的一项研究表明CD33型可以改善Aβ病理学[14].两种Aβ积累（在[15])和神经炎症（综述于[10])已经证明与认知障碍有关。总之，我们评估了在没有全身麻醉的情况下，外周手术创伤对小鼠海马中TNF-α、IL-6、小胶质细胞活化和CD33水平的影响，以及对小鼠认知功能的影响。

结果

外周手术创伤后3小时和6小时小鼠海马TNF-α水平升高

神经炎症可能与动物的认知障碍有关[6],[8]和患者[16]因此，我们评估了不受全身麻醉影响的外周手术创伤对神经炎症的影响。TNF-α酶联免疫吸附试验表明，外周手术创伤后3小时，9月龄小鼠（6.9 pg/ml±1.07 vs 4.2 pg/ml？.57，P=0.047）和18月龄小鼠的海马TNF-(图1A). 双向方差分析表明，年龄增加了外周手术创伤诱导的TNF-α水平增加(图1A、P = 0.003). 在外周手术创伤后6小时，9（8.9 pg/ml±1.53 vs.4.2 pg/ml？.57，P=0.040）和18（11.1 pg/ml士2.50 vs.3.1 pg/ml(图1B). 双向方差分析表明，年龄增加了外周手术创伤诱导的TNF-α水平增加(图1B，P = 0.04). 在外周手术创伤后12小时，外周手术创伤没有显著改变9月龄和18月龄小鼠海马中的TNF-α水平（数据未显示）。这些数据表明，不受全身麻醉影响的外周手术创伤导致小鼠海马中促炎细胞因子TNF-α水平随时间和年龄增加。

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图1

外周手术创伤增加小鼠海马中TNF-α水平。

答：。外周手术创伤后3小时，9个月龄和18个月龄小鼠海马中的TNF-α水平增加。年龄增加了外周手术创伤诱导的TNF-α水平升高。B。外周手术创伤后6小时，9个月龄和18个月龄小鼠海马中的TNF-α水平增加。年龄增加了外周手术创伤诱导的TNF-α水平升高。（*：假手术创伤与周围手术创伤之间的差异；∧或∧∧：组与治疗之间的相互作用）。TNF-α、肿瘤坏死因子-α。N=6。

外周手术创伤后12小时小鼠海马IL-6水平升高

ELISA研究表明，术后12小时，两个9月龄小鼠海马的促炎细胞因子IL-6水平增加：7.1 pg/ml±0.40对3.1 pg/ml？.26，**P=0.009；和18个月大的小鼠：9.9 pg/ml±1.06 vs.4.3 pg/ml？.44，**P=0.0001(图2). 双向方差分析表明，年龄增加了外周手术创伤诱导的IL-6水平增加(图2，∧∧P=0.003）。外周手术创伤在手术后3或6小时没有增加IL-6水平（数据未显示）。这些数据表明，外周手术创伤导致小鼠海马中促炎细胞因子IL-6水平随时间和年龄增加。

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图2

外周手术创伤会增加小鼠海马的IL-6水平。

外周手术创伤后12小时，9个月龄和18个月龄小鼠海马中的IL-6水平增加。年龄增加了外周手术创伤诱导的TNF-α水平升高。（**或#：假手术与周围手术创伤的区别；∧∧：组与治疗的相互作用）。白介素，白介素。N=6。

外周手术创伤后12小时小鼠海马Iba1阳性细胞增加

小胶质细胞活化标志物Iba1的免疫染色[17]说明外周手术创伤增加了两个9月龄小鼠海马中Iba1阳性细胞的数量：75，62.3–123.3（中位数，四分位数范围），而66，38.8–89.8（中位数、四分位数之间），**P=0.003；和18个月大的小鼠：术后12小时时136102.0–149.0（中位数，四分位数范围）与6256.0–77.0（中位，四分位范围），##P=0.0001(图3A和3B). 双向方差分析表明，年龄增加了外周手术创伤诱导的小胶质细胞活化水平的增加，小鼠海马中Iba1阳性细胞数量的增加证明了这一点(图3B∧∧P=0.002）。这些数据表明，外周手术创伤能够诱导小胶质细胞活化，年龄增加了其活性。

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图3

外周手术创伤会增加小鼠海马体中Iba1阳性细胞的水平。

答：。免疫组化染色显示，与假手术组相比，外周手术组伤后12小时，9月龄和18月龄小鼠海马中Iba1阳性细胞水平均升高。外周手术创伤后，18个月大的小鼠海马中的Iba1阳性细胞比9个月大的小鼠多。B。图像的量化显示，与假手术组相比，外周手术组伤后12小时，9个月龄和18个月龄小鼠海马中Ibal阳性细胞的数量增加。年龄增加了外周手术创伤诱导的Iba1细胞水平的增加。（**或#：假手术组与周围手术组的差异；∧∧：组与治疗的相互作用）。Iba1，电离钙结合适配器分子1。N=6。

