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《维罗尔杂志》。2004年5月；78(10): 5458–5465.
数字对象标识：10.1128/JVI.78.10.5458-5465.2004
预防性维修识别码：PMC400370型
PMID：15113924

表达丝状病毒和沙粒病毒糖蛋白的复制型水泡性口炎病毒载体的特性

迈克尔·加布特,1,† 瑞恩·利布谢尔,1,† 维多利亚·瓦尔-延森,1,2 史蒂文·琼斯,1,三 佩吉·莫勒,1,4 拉尔夫·瓦格纳,4 维克托·沃尔奇科夫,4,5 汉斯·戴特·克伦克,4 海因茨·费尔德曼,1,2,*和Ute Ströher1,2,*
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

产生并表征了表达几种病毒性出血热病原体（马尔堡病毒、埃博拉病毒和拉萨病毒）的I型跨膜糖蛋白和选定的可溶性糖蛋白的复制能力重组水泡性口炎病毒（rVSVs）。所有重组病毒均表现出杆状病毒形态，并在组织培养中进行了细胞溶解性复制。与带有额外转录单位表达可溶性糖蛋白的rVSV不同，携带外源跨膜糖蛋白替代VSV糖蛋白的病毒在生长过程中略有减弱。外源糖蛋白的生物合成和加工是真实的，细胞向性由跨膜糖蛋白定义。没有一种rVSV在动物中显示出致病潜力。表达扎伊尔埃博拉病毒跨膜糖蛋白的rVSV在小鼠中对致命的扎伊尔伊博拉病毒攻击起保护作用。我们的数据表明，重组VSV可用于研究病毒糖蛋白在病毒复制、免疫反应和发病机制中的作用。

病毒性出血热病毒是新出现和重新出现病原体的完美例子。不仅在这些病毒流行的发展中国家，而且在许多发达国家，感染都是严重的公共卫生问题。其中一些被列入A类生物恐怖分子名单（疾病控制中心，2003年，http://www.bt.cdc.gov/Agent/Agentlist.asp)从而对世界人口构成威胁。过去，对许多此类病原体（如拉萨病毒、马尔堡病毒和埃博拉病毒）的研究因其操作所需的生物防护措施，即生物安全等级4（BSL4）而受到阻碍。尽管这些病毒可以在组织培养中生长，但病毒传播相对较慢，并且滴度通常低于其他病毒病原体。

水泡性口炎病毒（VSV）是一种非片段化、负链RNA病毒，属于该家族鼠疫病毒科，属水泡病毒(27). VSV在哺乳动物和许多其他细胞类型中的简单结构和快速高滴度生长，使其在过去30年里成为分子和细胞生物学家青睐的工具，并且随着VSV反向遗传系统的建立，这一点得到了进一步加强(25). 以前曾报道过VSV对额外转录单位和基因的耐受能力(15,23,41). 这些特点使该系统适合研究外源可溶性和跨膜糖蛋白在感染性病毒颗粒中的作用。此外，VSV相对容易操作，一般来说，经典病毒学方法很容易应用。

VSV系统已经被用于产生假型病毒，以研究埃博拉病毒跨膜糖蛋白在细胞进入中的作用(17,18,47). 伪型粒子的使用仅限于一步感染，因此为真实的感染过程提供了一个糟糕的模型。复制竞争性重组VSV（rVSV）是研究体内外感染的一种更加可靠和强大的工具。这种重组病毒可能有助于克服与需要BSL4遏制的病毒合作所需的一些限制。

我们研究的目的是制备rVSV颗粒，表达来自选定BSL4因子的跨膜和可溶性糖蛋白，特别是丝状病毒（埃博拉病毒和马尔堡病毒）和沙粒病毒（拉萨病毒）。埃博拉病毒和马尔堡病毒是属于该家族的非片段化负链RNA病毒丝状病毒科(38). 跨膜糖蛋白的生物合成涉及一系列共翻译和翻译后事件，包括furin或furin样细胞蛋白酶的裂解(50,51). 裂解产生两个二硫键连接的亚基，GP1和GP2，其中GP2将分子固定在膜中。埃博拉病毒跨膜糖蛋白的表达需要转录编辑。未经编辑的转录产物产生非结构糖蛋白sGP，该糖蛋白由感染细胞广泛分泌(39,49). 丝状病毒感染期间产生的不同可溶性糖蛋白的作用目前尚不清楚，但它们可能干扰宿主防御机制(8,9,52).

