介绍
一些生物，如酵母或群居昆虫是单倍体，即它们携带一组染色体(Otto和Jarne，2001年)。酵母中的单倍体已被用来确定生物学的基本机制(Hartwell等人，1974年)。然而，所有哺乳动物体细胞都携带两个拷贝的染色体（二倍体），这掩盖了突变筛选，而只有一个拷贝基因组的生物体（如酵母）为遗传分析提供了基础，在遗传分析中，由于缺乏第二个基因拷贝，基本基因的任何隐性突变都会显示出明显的表型(Hartwell等人，1974年)。鱼类胚胎干细胞已实现单倍体(Yi等人，2009年)，人KBM-7白血病细胞(Carette等人，2009年; Carette等人。；Kotecki等人，1999年)或通过电融合产生杂交细胞(Yan等人，2000年)。然而，由于单倍体与哺乳动物的发育不相容(Latham等人，2002年)，除了KBM-7衍生的细胞（Carette等人）外，哺乳动物中从未报道过体细胞单倍体细胞。
在这里，我们表明有可能从激活卵母细胞衍生的孤雌生殖小鼠囊胚中生成哺乳动物单倍体ES细胞系。这些细胞在多次传代中表现出稳定的生长，可以有效地亚克隆，以与二倍体ES细胞相似的动力学分化，甚至在分化开始时也可以保持单倍体。此外，我们提供的证据表明，单倍体ES细胞可以很容易地用于反向遗传和正向遗传筛选。我们的研究为一个有望将功能基因组学与哺乳动物干细胞生物学相结合的系统提供了实验框架。
结果
孤雌生殖小鼠囊胚单倍体细胞系的建立
孤雌胚胎由单倍体卵母细胞发育而来，因此只包含母体基因组。然而，所有报道的来自孤雌生殖胚胎的细胞系都携带二倍体染色体(考夫曼等人，1983年)。我们假设单倍体细胞可能仍存在于孤雌生殖早期胚胎中，单倍体ES细胞可能来源于此类囊胚。为了实现这一点，我们将超排卵C57BL/6×129 F1雌鼠的卵母细胞暴露于5%乙醇中激活。然后将激活的卵母细胞转移到假妊娠受体()。在胚胎第3.5天（ED），收获致密桑椹胚和囊胚，并在用于获得ES细胞的条件下培养。FACS分析显示，少量孤雌生殖衍生细胞确实显示DNA含量降低(补充图S1A)。对该群体进行了几轮FACS纯化和随后的扩增，产生了两个来自两个不同胚泡的独立细胞系，以下称为HMSc1和HMSc2，其1n染色体位于细胞周期的G1期，2n染色体位于G2期(，补充图S1A)。染色体扩散显示，这两种细胞系都携带一组由20条染色体组成的单倍体(，补充图S1B)。值得注意的是，这两种细胞系已经传代了50多次以上，没有任何增殖危机的迹象。因此，利用减数分裂卵母细胞的激活和胚泡的孤雌生殖衍生，我们可以建立具有单倍体染色体组的小鼠细胞。
单倍体小鼠ES细胞系的建立A）单性生殖诱导和单倍体ES细胞系衍生的示意图概述。用5%乙醇（或25mM氯化锶（SrCl）激活小鼠卵母细胞2))并植入假怀孕的雌性体内。然后从囊胚和单倍体细胞中生成ES细胞，随后通过FACS进行分类。常规培养直到我们获得稳定的单倍体细胞。B）流式细胞术分析对照二倍体ES细胞系IB10/C和单倍体HMSc2细胞系的DNA含量。使用Hoechst33342测定DNA含量。指出了单倍体ES细胞的1n和2n染色体组，二倍体ES的2n和4n染色体组。直方图显示了10处单元格的数据第个排序。C）对照二倍体ES细胞和单倍体HMSc1和HMSc2细胞的代表性染色体扩散。单倍体细胞有丝分裂后期（1n）和前期（2n）的扩散。作为对照，二倍体ES细胞表现为后期（2n）和前期（4n）扩散。D、 E）相对于亲本内部C57BL/6和129菌株的共同参考，序列覆盖率以log2标度显示。单倍体细胞来源于C57BL/6×129杂交。染色体按数字顺序排列，并由小间隙隔开。另请参见补充图S1.