外周手术创伤后基因蛋白水平升高CD33型在老年小鼠的海马中

CD33型是一个新发现的AD相关基因[12]作为SIGLEC凝集素家族的成员，蛋白CD33结合唾液酸并调节先天免疫系统[13]因此，我们在不影响全身麻醉的情况下评估了外周手术创伤对CD33水平的影响。CD33的免疫印迹显示，外周手术创伤增加了细胞的蛋白水平CD33型（CD33）(图4A和4B)：141%±15 vs.100%±16，*P=0.030，在手术后12小时，18个月大的小鼠海马。然而，定量western blot显示，在手术后12小时，外周手术创伤并未显著改变9个月大小鼠海马中CD33的水平(图4C和4D). 这些数据表明，外周手术创伤导致小鼠海马中CD33水平的增龄性增强。

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图4

外周手术创伤只会增加18个月大的小鼠海马体中Iba1阳性细胞的水平。

答：。与假手术组相比，外周手术创伤增加了18个月龄小鼠海马中CD33的水平。外周手术创伤小鼠与假小鼠的β-肌动蛋白水平无显著差异。B。Western blot的定量分析表明，与假手术组相比，外周手术组损伤后18个月龄小鼠海马中CD33水平增加。C、。与假手术组相比，外周手术创伤不会增加9月龄小鼠海马中CD33的水平。外周手术创伤小鼠与假小鼠的β-肌动蛋白水平无显著差异。D。Western blot的定量分析表明，与假手术组相比，外周手术损伤不会增加18个月龄小鼠海马的CD33水平。（*：假手术和周围手术创伤之间的差异）。N=6。

布洛芬改善老年小鼠外周手术创伤所致认知功能障碍

考虑到不受全身麻醉影响的外周手术创伤可能会引发神经炎症(图1,​,22和​和3），三)、Aβ蓄积与老年小鼠认知障碍[5]，我们通过使用布洛芬评估因果关系，布洛芬是一种非甾体抗炎药（NSAID），已被证明可以减轻神经炎症[18]并降低Aβ水平[19]我们发现术后7天用布洛芬治疗可以改善老年小鼠外周手术创伤引起的认知功能障碍(图5A：上下文测试，∧∧P=0.002，双向方差分析）和(图5B：色调文本，∧∧P=0.0001，双向方差分析）。这些发现提供了额外的信息，表明外周手术创伤可以通过神经炎症诱导老年小鼠的认知障碍，而抑制神经炎症，例如使用非甾体抗炎药，可能会降低POCD的风险。

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图5

布洛芬减轻老年小鼠外周手术创伤诱导的认知功能障碍。

不受全身麻醉影响的外周手术创伤在上下文测试中诱发认知障碍(A类)和音调测试(B类)术后7天，在18个月大的小鼠中检测到FCS。布洛芬减轻周围手术创伤导致的环境试验冷冻时间减少(A类)和音调测试(B类)术后7天对FCS的影响（*或**：假手术组与周围手术组的差异；##：生理盐水与布洛芬治疗的差异；∧∧：组与治疗的相互作用）。FCT，恐惧调节系统。N=10。

讨论

POCD的神经病理性发生在很大程度上仍有待确定。据报道，神经炎症与人类POCD和动物认知障碍有关([6],[7],[8],[9]，在中审阅[10]). 我们最近的研究表明，不受全身麻醉影响的外周手术创伤可导致小鼠年龄依赖性Aβ蓄积和认知障碍[5]因此，我们评估了未受全身麻醉影响的外周手术创伤是否会导致年龄依赖性神经炎症。

我们发现外周手术创伤增加了TNF-α的水平(图1)，IL-6(图2)和Iba1阳性细胞(图3)在9个月龄和18个月龄小鼠的海马中。更重要的是，年龄增加了外周手术创伤诱导的TNF-α、IL-6和Iba1阳性细胞水平的升高。这些数据表明，不受全身麻醉影响的外周手术创伤可诱发年龄依赖性神经炎症（促炎细胞因子水平和小胶质细胞活化增加），老年小鼠可能更容易在外周手术创伤后发生神经炎症。

请注意，TNF-α水平的增加发生在外周手术创伤后3和6小时，而不是12小时，但外周手术损伤诱导的IL-6水平的增加仅发生在手术后12小时。这些数据表明，外周手术创伤诱导的TNF-α水平升高可能是外周手术损伤诱导的IL-6水平升高的先例。Terrando等人已经证明，在小鼠麻醉下手术后，TNF-α是IL-1的上游[6]可以想象，外周手术创伤后TNF-α水平的增加也可能导致IL-6水平的增加。未来的研究验证了这一假设。