拉萨病毒是这个家族的一员沙粒病毒科属于旧世界竞技场病毒(4). 它的二分、单链、负义RNA基因组是以双义编码策略组织的。较小的片段编码核蛋白和糖蛋白前体（GPC）(4). 裂解发生在内质网中，并由细胞枯草酶SKI-1/S1P介导(26). 沙粒病毒糖蛋白的一个特征是具有两个预测疏水结构域的异常长信号肽(三,7). 真实信号肽的存在是蛋白质加工和成熟的必要条件(6). 只有裂解的亚单位GP1和GP2在病毒颗粒上形成尖峰(26).

在这里，我们描述了含有来自上述丝状病毒和沙粒病毒的不同形式糖蛋白的几种rVSV颗粒的产生、特征和生物表型。首次尝试使用rVSV诱导小鼠对埃博拉病毒感染的保护，表明VSV平台作为可能的病毒性出血热疫苗载体具有潜在价值。

材料和方法

病毒库、细胞系和动物。

糖蛋白基因来源于扎伊尔埃博拉病毒Mayinga株，维多利亚湖马尔堡病毒（马尔堡病毒）、穆索克毒株和拉萨病毒，拉紧约西亚。VSV系统（印第安纳血清型）由耶鲁大学的J.Rose提供，并在前面进行了详细描述(25,42). VeroE6和293T细胞在含有青霉素（100 U/ml）、链霉素（100μg/ml）、，我-谷氨酰胺（2 mM）（均来自加拿大伯灵顿Invitrogen）和10%胎牛血清（FBS）（加拿大奥克维尔Sigma）。组成性表达噬菌体T7聚合酶的幼仓鼠肾细胞(2)（BSR-T7；由德国慕尼黑Pettenkoffer研究所的K.Conzelmann善意提供）保存在格拉斯哥最低必需培养基（MEM）中，该培养基富含5%的胰蛋白酶磷酸盐肉汤、G418（0.5 mg/ml）以及与上述相同数量的青霉素、链霉素、谷氨酰胺和FBS。Jurkat细胞在添加了与Vero E6和293T细胞相同数量的青霉素、链霉素、谷氨酰胺和FBS的RPMI 1640（美国型培养物收集）中培养。在动物实验中，我们使用了从Charles River Laboratories，Inc.（马萨诸塞州威明顿）购买的6周龄雌性BALB/c小鼠。

质粒构建。

前面描述了一种表达VSV基因组中带有外源基因表达位点的阳性RNA补体的质粒(42). 该质粒（VSVXN2）按顺序包含五个VSV基因（核蛋白N、磷酸蛋白P、基质蛋白M、糖蛋白G和聚合酶L），两侧是噬菌体T7启动子、VSV先导物、肝炎三角洲病毒核酶和T7终止序列。在G基因和L基因之间，存在一个独特的连接位点（XhoI-NheI），其两侧是要表达的额外基因的转录起始和终止信号（图。​（图1）。1). 扎伊尔埃博拉病毒可溶性糖蛋白（sGP）和较大切割片段（GP）的开放阅读框1)Marburg病毒的基因被克隆到VSVXN2载体的XhoI和NheI位点，其中包含插入另一个基因的转录起始和终止信号(42). 获得的质粒命名为pVSVXN2/MARVGP1和pVSVXN2/ZEBOVsGP。编码马尔堡病毒和扎伊尔埃博拉病毒（GP）以及拉萨病毒（GPC）跨膜糖蛋白的开放阅读框被克隆到缺乏VSV G的修饰全长VSVXN2ΔG载体的XhoI和NheI位点（图。​（图1）。1). 所得质粒分别称为pVSVXN2ΔG/MARVGP、pVSVX2ΔG/ZEBOVGP和pVSVXX2ΔG/LASVGPC。