基因组完整性
为了对我们的单倍体细胞进行遗传学特征分析，我们使用深度测序将其基因组与亲本内部小鼠菌株C57BL/6和129的基因组进行了比较，并进行了区分性覆盖分析。简单地说，我们评估了测序读取的计数，而不是计算在50kb（10kb偏移量）的滑动窗口中映射到独特基因组位置的重复项，并将其归一化为每个库中映射到基因组的读取总数。正如预期的那样，我们发现菌株在许多位置都不同。因此，我们将两个单倍体细胞系的基因组DNA的深度测序读数与两个亲本菌株进行了单独比较，并以组合方式进行了比较，其中我们重点关注了与两个亲株的偏差()。总之，我们发现HMSc1与亲本菌株的差异超过2倍（多次试验校正的p值≤10-3)在对应于219个非重叠区域的1553个重叠窗口中，HMSc2有568个窗口（113个区域）增加，61个窗口（10个区域）减少读取计数（≥2倍；多次测试校正的p值≤10-3;补充表1)。值得注意的是，HMSc1和HMSc2之间重叠了1155个增加的窗口和99个减少的窗口，而分别只有397和4个不同。我们不知道该观察结果的来源，但这些共享拷贝数变化（CNV）可能源于测序过程的偏差，无论是在不同细胞类型（ES细胞与成人肾脏）的DNA制备过程中，还是在测序过程中构成批量效应。因此，与亲本菌株相比，我们的单倍体细胞系显示出有限数量的已定义CNV，这表明它们可能存在与之前使用已建立ES细胞的报告类似的小重复和缺失(贝克等人，2007年)或iPS细胞系(Hussein等人，2011年).
为了证实这两个单倍体细胞系在拷贝数分析中的相似性确实是不同的，我们利用了它们来自C57BL/6×129杂交的卵母细胞这一事实，因此减数分裂重组应该导致不同的单倍体结构。我们将深度测序读数与桑格研究所小核苷酸多态性（SNP）释放获得的SNP进行了比较，这两种小鼠菌株之间存在差异。我们的序列覆盖了150万（HMSc2）和170万（HMSc1）个不同的SNP，并允许将相应的基因组区域唯一地分配给双亲之一。比较HMSc1和HMSc2细胞中的SNP确实证实了我们获得了两个独立的单倍体克隆(补充图S1C)。总之，CNV分析、FACS和染色体扩散表明，这两种细胞系都是独立衍生的，并且排除了HMSc1和HMSc2基因组或单个染色体的大部分被删除或复制。
原型ES细胞标记物的表达
接下来，我们测试了我们的单倍体细胞系是否表达原型胚胎干细胞标记，即我们的单倍体细胞是否确实是ES细胞。单性生殖衍生的单倍体HMSc1和HMSc2系均表现出典型的ES细胞形态，并对ES细胞标志物碱性磷酸酶染色呈阳性()。免疫标记检测Oct4、Nanog和Sox2()证实HMSc1和HMSc2细胞表达原型ES细胞标记。转录组分析表明，两个单倍体细胞系的表达谱与二倍体ES细胞系IB10/C的表达谱非常相似(补充图S2A)。为了关注具有最高区分值的基因，我们分析了一组100个基因，以确定小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和二倍体ES细胞在任何方向上的基因表达差异最大，其中包括纳克，10月4日和Klf4公司(钱伯斯等人，2003年)。对该基因集的分析表明，HMSc1和HMSc2细胞株的表达特征与真正的二倍体ES细胞株IB10/C相似(补充图S2B，补充表2)。定量PCR分析证实HMSc1和HMSc2细胞均表达原型ES细胞标记() (Elling等人，2006年;高桥和山中，2006年)。总之，原型干细胞标志物的全局转录组分析和表达分析证实了两种单倍体细胞系的ES细胞性质。
标记分析和在体外单倍体ES细胞系的分化潜能A）单倍体HMSc1和HMSc2细胞系均表现出ES细胞集落的形态学特征（星号）。显示了具有代表性的相位对比度图像。注意小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的饲养层（箭头）。单倍体细胞染色也为ES细胞标记碱性磷酸酶阳性（蓝色，底部面板）。B）小鼠胚胎干细胞原型标记Oct4、Nanog和Sox2的表达。磷脂酶染色显示饲养细胞层。单倍体HMSc1和HMSc2细胞共染Oct4（FITC）和Nanog（TRITC）。在这两种情况下，染色分别显示在红色通道中。比例尺为50μm。数据来自4之后的单元格第个排序。C）单倍体HMSc1（蓝色）和HMSc2（红色）细胞中原型ES细胞标记基因的表达。用qPCR测定mRNA表达，并将其归一化为二倍体IB10/C ES细胞（黑条）。D）胚状体（EB，第7天）中Gata4蛋白的表达作为内胚层的标记。单倍体HMSc1和HMSc2 ES细胞系的代表性EB均显示为用阴茎倍体蛋白（绿色）复染。比例尺为50μm。E）qPCR显示，来自单倍体ES细胞系HMSc2的EBs（第7天）中ES细胞标记Nanog、Rex1、Oct4、Sox2、Klf2、Klf4和Sall4下调，并伴有所示谱系承诺标记的表达（见正文）。mRNA表达标准化为亲本未分化单倍体ES细胞（设为1）。另请参见补充图S2.