CD33型是一个新发现的AD相关基因[12]和CD33型参与先天免疫和Aβ病理学[14]最近的一项研究表明CD33型（CD33）可以改善Aβ病理[14]我们始终发现，外周手术创伤增加了18个月龄小鼠海马体中CD33的水平，但没有增加9个月龄鼠海马体中的CD33水平(图4). 这些发现表明，外周手术创伤后，小鼠海马中CD33水平也发生了年龄依赖性变化。目前尚不清楚9个月龄和18个月龄小鼠在外周手术创伤后海马中CD33水平的差异是否是9个月和18个月龄小鼠在周围手术创伤后所观察到的神经炎症差异的原因，但值得今后进一步调查。

最后，非甾体抗炎药布洛芬具有抗炎作用并降低Aβ水平[18],[19]，减轻了18个月龄小鼠外周手术创伤引起的认知功能障碍(图5). 这些结果揭示了外周手术创伤诱导的神经炎与外周手术损伤诱导的认知功能障碍之间的因果关系。此外，这些发现显示了抗炎治疗在预防和治疗POCD中的潜在应用，有待进一步研究。

在实验时，未获得老龄TNF-α、IL-6或CD33基因敲除小鼠（例如18个月大的小鼠）。因此，我们无法研究TNF-α、IL-6或CD33敲除作用的机制。然而，当前研究的主要目的是确定在不受全身麻醉影响的情况下，外周手术创伤后小鼠的神经炎症是否存在年龄依赖性变化。在我们未来的研究中，我们将确定在不受全身麻醉影响的情况下，外周手术创伤是否仍能诱导老年TNF-α、IL-6或CD33敲除小鼠的认知障碍。

有趣的是，在当前实验中，9（成年）和18（老年）月龄小鼠海马中TNF-α、IL-6和小胶质细胞活化（Iba1阳性细胞）的基线水平没有显著差异。目前，这些发现的确切原因尚不清楚。然而，9（成年）和18（老龄）月龄小鼠之间，小鼠其他脑区（如皮层）的TNF-α、IL-6和小胶质细胞活化（Iba1阳性细胞）的基线水平仍有可能存在显著差异。未来的研究可能会包括说明这种差异的实验。

这些研究有几个局限性。首先，我们没有在研究中测量布洛芬对TNF-α、IL-6和小胶质细胞活化水平的影响。然而，布洛芬研究的目的是证明外周手术创伤诱导的神经炎和外周手术损伤诱导的认知功能障碍之间的一般因果关系。其次，据报道左旋布比卡因可以抑制炎症[20]因此，我们不能完全排除局部麻醉药对TNF-α、IL-6和小胶质细胞活化水平以及当前研究中观察到的认知功能的影响。然而，我们以前的研究表明，局部麻醉剂布比卡因（0.5%和0.1 ml）不会影响小鼠的认知功能[5]此外，在当前研究中，假小鼠还接受了布比卡因注射。最后，使用EMLA可能会产生副作用。一份病例报告显示，一名7个月大的患有肺发育不良的女孩在长期使用EMLA后，吸入一氧化氮，出现高铁血红蛋白血症引起的紫绀。在我们之前的实验中使用EMLA后，我们在小鼠中没有观察到这种副作用[5],[22].

总之，我们已经证明，在没有全身麻醉（局部麻醉）的情况下，腹部开放手术会导致小鼠海马中年龄依赖性神经炎症（例如，TNF-α和IL-6水平增加，小胶质细胞激活）和CD33水平的变化。老年小鼠更容易受到外周手术创伤诱导的神经炎症和CD33水平升高的影响。布洛芬是一种抗炎药，可以改善外周手术创伤诱导的老年小鼠认知功能障碍。综上所述，这些发现对老年患者的外科护理有着深刻的启示，并表明大脑老化可能更容易在外周手术创伤后发生神经炎症。有待进一步研究，考虑抗炎可能有助于降低老年患者POCD的风险。

方法

致谢

资金筹措表

本研究由美国国立卫生研究院资助（马里兰州贝塞斯达）（R21 AG029856、R21 AG038994、R01 GM088801和R01 AG041274）；美国老年医学会Jahnigen奖（纽约州纽约市）；研究者发起了阿尔茨海默病协会（伊利诺伊州芝加哥）和治疗阿尔茨海默病基金对ZX的研究资助。EM获得了国家老龄研究所颁发的面向患者研究的职业中期研究员奖[K24 AG035075]的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

数据可用性

作者确认，研究结果所依据的所有数据都是完全可用的，没有任何限制。所有资料都包含在手稿中。

工具书类