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印第安纳州血清型VSV感染性克隆系统示意图。将BSR-T7细胞与含有VSV基因组（VSVXN2或VSVXN2ΔG）的质粒和表达VSV核蛋白（pBS-VSV N）、磷酸蛋白（pBS-VSV P）或聚合酶（pBS-VSV L）的质粒共转染。所有质粒的转录均受噬菌体T7 RNA启动子的控制。本研究使用质粒VSVXN2ΔG（A）将扎伊尔埃博拉病毒（ZEBOV GP）、马尔堡病毒（MARV GP）和拉萨病毒（LASV GPC）的糖蛋白插入VSV基质和聚合酶（L）基因之间。此外，扎伊尔埃博拉病毒sGP和马尔堡病毒GP1作为附加基因插入载体VSVXN2（B）。

重组VSV的转染和挽救。

BSR-T7细胞在6厘米的培养皿中生长到大约90%的汇合处。然后用编码病毒核糖核蛋白组分（0.5μg pBS-VSV N、1.25μg pBS-VSV P和0.25μg pBS-VSV L）的支持质粒和2μg编码上述五个重组基因组克隆之一的质粒将细胞转染到BSL2中。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行转染。由于目前对这些重组病毒的研究尚未分类（即所需的生物安全水平），我们立即将转染细胞转移到BSL4中。37°C下48小时后，将上清液盲传至VeroE6细胞（80%至90%融合液）。通过扫描VeroE6单分子膜的细胞病变效应，确认感染病毒的恢复。拯救的rVSV在VeroE6细胞上传代以获得病毒库。病毒存量在VeroE6细胞上进行斑块滴定。

免疫荧光分析。

在盖玻片上生长的VeroE6细胞被rVSV感染，感染倍数（MOI）为0.1。在37°C下吸附病毒1小时后，用含有2%FBS的DMEM替换接种物。细胞在感染24小时后用4%多聚甲醛在磷酸盐缓冲液（PBS）中固定过夜。在多聚甲醛发生变化后，从BSL4中取出细胞，并用γ射线照射（2×106rads）。灭活后，用PBS清洗细胞，并用0.1%Triton X-100在PBS中渗透15分钟。随后，用PBS清洗细胞三次，并在室温下用PBS中稀释的适当蛋白特异性抗体培养1小时。样品用PBS清洗三次，并用吲哚碳菁结合的抗物种特异性抗体孵育一小时（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories）。用PBS清洗三次后，用SuperMount（加州圣拉蒙市BioGenex）安装盖玻片，并用蔡司显微镜进行检查。

电子显微镜。

rVSV在VeroE6细胞中生长，通过超速离心从培养上清液中回收病毒粒子，并固定在2%多聚甲醛和0.5%戊二醛的溶液中。将固定的病毒悬浮液转移到涂有碳的铜电子显微镜格栅上。涂层格栅用袋子密封，并从BSL4中取出。对于灭活，按照上述方法对格栅进行γ射线辐照。用2%磷钨酸（pH 6.8）进行阴性染色1分钟。去除多余液体，并用透射电子显微镜检查格栅（德国耶拿蔡司）。