单倍体ES细胞的分化潜能在体外
为了测试单倍体ES细胞的分化潜能，我们首先检测了类胚体（EB）的形成。两种单倍体细胞系都很容易形成EB，EB细胞表达内胚层标志物(Soudais等人，1995年)Gata4公司()。实时PCR进一步证实了分化。原型ES细胞标记物Nanog、Rex1、Oct4、Sox2、Klf4、Sall4和Kfl2(钱伯斯等人，2003年;Robertson等人，1986年;高桥和山中，2006年)在EB中下调谱系承诺标记（Zhang等人）Hand1（中胚层，滋养层）、Nkx2-5和Brachyury（均为中胚层）、Nestin（神经）、Gata4、Gata6、Foxa2（均为早期内胚层），Sox17（内胚层和中胚层相对于亲本单倍体ES细胞上调(，补充图S2C)。这些结果表明，单倍体ES细胞能够分化为所有三个胚层的几个谱系。
体内分化潜能
为了评估已建立的单倍体ES细胞系对成年小鼠的贡献能力，我们注射了来自Agouti的细胞+ES系HMSc2进入ED 3.5囊胚。为了确保竞争性生长和有效贡献，使用了单倍体HMSc2衍生的二倍体细胞。在出生的25只小鼠中，有6只动物出现了毛色嵌合现象()。分析以前报道的孤雌生殖细胞对各种器官的贡献(汤姆森和索尔特，1988年)，我们进行了区分PCR并在多个组织中检测到HMSc2衍生细胞(补充图S3A)。为了测试单倍体ES细胞的内在分化潜能，我们进行了体内畸胎瘤分析。与二倍体ES细胞对照组相似，注射HMSc1和HMSc2细胞总是在4-8周内导致畸胎瘤的形成。
体内单倍体ES细胞系的分化潜能A）单倍体ES细胞对成年小鼠的组织有贡献。Agouti的二倍体细胞+将克隆HMSc2注射到C57BL/6囊胚中，观察到毛色嵌合（棕色毛皮斑块）。B）来自对照二倍体IB10/C ES细胞和单倍体ES细胞系HMSc1和HMSc2的畸胎瘤的组织学和免疫组织学分析。单倍体ES细胞可参与所有三个胚层，即肌肉细胞（H&E）、肠内胚层（Alcian蓝染色的产生粘蛋白的杯状细胞，核固红染色）、Tuj1+神经元和表达细胞角蛋白5（K5）的外胚层。Tuj1号机组+和K5+免疫组化（DAB，棕色）检测细胞，苏木精（蓝色）复染。比例尺：100μm。另请参见补充图S3.
在来源于两种单倍体ES细胞系的畸胎瘤中，我们观察到中胚层来源的肌肉细胞、内胚层来源的产生粘蛋白的钙蓝阳性上皮组织、神经外胚层来源的Tuj1+神经元和外胚层衍生细胞角蛋白5+上皮组织()。此外，我们观察到真正的软骨组织、脂肪、角化多层上皮、色素上皮、皮脂腺汗腺、腺小管和神经小管，或纤毛呼吸上皮(补充图S3B-I)。这些数据表明，单倍体ES细胞衍生的细胞有可能促成嵌合小鼠，并且它们可以分化体内进入所有三个胚层的细胞。
稳定生长和分化的能力是单倍体ES细胞固有的
为了评估单倍体ES细胞是否具有稳定生长的内在能力，我们在FACS纯化后直接电镀单倍体细胞，建立了几个单独的细胞克隆。这些亚克隆是在无饲养者条件下建立的，来源于HMSc1和HMSc2亲本系，这些亲本系之前培养了30多代。所有衍生的亚克隆表达干细胞标记Oct4和Sox2(，补充图S4)并形成含有Gata4的EB+内胚层细胞和Tuj1+神经元(，补充图S5)。根据单倍体亚克隆HMSc2-27的生长速度和稳定单倍体细胞的数量，选择其进行进一步研究(补充图S6A、B).
单倍体ES细胞具有稳定生长和分化的内在能力A）FACS纯化后直接电镀单倍体细胞建立的三个不同亚克隆上Oct4蛋白表达的免疫染色（顶部面板）。中间和底部面板显示了Oct4（红色）和Tuj1（绿色）表达的免疫染色，以及来自所示子克隆的附着的类胚体（EBs，第10天）中内胚层标记Gata4（红色，用DAPI复染）的表达。数据来自亲本系传代超过30代后的亚克隆细胞。比例尺为50μm。B）扩散率和C）含有100%二倍体MHSc2-27细胞的对照培养物中单倍体细胞的百分比，以及以80:20和50:50的单倍体与二倍体细胞比率接种HMSc2-27的培养物。使用Hoechst33342染色细胞的FACS分析每24小时测定一次增殖率和单倍体百分比。注意，在本实验中，细胞连续培养7代（14天）。根据这个实验，我们估计在实验过程中，每天约有2-3%的单倍体细胞变成二倍体。D）单倍体ES细胞亚克隆HMSc2-27中成肌细胞的发育。本实验以无饲养层细胞二倍体ES细胞系CCE为对照。显示了典型的相位对比图像（参见补充电影观看这些成肌细胞的典型“跳动”）。比例尺为100μm。E）GFP标记的单倍体ES细胞亚克隆中的GFP表达（绿色）。非GFP标记的单元格显示为对照（灰色阴影直方图）。相同亚克隆的DNA含量流式细胞术（Hoechst33342）显示单倍体和二倍体细胞都表达GFP。F）单倍体和二倍体HMSc2-27细胞分化为含有Tuj1神经元（绿色）和表达Gata4的内胚层细胞（红色）的EB（第13天）。注意Oct4表达下调（红色，上面板）和Nanog残留簇的存在+单元格（绿色，底部面板）。在顶部面板中，用DAPI对细胞进行复染，以显示细胞核。另请参见补充图S4-S6.
