色素上皮衍生因子34聚体肽通过下调PDGF受体预防肝纤维化和肝星状细胞活化

动物治疗

实验程序由麦凯纪念医院审查委员会批准，并根据国家动物福利条例进行。为了诱导肝纤维化，6周龄雌性C57BL/6小鼠（每个实验条件6只小鼠）每周两次腹腔注射CCl₄溶液（5ml/kg体重，与橄榄油按1∶4比例混合）3周。随后，每周两次腹腔注射34肽和18肽，剂量为10 mg/kg，并持续注射CCl₄再坚持4周。

细胞分离、培养和治疗

与我们之前的研究一样，对原代大鼠HSC进行了分离和培养[11]简而言之，通过以下方法分离出原代大鼠HSC就地门静脉灌注来自雄性Sprague-Dawley大鼠肝脏的胶原酶（300–450 g）。然后通过Percoll密度梯度离心法纯化和富集HSC。细胞在补充有20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，并在6孔培养皿（Costar，Cambridge，MA）中培养。电镀24小时后，用PBS洗涤去除非粘附细胞和碎片，然后在10%FBS-DMEM中再培养6天。分离后2天，通过维生素A荧光验证细胞纯度约为95～98%。随后，将HSC在含有或不含PEDF肽的1%FBS-DMEM中培养2天，然后用于实验。

HSC-T6细胞在37°C的Waymouth培养基中生长，并在5%CO的增湿环境中添加10%FBS₂ [13]使用4.5 nM PEDF进行治疗，这是根据我们之前的研究确定的灭活HSC-T6细胞的最佳剂量[11]或PEDF衍生肽（100 nM，除非另有规定），在细胞转移至1%FBS培养基后进行。

Sirius-红色染色

在0.1%（w/v）的天狼星红（Sigma-Aldrich）苦味酸饱和水溶液中对脱蜡的肝组织切片染色1h，然后在0.01N乙酸中漂洗30min以去除未结合的染料。为了进行肝纤维化的半定量分析，在光学显微镜下从每张载玻片中随机选择10个区域，每个总面积的红色区域（mm²/毫米²)使用Image-Pro Plus 4.5.1系统进行测量。

BrdU标签

1×10⁵将原代大鼠HSC或HSC-T6细胞接种到FNC溶液（Athena酶系统，马里兰州巴尔的摩，美国）涂布载玻片上，与10%FBS培养基孵育1天，并暴露于添加PEDF或PEDF肽的1%FBS培养液中2天。然后将细胞暴露于含有20 ng/ml PDGF-BB的新鲜1%FBS培养基中一天，然后将BrdU（最终浓度，10µM）添加到培养物中2 h。用4%多聚甲醛固定后，在RT下用1 N HCl处理细胞1 h，然后在冷甲醇中暴露2 min，然后进行免疫荧光染色。

免疫荧光

用10%山羊血清和5%BSA在含有0.1%吐温-20的PBS中封闭去石蜡化的组织切片或4%多聚甲醛固定的原代大鼠HSC 1h。用抗α-SMA（1∶100稀释）、去氨蛋白（1∶100稀释）、PPARγ（1∶100稀释）和BrdU（1∶100稀释）的原代抗体在37°C下染色2h，然后在室温下用适当的罗丹明或FITC-结合驴IgG（1∶500稀释）孵育1小时（RT）。在室温下用0.33 mM罗丹明结合的卵磷脂（Sigma-Aldrich）检测1小时F-actin结构的变化。用Hoechst 33258（Sigma Aldrich，在三个不同腔室（～1×10）的十个随机选择的区域中计算BrdU阳性细胞的平均数量⁴单元格）。图像是使用蔡司浅荧光显微镜和CCD摄像头拍摄的，照片是使用Axiover软件拍摄的。