代谢标记、免疫沉淀和免疫印迹。

VeroE6细胞（6厘米培养皿）接种rVSV，MOI为10 PFU/细胞。1小时后用含有2%FBS的DMEM替换接种物。当Jurkat细胞（克隆E6-1，T细胞克隆）被感染时，对之前描述的方案进行了轻微修改(29)被使用。简而言之，细胞在室温下以10 PFU/细胞的MOI感染1小时，每10到20分钟轻轻混合一次。然后添加含有2%FBS的RPMI 1640培养基，并在37°C下继续培养1小时。然后在RPMI 1640中清洗细胞三次，在10时重新悬浮6细胞/ml，在含有2%FBS的培养基中，12孔培养皿中每孔1 ml。对于代谢标记实验，将细胞孵育24小时，用蛋氨酸和半胱氨酸缺乏的DMEM洗涤，在补充20μCi的相同培养基中脉冲标记30分钟[35S] 每毫升蛋氨酸-半胱氨酸，随后追逐240分钟。

对于切割抑制研究，感染细胞在饥饿、脉冲和追逐期间用浓度为25μM的癸酰化肽基氯甲基酮（decRVKR-cmk；Bachem Distribution Services GmbH，Weil am Rhein，Germany）培养。将标记细胞在4°C的共免疫沉淀缓冲液（1%Nonidet P-40、0.4%脱氧胆酸钠、5 mM EDTA、100 mM NaCl、20 mM Tris-HCl[pH7.6]、25 mM碘乙酰胺、1 mM苯甲基磺酰氟）中溶解，并通过γ射线（2×10）灭活6rads）。用蛋白特异性单克隆抗体（II9G4；见确认书）进行免疫沉淀。沉淀的蛋白质在还原条件下进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，10%凝胶），并通过荧光显示。为了进行免疫印迹分析，细胞在感染PBS后24或36小时清洗，并在SDS凝胶加载缓冲液中溶解。感染后12小时采集上清液，通过离心（8000×克，4°C，10分钟）与SDS凝胶负载缓冲液混合，并经γ辐照（2×106rads）。蛋白质通过SDS-PAGE（10%）分解并转移到聚偏二氟乙烯膜（Immobilon P；加拿大尼泊尔Millipore）。用上述适当的抗体检测外源蛋白的表达。

生长特性。

VeroE6和Jurkat细胞生长到80%融合或细胞密度为106分别在12孔培养皿的每孔培养基中，以10 PFU/细胞的MOI感染不同的rVSV。然后在DMEM中清洗细胞三次，最后添加1 ml含有2%FBS的新鲜培养基。在指定的时间点采集培养物（细胞和上清液），并在3000×克在4°C下保持5分钟。上清液储存在−80°C。通过定义50%的组织培养感染剂量（TCID）进行滴定50). 为此，将上清液稀释10倍，并用稀释液感染96周平板中的VeroE6细胞（每个稀释液五孔）。培养物在7天内定期进行细胞病变效应评分。采用Reed和Muench方法计算培养上清液的终点病毒滴度(32). 病毒滴度表示为对数10根据Karber和Spearman方法计算的传染性50%滴定终点(21,43).

rVSV感染和扎伊尔埃博拉病毒对小鼠的挑战。

6周龄雌性BALB/c小鼠组(n个=5）腹腔注射约2×104rVSV或γ射线照射的rVSV的PFU，还有一组未经治疗。感染rVSV后，每天检查小鼠的临床症状，并记录感染后前11天的体重。首次感染14天后，小鼠再次感染相同的rVSV。在首次感染后28天，所有小鼠都接受了1000 50%致死剂量的扎伊尔埃博拉病毒小鼠适应株的腹腔注射(1). 在挑战后的11天内，每天记录体重和临床症状。观察存活动物的时间是杀死对照组所需时间的三倍。所有动物工作都是根据加拿大动物护理委员会的指导方针和当地动物护理委员会批准的适当动物使用文件进行的。

结果和讨论

对VSV进行基因操纵的能力已经使人们对病毒基因的结构和功能以及VSV启动子元件和其他非编码元件的分析产生了各种新的见解(10,19,22,28,34,44). VSV基因组对外来转录单位和基因的耐受能力以及接受外来跨膜糖蛋白替代VSV G的能力，对于研究这些外来蛋白在病毒感染背景下的结构和功能非常有帮助(23,31). 此外，rVSV被调查为几种病毒的候选活病毒疫苗，如流感病毒、人类免疫缺陷病毒和牛病毒性腹泻病毒(14,33,36,37). 作为候选疫苗的潜力与VSV和rVSV在许多细胞系中的高滴度生长有关(20,23,25)，说明VSV在体内具有较强的细胞和体液免疫反应(11,24,53)以及人类VSV感染的正常无症状或轻度临床病程(35,48).