HMSc2-27亚克隆的典型干细胞形态、Oct4、Nanog和Sox2的蛋白表达以及单倍体染色体组得到了确认(补充图S6C-F)。HMSc2-27细胞在不同单倍体与二倍体接种率下的生长速度与纯二倍体HMSc2-27cells的生长速度相当()。值得注意的是，这些增长率与以前建立的ES细胞系相当。HMSc2培养中二倍体与单倍体细胞比率的动力学研究-27个细胞显示，这些细胞中有很大一部分在7代内保持单倍体()。HMSc2-27 ES细胞分化为EB，随后进行谱系特异性分化方案，表明这些细胞具有形成Gata4的能力+内胚层，Tuj1+神经元谱系()和中胚层“跳动”成肌细胞(，有关同步收缩，请参见补充电影1和2)。此外，在体内畸胎瘤检测HMSc2-27细胞可以分化为所有胚层细胞（未显示）。为了确认亚克隆实验，即确保从单个单倍体ES细胞克隆确实有效，我们生成了GFP阳性亚克隆。已建立的亚克隆中的所有细胞都表达GFP，无论它们是处于单倍体还是二倍体阶段()。由于二倍体细胞不能变成单倍体，这些实验证实，这些克隆的所有细胞都必须来自单个单倍体细胞。
HMSc2-27亚克隆使我们能够检测这些细胞在单倍体与二倍体状态下的分化潜能。单倍体HMSc2-27 ES细胞确实能够下调Oct4并形成Tuj1+神经元和Gata4+EB培养中的内胚层细胞()。接下来，我们尝试直接将单倍体HMSc27细胞（不形成EB）分化为神经和星形胶质细胞系(Pollard等人，2006年)。HMSc2-27细胞能够分化为Nestin表达所定义的神经干细胞（NSCs）。此外，进一步分化后，我们观察到GFAP+星形胶质细胞和Tuj1+神经元(和数据未显示）。接下来我们测试了分化和单倍体状态是否互斥，即单倍体细胞在分化之前是否需要变成二倍体。因此，我们在胚胎干细胞、神经干细胞和分化的神经干细胞培养物中检测血统标记Oct4和Nestin，并检测细胞的DNA含量。而几乎所有10月4日+细胞在所有培养条件下都保持单倍体，我们观察到单倍体和二倍体Nestin+神经祖细胞。然而，当这些神经祖细胞进一步分化为星形胶质细胞和神经元时，所有Nestin阳性细胞在4天内变为二倍体().
单倍体ES细胞的分化潜能A）在维持ES细胞命运的条件下培养的单倍体ES细胞克隆HMSc2-27的分析，在体外分化为Nestin+神经干细胞（NS细胞），并进一步分化为GFAP+星形胶质细胞在1%血清（分化的NS细胞培养条件）中提取EGF和FGF2。显示Oct4、Nestin和GFAP的免疫荧光标记，并对DAPI进行复染。展示了具有代表性的图像。比例尺为100μm。B）在ES细胞（顶部）、NS细胞（中间）和分化的NS细胞（底部）条件下生长的Oct4和Nestin表达门控细胞中DNA含量的流式细胞术分析。在每个图中插入所使用的门和细胞百分比。单倍体细胞在10月4日显著+Nestin在所有条件下的分数+分化4天的细胞没有单倍体细胞。左上角的红线显示了二倍体对照IB10/C ES细胞系Oct4表达门控的代表性DNA含量。C）单倍体细胞按照与二倍体细胞相同的动力学退出多能状态。左边的面板显示了单倍体HMSc2-27、混合（单倍体和二倍体）HMSc2-26和对照二倍体CCE ES细胞在对照（加LIF）条件下72小时后的对照Oct4水平（所示的平均强度）。LIF退出诱导分化导致二倍体和单倍体细胞Oct4表达降低（中图）。使用0.5μM维甲酸诱导分化会导致单倍体和二倍体细胞中Oct4的快速表达缺失，这表明存在分化（右图）。当我们使用0.1μM维甲酸（未显示）时，获得了相同的结果。数据显示为平均Oct4荧光强度+/-SEM，每个条件下分析超过50000个细胞。1way ANOVA（p>0.05）显示，除48和72小时维甲酸处理（其中Oct4表达处于背景水平）外，所有条件下二倍体细胞中Oct4的表达均增加（与核面积增加一致）。另请参见补充图S7.
使用Oct4表达的高含量筛选分析进一步评估单倍体细胞的分化能力（Walker等人。；Walker等人，2007年)，DAPI强度和核面积，能够自动测定单倍体和二倍体HMSc2-27细胞的分化状态(补充图S7)。在LIF存在下培养72小时的ES细胞保持高水平的Oct4，如Oct4平均表达强度所示(，左侧面板）。分布分析表明，变成二倍体的HMSc2-27细胞表达的Oct4水平略高于单倍体细胞，与较大的细胞核一致。退出LIF后，单倍体和二倍体HMSc2-27细胞中Oct4的表达显著降低(，中间面板）。此外，0.5μM维甲酸诱导分化可将单倍体和二倍体HMSc2-27细胞中Oct4的表达显著降低至背景水平(，右面板），类似于使用0.1μM维甲酸获得的结果（未显示数据），表明有效分化。这些数据表明，单倍体胚胎干细胞可以像二倍体胚胎细胞一样以类似的动力学分化，重要的是，单倍体干细胞即使在分化开始时也可以保持单倍体。
逆转录病毒突变
建立单倍体ES细胞的想法是在基因组水平上创建正向和反向遗传学的工具。为了证明单倍体小鼠ES细胞的诱变能力，我们感染了5×108使用先前报道的含有可逆基因陷阱的逆转录病毒的HMSc2-27的新鲜FACS纯化单倍体培养物的细胞(Schnutgen等人，2008年)。该载体还包含可移除的Oct4结合位点(Schnutgen等人，2008年)它允许将基因插入干细胞中表现出最小或无法检测到的表达。感染后7.5×106根据集落形成实验的估计，生成了独立的基因组插入。
然后汇集ES细胞集落，分析对应于300万个细胞的10μg基因组DNA，通过反向PCR和深度测序绘制病毒插入位点。我们可以明确地识别176178个插入。大约一半的插入被映射到基因间区域，约51%的插入发生在启动子区域和基因内区域，包括8203个不同的基因（5′和3′UTR，1标准内含子、其他内含子和编码区域）()。在基因内插入中，大约一半（53%）是有意义的，一半是反意义的。值得注意的是，我们观察到1标准最有可能导致基因表达/功能完全中断的内含子。为了分析基因陷阱的功效，我们根据基因在HMSc2细胞中的表达水平将其分为10个箱子（0-10%表示最低表达，90-100%表示最高表达的基因）。正如预期的那样，更高表达的基因更容易被击中（高达67%）。重要的是，由于设计的10月4日结合位点(Schnutgen等人，2008年)我们能够获得频繁（31%）的基因插入，这些基因在ES细胞中表现出最小或无法检测到的表达()。接下来，我们分析了176178个插入片段或总插入片段中捕获的基因数量(; 所有插入都设置为X轴的100%）。该分析表明，诱变尚未达到饱和，表明较高的插入次数将增加目标基因的数量。考虑到我们的图书馆由40×更多（7.5×106)独立整合后，我们的突变方案原则上具有破坏大多数基因的能力。
单倍体ES细胞的反向遗传学A）新霉素筛选后病毒整合位点分析。通过深度测序确定176178个插入。逆转录病毒在基因间区占49%，在基因内区占51%，与内含子整合的频率很高，尤其是第一内含子。B）图表显示了在一轮逆转录病毒突变后，总病毒整合位点（X轴）不同部分病毒整合基因的百分比。表达量最低10%（0-10%）的基因整合效率最低，而表达量较高的基因（50-100%）的整合效率更高。随着病毒总整合位点（X轴）比例的增加，达到了更高的饱和度，高达67%，但尚未达到饱和度，这表明额外的基因被困在750万个独立插入的总库中。C、 D）使用指定基因的位点特异性引物和插入的逆转录病毒的LTR特异性引子进行PCR分析。使用的PCR引物的位置在每个面板的顶部以示意图的形式显示。值得注意的是，所有的引物都用于所有10个不同的基因，显示（C）病毒确实已整合到初始测序和（D）整合导致相应基因座的纯合突变。车道1=马卡姆1; 车道2=德罗莎; 车道3=维甲酸受体γ(拉格); 车道4=应用程序4s1; 车道5=阿拉伯1; 车道6=Evx1（Evx1）; 车道7=Bcl2l1公司; 车道8=2210012G02RIK公司; 9号车道=提坦; 10号车道=第二章：50928851显示阳性野生型（Wt）和阴性H2O对照。E）野生型单倍体HMSc2-27细胞RARG mRNA表达的qPCR分析rarg公司（Wt）、含有反义方向剪接受体（AS）的HMSc2-27细胞和含有义方向剪合受体（S）的HMSc2-27细胞。mRNA表达标准化为亲代HMSc2-27细胞。F）含有所示野生型、反义和有义RARG HMSc2-27细胞的培养物的代表性图像，用0.1μM维甲酸处理10天。注意Wt和反义培养物中几乎完全没有细胞。比例尺为100μm。