在本研究中，我们试图建立一个系统来表达和研究引起病毒性出血热的BSL4药物的可溶性糖蛋白和跨膜糖蛋白的功能。为此，我们修改了全长cDNA克隆（pVSVXN2），将VSV G基因替换为马尔堡病毒、扎伊尔埃博拉病毒和拉萨病毒的跨膜糖蛋白，或者生成编码扎伊尔伊博拉病毒sGP的新基因(39,49)或马尔堡病毒GP1(51)在VSV G和L基因之间（图。​（图1）。1). 将这些cDNA转染到BSR-T7细胞中，所有病例中的rVSV均被挽救。被拯救的病毒命名为VSVΔG/MARVGP、VSV△G/ZEBOVGP，VSV△G/LASVGPC、VSV/MARVGP1和VSV/ZEBOVsGP。

rVSV感染VeroE6细胞导致细胞病变效应（图。​（图2A），2安培)一般来说，这比感染真正的病毒性出血热病原体后观察到的细胞病变作用要早得多。细胞病变作用强，与野生型VSV相似，表明重组病毒复制相似。对负对比rVSV子代颗粒的电子显微镜研究表明，用外源跨膜糖蛋白替换VSV G和插入额外的基因对病毒粒子的形态没有影响（图。​（图2B）。2B型). 无论插入的糖蛋白如何，rVSV均表现出典型的子弹状弹状病毒形态，并含有一个电子密度高的子弹状核衣壳，核衣壳由一个包膜结合。病毒包膜上覆盖着由外源糖蛋白组成的表面突起，表明外源糖蛋白在组装中可以完全替代VSV G，并且不影响颗粒结构的形成（图。​（图2B2B型).

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获救rVSV的特征。使用挽救的rVSV感染VeroE6细胞，MOI为0.1 PFU/细胞。（A） 感染VSVΔG/MARVGP（下面板）后24小时的相控显微镜显示感染VeroE6细胞的细胞致病作用，与模拟感染培养物（上面板）相比。（B） 颗粒形态。电子显微照片显示野生型VSV（上图）和VSVΔG/MARVGP（下图）。（C） 用GP特异性单克隆抗体5EII（稀释度1:1000）对感染VSVΔG/MARVGP的VeroE6细胞进行免疫荧光染色（下表）。上面的面板显示了相同的细胞在明场显微镜下。（D） 增长曲线。VeroE6细胞被野生型VSV（VSVwt）、VSV/ZEBOVsGP、VSV/MARVGP感染1MOI为10时，VSVΔG/ZEBOVGP，VSV△G/LASVGP或VSV△C/MARVGP。在指定的时间收集上清液，并通过定义TCID进行滴定50.

在MOI为10的感染VeroE6细胞中，检测了重组病毒在一步生长条件下的复制。在不同时间采集上清液，并通过TCID测量病毒产量50.含有额外转录单位的重组病毒（VSV/ZEBOVsGP和VSV/MARVGP1)它们的生长动力学没有减弱，最大滴度发生在感染后大约8到12小时之间，正如野生型VSV所观察到的那样（图。​（图2D）。二维). 用VSV糖蛋白替代的rVSV，如VSVΔG/LASVGPC和VSV△G/ZEBOVGP，分别在感染后约24和36小时达到最大滴度，表明如果用外源跨膜糖蛋白替代VSV G，所有rVSV的滴度都会减弱。