G）野生型单倍体HMSc2-27细胞Drosha mRNA表达的qPCR分析德罗莎（Wt）、含有反义方向剪接受体（AS）的HMSc2-27细胞和含有义方向剪合受体（S）的HMSc2-27细胞。mRNA表达标准化为亲代HMSc2-27细胞。H）囊性类胚体完全缺失德罗莎与表达野生型HMSc2-27细胞的Drosha和反义方向上含有剪接受体的细胞相比，HMSc2-28细胞缺乏。胚胎样体的代表性图像显示在EB诱导后的第10天。值得注意的是，我们在德罗莎即使在长时间培养中也会出现突变细胞。比例尺为100μm。一）直方图显示Venus报告基因在野生型HMSc2-27细胞（Wt）、含有反义方向剪接受体（AS）的HMSc2-27-细胞以及含有义方向剪合受体（S）的HMSc2-27细胞中的表达用基于pSENSOR的miRNA转导构建物，包含一个有效的shRNA靶向萤火虫荧光素酶，在Venus的3′UTR中有（靶）或无（无）靶点。细胞被shRNA表达门控（dsRed+)将细胞和Venus表达水平与未转导的对照细胞（灰色）进行比较。
单倍体小鼠ES细胞作为高通量反向遗传学的工具
利用我们的逆转录病毒突变装置，我们接下来选择了单个克隆，确定了约1000个细胞系（未显示）的插入位点，并选择了10个带有正或反义插入的克隆进行进一步分析。用位点特异性引物进行的PCR分析证实，我们的测序方法在所有10例病例中都确定了正确的靶位点()。最重要的是，这些数据还表明，所有10个克隆都携带纯合插入()表明单倍体细胞发生了突变，这种方法对隐性遗传确实可行。
两个克隆在编码维甲酸受体γ(拉格)和德罗莎使用携带反义逆转录病毒载体的亲本野生型（Wt）HMSc2-27细胞或ES细胞克隆进行功能验证。通过瞬时Cre表达，我们将等位基因转换为感觉整合，其中剪接受体干扰基因表达；这种方法可以立即确认候选基因，并排除潜在的背景突变。事实上，剪接受体的正反义整合导致Rarg mRNA几乎完全缺失()。在功能上，尽管携带野生型（Wt）等位基因或反义剪接受体的ES细胞在维甲酸处理后会发生快速分化和细胞死亡，但Rarg表达的中断使ES细胞对维甲酸的作用不敏感().
RNase III Drosha催化核内pri-miRNA转录物转化为前miRNA干环前体(Lee等人，2003年)。由于在miRNA处理的初始步骤中起着关键作用，纯合子德罗莎失活预计会严重损害miRNA的生物生成。虽然是有条件的德罗莎敲除鼠标之前已经出版(Chong等人，2008年)，不可行德罗莎敲除细胞系已被报道。我们确实能够生成德罗莎Cre介导的剪接受体倒置后的突变ES细胞克隆()。据报道，ES细胞在巴沙直系亲属图纸8(Wang等人，2007年)它和Drosha是一种蛋白质复合体的一部分，称为微处理器复合体(Denli等人，2004年),德罗莎突变ES细胞不能形成囊状胚体()。评估ES细胞中含有被破坏的miRNA的初级加工德罗莎等位基因，我们监测了一种有效的基于miR30的shRNA（shmiR.Luc1309）对编码Venus报告蛋白序列的3′UTR中含有Luc1309-特异性shRNA靶点（靶点）的转录物表达的影响(Fellmann等人2011)。而shmiR。Luc1309强烈抑制正常ES细胞中的Venus表达德罗莎缺乏的ES细胞克隆未显示shRNA介导的报告子抑制()，表明miRNA通路功能异常。这些数据表明，单倍体ES细胞确实可以有效地用于反向遗传学，创造可逆的纯合突变。
蓖麻毒素毒性相关基因的全基因组筛查
最后，我们开始使用单倍体ES细胞系统在基因组水平进行隐性正向遗传筛选。蓖麻中天然存在的蓖麻毒素蓖麻剧毒。在分子水平上，蓖麻毒素与细胞表面的N-乙酰氨基半乳糖或β-1,4-连接的半乳糖残基和甘露糖受体结合，蓖麻素分子被认为通过高尔基体逆行运输进入内质网（ER）的内腔，在内质网的内腔中逃逸到胞浆中去灭活核糖体(斯普纳和洛德，2011年)。由于我们发现蓖麻毒素对小鼠ES细胞具有高度毒性，因此我们使用我们的突变单倍体HMSc2-27细胞库，并用致死剂量的蓖麻毒素攻击细胞。尽管蓖麻毒素杀死了所有对照ES细胞，但我们观察到来自突变单倍体HMSc2-27细胞的多个ES细胞集落的生长()。这些克隆随后汇集并深度排序，以确定集成站点。正如之前的研究所预期的那样，我们发现了多种参与糖代谢的酶，即β-1,4-半乳糖基转移酶1（B4galt1）、N-乙酰乳糖胺β-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（Gcnt2）、多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶2（Galnt2），糖蛋白-半乳糖基转移酶α-1,3（Ggta1），和多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶3（B4galnt3）()。我们还获得了α-（1,3）-岩藻糖基转移酶Fut9的多个破坏性突变，并击中GDP-岩藻糖转运蛋白1 Slc35c1()。岩藻糖基化途径迄今为止从未与蓖麻毒素毒性相关。
单倍体ES细胞蓖麻毒素毒性正向遗传筛选A）将单倍体HMSc2-27暴露于来自蓖麻持续3周。菌落仅出现在突变批次中，并进行了深度测序处理。B）蓖麻毒素毒性筛选中的热门搜索。中的正义（绿色）和反义（红色）插入Gpr107号机组，未来9、和Slc35c1系列基因组基因座。垂直线表示每个基因的各自外显子，第一个外显子总是移到每个图的左侧。反义插入可能会破坏基因功能，在几乎所有情况下，感觉整合都会这样做。请注意，几乎所有的插入对于剪接受体都是有意义的，并且一些反义整合映射到外显子，所有这些都应该导致破坏性突变。考虑到约50%的基因内插入是有意义的，约50%是反义的，这些数据也表明，筛选确实强烈富集了破坏性突变（p>1.13E-10对于Gpr107号机组; p> 3.95东经-6对于未来9; p> 0.000019用于Slc35c1系列).C）蓖麻毒素毒性筛选中确定的基因。指出了预测会破坏基因表达的不同逆转录病毒插入的数量（因为基因内区域包含剪接受体的正方向，或者正反义整合到外显子中）。使用二项式检验评估了感觉突变与反感觉整合的富集情况，并显示了相应的p值。值得注意的是，反义整合也可能导致基因断裂。还指出了指定的生化途径和高尔基体的分配。D、 E）验证Gpr107对蓖麻毒素的毒性。HMSc2-27 ES细胞和NIH3T3细胞用表达Gpr107或对照shRNAs的LMN构建物与GFP一起转导，然后用致死剂量的蓖麻毒素攻击2天。图片显示蓖麻毒素治疗48小时后的代表性培养物（D）.比例尺为100μm。（E）蓖麻毒素处理后的恢复细胞与未处理细胞之间的蓖麻毒素存活率以%表示（通过前向散射、侧向散射和PI染色对细胞活力门控的定量FACS分析确定，蓖麻毒素治疗48小时后）。细胞在10cm培养皿中培养三次，每个培养皿中测定eGFP阴性（未转导）和eGFP阳性单倍体HMSc2-27 ES细胞和NIH 3T3细胞的平均存活+/-SD。
有趣的是，我们在GPCR Gpr107（LUSTR1）中观察到49种不同的整合()表明Gpr107是蓖麻毒素毒性的关键分子。使用HMSc2中的shRNA技术敲低MHSc2-27细胞中Gpr107的表达，证实了这种GPCR在蓖麻毒素毒性中的中心作用。Gpr107在蓖麻毒素诱导的细胞死亡中的关键作用在不同类型的细胞中得到了进一步证实，即NIH 3T3细胞()。值得注意的是，我们的shRNA数据显示为从含有蓖麻毒素的培养皿中回收的活细胞与未经蓖麻毒素处理的活细胞的比率（存活率%）：与各自的未处理细胞相比，在蓖麻毒素治疗48小时后，约有1%的未转导或对照shRNA转导细胞仍然存活；shRNA介导的Gpr107敲除显著提高了蓖麻毒素暴露HMSc2-27和NIH 3T3细胞的存活率，但并没有完全保护这些细胞免受蓖麻毒素毒性的影响。相比之下，基因消融Gpr107型在单倍体HMSc2-27 ES细胞中进行筛选，得到的细胞能够在施用蓖麻毒素后存活3周，并且能够从单个突变细胞开始扩大并形成菌落。因此，在单倍体ES细胞中进行正向遗传筛选是可行和有效的。
讨论
我们的数据表明，可以从乙醇激活的卵母细胞衍生的孤雌生殖小鼠囊胚中生成哺乳动物单倍体ES细胞系。此外，我们现在还成功地使用氯化锶激活卵母细胞，并衍生出第三个独立的单倍体ES细胞系（未显示）。单倍体ES细胞的详细分子特征表明，这些细胞表达二倍体ES的所有经典标记，携带20条染色体，并在很大程度上保持基因组的完整性。在功能上，这些单倍体ES细胞可以从所有三个胚层分化为细胞在体外和体内虽然我们的品系和亚克隆是稳定的，并且在某些情况下保持了70多代，但一些单倍体细胞变成了二倍体。我们的突变数据表明，这些细胞不是通过细胞融合而变成二倍体的，而是通过失败的胞质分裂和/或基因组内复制。确切的机制需要确定。此外，确定单倍体细胞在发育的哪个阶段必须变成二倍体才能形成特定的细胞类型，这将是一件有趣的事情，使用我们的高通量成像平台进行实验是可行的，该平台还允许我们跟踪单细胞中的单倍体。
最重要的是，我们的单倍体ES细胞可以发生突变，在迄今为止我们分析的所有情况下，这些突变都是纯合的，这表明这种单倍体细胞可以用于分析各种细胞系的隐性和疾病表型体外试验。尽管我们检测到我们的细胞系对多种组织的贡献体内，需要确定这些单倍体细胞是否有助于生殖系。然而，如之前报道的Medaka，可以尝试使用半克隆技术进行生殖系传播(Yi等人，2009年).