先前的研究表明，有效的出芽需要VSV G的细胞质结构域的存在，但不需要特定的基序(40). 我们的结果表明，马尔堡病毒、扎伊尔埃博拉病毒和拉萨病毒糖蛋白的细胞质域为出芽提供了足够的信号。然而，如衰减生长动力学所示，这些信号似乎不太理想（图。​（图2D）。二维). 病毒滴度的降低也可以解释为外源糖蛋白的表达率降低或处理延迟，导致颗粒成熟度降低。

外源糖蛋白的生物合成和加工似乎以与感染真实病毒性出血热病毒期间相同的方式发生。免疫荧光染色检测到感染细胞表面的马尔堡病毒糖蛋白（图。​（图2C）。2摄氏度). 马尔堡病毒糖蛋白蛋白裂解为两个裂解片段GP1（160 kDa）和GP2（38 kDa），如图。​图3A。3A级当感染细胞被癸酰化肽基氯甲基酮decRVKR-cmk（一种枯草杆菌素样内蛋白酶furin的有效抑制剂）处理时，马尔堡病毒糖蛋白的裂解显著减少（图。​（图3A，3A级，车道2）(12,50,51).

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rVSV感染后表达的外源糖蛋白的生物合成。用MOI为10的rVSV感染VeroE6细胞。（A） 对于感染VSVΔG/MARVGP的细胞，在感染后24小时用20μCi的[35S] 用小鼠抗马尔堡病毒GP免疫球蛋白（II9G4）（稀释度1:800）从细胞裂解液中免疫沉淀GP特异性蛋白，并在还原条件下在SDS-10%PAGE上进行分析。在标记和追踪期间，decRVKR（25μM）的存在消除了前GP（车道2）的卵裂。（B） 对于感染VSVΔG/EBOVGP的细胞，在感染后24小时对细胞进行裂解，并用GP进行Western印迹分析1-稀释度为1:4000（车道1）和GP的特异性抗体2-1:2000稀释度的特异性兔抗血清（第2道）。（C） 对于感染VSVΔG/LASVGPC的细胞，在感染后24 h对细胞进行裂解，并用GP2特异性抗血清（稀释度1:2000）进行Western blotting分析。（D） 对于感染野生型VSV（VSVwt）（1道）、VSV/ZEBOVsGP（2道）和VSV/MARVGP的细胞1（第3条线），感染后12 h，用VSV G特异性抗体（稀释度为1:1000）、扎伊尔埃博拉病毒GP特异抗体（12/1.1；稀释度为1:4000）和马尔堡病毒GP对上清液进行免疫印迹分析1-特异性抗体（5EII；稀释度，1:4000）。

免疫印迹分析显示扎伊尔埃博拉病毒GP和拉萨病毒GPC的表达和蛋白水解过程。扎伊尔埃博拉病毒跨膜糖蛋白GP的两个裂解片段1（140k Da）和GP2（26k Da），用扎伊尔埃博拉病毒特异性抗血清和单特异性抗GP检测2血清（图。​（图3B）。3B公司). 图​图3C3C公司证明了拉萨病毒糖蛋白前体GPC（76 kDa）裂解为GP1（44 kDa。在这种情况下，使用针对GP2羧基末端的特异性抗血清进行检测。除了前体（未完全裂解）和GP2片段外，还检测到未知的10kDa片段，这需要进一步关注。rVSV可溶性糖蛋白的表达如图所示。​图3D。三维除VSV G外，VeroE6细胞感染野生型VSV后表达VSV G（图。​（图3D，三维，车道1），VSV/ZEBOVsGP（图。​（图3D，三维，车道2）和VSV/MARVGP1（图。​（图3D，三维，泳道3）、扎伊尔埃博拉病毒sGP和马尔堡病毒GP1在感染相应rVSV的细胞上清液中检测到（图。​（图3D，三维（分别为2号和3号车道）。