我们的结果为将单倍体基因组的力量与胚胎干细胞的多能性结合起来提供了可能性。在过去的一个世纪里，隐性基因筛查已经阐明了各种各样的生物过程，因此对我们理解正常发育、基本生理学和疾病做出了显著贡献(Nusslein-Volhard和Wieschaus，1980年)。然而，由于无性繁殖周期，哺乳动物的饱和遗传筛选在细胞培养系统中是不可能的，也不可行体内(Carette等人，2009年)。因此，基于RNA干扰的方法彻底改变了功能基因组学。然而，在许多情况下，RNAi介导的基因沉默仍然受到可变敲除、非靶点效应和短暂沉默效应的影响(Brummelkamp等人，2002年;卡彭特和萨巴蒂尼，2004年;Fellmann等人，2011年)。我们的实验基于单倍体ES细胞的一轮逆转录病毒感染中产生的数百万种不同的整合，表明在哺乳动物ES细胞中进行饱和遗传隐性筛选是可能的。我们还报告说，使用载体系统进行反向遗传学是可行的，该载体系统通过Cre介导的剪接受体位点转换，立即确认相同克隆中的基因功能。使用这个系统，我们确实能够使用带有条件的克隆来验证我们的方法拉格和德罗莎突变。此外，我们对蓖麻毒素毒性进行了正向基因筛查，蓖麻毒素是最危险的毒物之一，政府也将其用作生物武器进行调查。蓖麻毒素还因其在生物恐怖主义中作为毒素的潜在用途而臭名昭著(Papaloucas等人，2008年)。通过单倍体ES细胞的筛选，确定了GPCR Gpr107是蓖麻毒素诱导杀伤所需的基本分子。由于没有抗毒素可用于治疗蓖麻毒素中毒，对Gpr107（可能还有我们筛选出的其他分子）的分子抑制可能有助于减轻蓖麻毒素毒性体内这是一个现在需要验证的假设。我们预计，我们的新型单倍体ES细胞可以将单倍体生物体（如酵母）的力量与快速全基因组遗传正向筛选干细胞或任何可从我们的单倍体小鼠ES细胞系获得的分化细胞类型联系起来。
方法总结
卵酶的孤雌激活
收集卵母细胞并在5%乙醇中培养5分钟。随后，将活卵母细胞转移到假孕小鼠体内，并在胚胎第3.5天收集囊胚。
ES细胞的衍生
如前所述，将囊胚放置在带有ES细胞衍生培养基的饲养层涂层细胞培养皿上(Bryja等人，2006年)。将囊胚的生长物进行胰蛋白酶处理，并将其移植到饲养层上，以允许ES细胞集落的生长。
基因组测序
通过超声波剪切小鼠肾脏或ES细胞纯化的DNA，并按照Illumina适配器结扎协议进行处理，然后在Illumiana HiSeq中进行测序。使用蝴蝶结将读数映射到基因组。
干细胞特性
使用qPCR或免疫荧光标记以及碱性磷酸酶的酶测定来分析细胞是否存在干细胞标记物。
区别
通过取消LIF和EB形成或通过直接神经元分化来分化细胞(Pollard等人，2006年)。对于畸胎瘤的形成，将细胞注射到裸鼠睾丸或皮下，并监测畸胎瘤生长。为了产生嵌合小鼠，将HMSc2 ES细胞注射到C57BL/6 ED3.5囊胚中，并转移到假孕雌性体内。嵌合百分比由毛色决定。
ES细胞逆转录病毒感染与逆转录聚合酶链反应
病毒包装在铂E细胞中。使用G418选择基因陷阱插入。根据Carette等人的研究，对反向PCR的方案进行了修改(Carette等人，2011年).
蓖麻毒素毒性筛选
将突变细胞库暴露于致死剂量的蓖麻毒素中3周。纯化存活细胞的DNA，进行反向PCR并进行深度测序分析。为了使用shRNA敲除进行确认，细胞暴露于蓖麻毒素48小时，并使用FACS量化存活率。