用外源糖蛋白替换VSV G会导致细胞向性的改变。因此，通过操纵糖蛋白，可以影响靶细胞的特异性。通过构建VSVΔG/GFP颗粒并辅以扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白和雷斯顿埃博拉病毒（英寸反式)测定不同细胞系的敏感性(18,47). 为了研究嗜细胞性的变化，我们使用了Jurkat细胞（人类T细胞白血病克隆）的感染，已知Jurkat对野生型VSV敏感，但对扎伊尔埃博拉病毒、马尔堡病毒或拉萨病毒不敏感(5,16,30). 野生型VSV在感染后8至12小时内达到最大滴度，其中VSVΔG/LASVGPC、VSV△G/ZEBOVGP和VSV△G/MARVGP未能在Jurkat细胞中复制（图。​（图4A；4A级; VSVΔG/MARVGP数据未显示）。这一结果通过免疫印迹试验得到了证实，免疫印迹实验的目标是在受感染细胞中产生VSV核蛋白，并在48小时内将病毒颗粒释放到培养基中。在感染VSVΔG/LASVGPC、VSVδG/ZEBOVGP或VSV△G/MARVGP的Jurkat细胞中未检测到病毒蛋白的产生（图。​（图4B；4B类; VSVΔG/ZEBOVGP和VSV△G/MARVGP的数据未显示）。携带额外转录单位的rVSV（VSV/ZEBOVsGP和VSV/MARVGP1)在Jurkat细胞中像野生型VSV一样复制（数据未显示）。因此，正如预期的那样，重组病毒的向性依赖于跨膜糖蛋白，并且不受额外转录单元表达的额外可溶性糖蛋白的影响。

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rVSV的细胞向性。在MOI为10时，Jurkat细胞被野生型VSV（VSVwt）、VSVΔG/LASVGPC或VSV△G/EBOVGP感染。（A） 病毒生产。通过测定TCID来测量VeroE6细胞中指定时间点的病毒滴度50/毫升。（B） 蛋白质表达。在指定的时间，收集细胞和上清液，用兔血清对VSV核蛋白（N）进行免疫印迹（稀释，1:2000），证明病毒生长。对照组包括模拟感染的Jurkat细胞（上面板）和VSVΔG/LASVGP感染的VeroE6细胞（下面板）。

具有复制能力的重组病毒的一个优点是其在体内的潜在用途，在体内需要多个复制周期。例如，这包括对宿主范围或器官嗜性的调查以及作为潜在疫苗载体的使用。为了确定体内致病性的变化，我们用野生型VSV和本研究中描述的每种不同rVSV对6周龄雌性BALB/c小鼠进行了腹腔感染。没有一只小鼠表现出体重减轻，这通常是症状感染的敏感指标，也没有出现任何临床症状（表​（表1）。1). 感染后3天未检测到病毒血症，这表明小鼠体内的病毒复制是短暂的，可能只发生在不易接近的特定位置。

表1。

VSV和vVSV的致病性

病毒出现症状的小鼠数量/组中的数量
首次感染后第二次感染后扎伊尔埃博拉病毒感染后挑战后第28天的幸存者人数平均死亡时间（天）
无（天真的控制）不适用一不适用4/40/45.8
野生型VSV0/50/55/50/55.5
VSVΔG/LASVGPC0/50/55/50/57.2
VSVΔG/MARVGP0/50/55/50/56.6
VSVΔG/ZEBOVGP0/50/50/55/5不适用
γ射线照射VSVΔG/EBOVGP0/50/55/50/57
VSV/ZEBOVsGP公司0/50/5不适用b条不适用不适用
VSV/MARVGP10/50/5不适用不适用不适用
一不适用。
b条N/D，未确定。

在提交发表的后续研究中（S.M.Jones、H.Feldmann、U.Ströher、J.B.Geisbert、L.Fernando、V.Volchkov、H.-D.Klenk、N.J.Sullivan、P.B.Jahrling和T.W.Geisber特），我们感染了豚鼠和非人类灵长类动物(束状猕猴)带有VSVΔG/ZEBOVGP和VSV△G/MARVGP。尽管在非人类灵长类动物中出现了低水平的短暂病毒血症（感染后第2天可检测到；感染后第4天无法检测到），但没有任何动物出现临床疾病迹象，也没有检测到病毒脱落。三种动物感染的结果表明，外源糖蛋白的掺入并没有改变野生型VSV的体内生物学表型。

进一步研究VSVΔG/ZEBOVGP对扎伊尔埃博拉病毒小鼠适应株致命攻击的潜在保护作用(1). 在一项包括每组五只动物的有限研究中，在用1000 LD攻击前，两次感染VSVΔG/ZEBOVGP可实现保护50小鼠适应菌株（表​（表1）。1). VSVΔG/MARVGP、VSV△G/LASVGP和野生型VSV感染均未产生保护作用，表明感染VSVδG/ZEBOVGP后出现特异性保护性免疫反应。与非受保护动物相比，在受保护动物的血液（无病毒血症）和器官中检测不到扎伊尔埃博拉病毒复制，这表明用VSVΔG/ZEBOVGP.Gamma-In-activated免疫后，该模型中的病毒完全受到保护VSVΔG/ZEBOVGP不能保护小鼠免受致命攻击，这表明需要病毒复制来诱导保护性免疫（表​（表11).

总之，我们产生了携带来自丝状病毒和砂状病毒的糖蛋白的具有复制能力的rVSV，以及携带用于表达可溶性丝状病毒糖蛋白的额外转录单位的病毒。所有重组病毒均表现出杆状病毒形态，并在组织培养中进行了细胞溶解性复制。携带外源跨膜蛋白的重组病毒，但没有携带额外转录单位的病毒在生长过程中被减弱。外源糖蛋白的合成和加工是真实的，细胞向性是由跨膜糖蛋白介导的。这些重组病毒在小鼠（本研究）、豚鼠和非人类灵长类动物中均无致病性(束状猕猴)（Jones等人，提交发表），以及VSVΔG/ZEBOVGP介导的小鼠对致命的扎伊尔埃博拉病毒挑战的保护。对小鼠的确切保护机制需要进一步表征。因此，这些rVSV代表了研究糖蛋白在体内外向细胞性、免疫反应和发病机制中的作用的优秀系统。小鼠的保护不一定预示着非人灵长类动物的保护，这是埃博拉病毒挑战实验的金标准(13). 尽管如此，我们仍被鼓励进一步开发rVSV，作为对抗埃博拉病毒的疫苗平台，从而替代目前存在的DNA原始-腺病毒增强和基于腺病毒的加速策略，这两种策略都显示了非人灵长类动物对致命的扎伊尔埃博拉流感病毒挑战的有趣保护(45,46).

致谢

我们感谢Daryl Dick对手稿的批判性审查。我们感谢John Rose（耶鲁大学）和Klaus Conzelmann（慕尼黑大学）分别为我们提供了水泡性口炎病毒反向遗传系统和BSR-T7细胞系。我们感谢Ayato Takada（东京大学）和Yoshihiro Kawaoka（威斯康星大学和东京大学）提供针对扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白的单克隆抗体（12/1.1），感谢Oliver Lenz（马尔堡大学）提供抗拉沙病毒GP2免疫球蛋白，感谢M.Hevey和A.Schmaljohn（美国。马里兰州德特里克堡陆军传染病医学研究所）提供针对马尔堡病毒糖蛋白的单克隆抗体（5EII和II9G4），并向Yan Li（加拿大卫生部国家微生物实验室）提供水疱性口炎病毒核蛋白抗血清。

这项工作得到了加拿大卫生研究院（MOP-43921）和德国联邦科学院（Deutsche Forschungsgemeinschaft）的资助。

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文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）