RNA提取和定量实时PCR

按照之前的描述进行了实验[14].特异PCR引物的序列为大鼠PPARγ（登录号：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AF156665”，“term_id”：“5107412”}}AF156665型)感觉，5′-cccaattggttgctattaca-3′、防感、，5′-ggacg凝集ctactttga-3′; 大鼠PDGFR-α（登录号：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“Z14118”，“术语id”：“56863”}}Z14118号)感觉，5′-ctcccaggcttctggt-3′、防感、，5′-aagagctggcagacgag-3; 大鼠PDGFR-β（登录号：｛“类型”：“entrez核苷酸”，“属性”：｛“文本”：“Z14119”，“term_id”：“56869”｝Z14119号)感觉，5′-gcggaagcgcatcatct-3′、防感、，5′-aatgaataggtcccagtccat-3; 大鼠GAPDH（登录号：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“X02231”，“term_id”：“56187”}}X02231型)感觉，5′-tgggagagctggtcatcaac-3′、防感、，5′-catcacccattgatctga-3; 小鼠α-SMA（登录号：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“X13297”，“term_id”：“49861”}}X13297型)感觉，5′-atgctctgggctctgtaag-3′、防感、，5′-tctggagacgtcccaggaga-3; 小鼠COL1A1（登录号：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“U38544”，“term_id”：“1052995”}}U38544型)感觉，5′-ctcatttgctctcc-3′、防感、，5′-ctccaaagactactcgg-3; 小鼠TGFβ1（登录号：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“M13177”，“term_id”：“201952”}}M13177型)感觉，5′-tgcgctttgcagattaaaaa-3′、防感、，5′-ctgccgtacaactccagtga-3; 小鼠PPARγ（登录号：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“U01841”，“term_id”：“454000”}}U01841号机组)感觉，5′-ccaagaataccaaagtgcga-3′、防感、，5′-tagaaggttcttcatgggcc-3′; 小鼠PDGF-A（登录号：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_008808”，“术语id”：“1388875914”}}NM_008808)感觉，5′-cgaagtcacagcat-3′、防感、，5′-gggctctcagacttgctcc-3′; 小鼠PDGF-B（登录号：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_011057”，“术语id”：“2292593697”}}NM_011057号)感觉，5′-gcaccgaaagtataagcaca-3′、防感、，5′-aaataaccctgcccacactc-3′; 小鼠PDGF-C（登录号：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_019971”，“term_id”：“1274096184”}}NM_019971号)感觉，5′-gaacagaacggagtgcaaga-3′、防感、，5′-atctcacacacacata-3′; 小鼠PDGF-D（登录号：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_027924”，“term_id”：“1270111465”}}NM_027924号)感觉，5′-aggagctgaagctgaaccaat-3′、防感、，5′-tcactgtcttccctgagctg-3′; 小鼠PDGFR-α（登录号：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_011058”，“术语id”：“1113820508”}}纳米_011058)感觉，5′-caaccctgagaccacaaatg-3′、防感、，5′-taatgggaagggagag-3′; 小鼠PDGFR-β（登录号：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_008809”，“术语id”：“226371751”}}NM_008809)感觉，5′-agcgaagtaggagagc-3′、防感、，5′-ggcaggattccgtgatgatg-3′; 和小鼠GAPDH（登录号：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_008084”，“术语id”：“2295558031”}}NM_008084号)感觉，5′-aacactttggcatgtggaa-3′、防感、，5′-gggcagccccacgccatca-3.

蛋白质印迹分析

将细胞刮入含有20 mm HEPES（pH 7.4）、1%十二烷基硫酸钠、150 mm NaCl、1 mm EGTA、5 mmβ-甘油磷酸、10 mm焦磷酸钠、10 mm氟化钠、100µM原钒酸钠、10µg/mL亮氨酸肽和10µ/mL抑肽酶的裂解缓冲液（150µL/35-mm孔）中。裂解产物通过SDS-PAGE溶解，电转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore，Bedford，MA），并进行免疫印迹分析。免疫印迹研究中使用的抗体包括I型胶原1A1、α-SMA、细胞周期蛋白D1、ERK1/2、Akt、PPARγ、LRP6、磷酸-LRP6、β-连环蛋白、非磷酸（活性）β-连环蛋白、PDGFR-α和PDGFR-β（1∶1000稀释）、p-ERK1/1和p-Akt（1∶500稀释）以及β-肌动蛋白（1∶5000稀释）。使用适当的IgG-HRP二级抗体和ECL试剂检测感兴趣的蛋白质。X射线胶片在GS-700型成像密度计上进行扫描（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室），并使用Labworks 4.0软件进行分析。为了定量，使用了至少三个独立实验的印迹。

PPARγ小干扰RNA（siRNA）治疗

大鼠LRP6 siRNA购自Cell Signaling Technology（#9834；SignalSilence®LRP6 siRNA I）。大鼠特异性β-catenin siRNA购自Santa Cruz Biotechnology（sc-270011）。从Dharmacon Research（科罗拉多州拉斐特）购买了四种大鼠PPARγsiRNA（SMART-pool）和一种物种特异性siCONTROL非靶向siRNA的混合物。在转染过程中，细胞生长到60%的汇合处，并根据制造商的说明，使用干扰素siRNA转染试剂（PolyPlus-transfection，San Marcos，CA）转染siRNA。siRNA的最终浓度为10 nM。siRNA转染后16小时，将细胞重新悬浮在新培养基中24小时恢复期。

34-me上调活化HSC中PPARγ的表达体内

为了探讨34-mer对肝纤维化的保护作用，我们研究了34-mer是否可以诱导活化的HSC中PPARγ的表达体内为了激活HSC，向小鼠注射CCl₄每周两次，共三周。随后，每2天向小鼠腹腔注射一次PEDF肽（34-mer或18-mer），持续一周。肝脏切片采用双重免疫荧光染色检测PPARγ（红色）和HSC标志物结蛋白（绿色）。如所示图2A在未经治疗的对照组肝组织中的结蛋白阳性HSC中检测到PPARγ标记。CCl公司₄治疗增加了HSC的数量，但只有少数HSC PPARγ染色阳性（淡红色）。34米处理部分恢复了这些结蛋白阳性HSC中PPARγ的表达。qPCR分析显示，与对照肽处理组相比，34米处理使PPARγmRNA水平增加了约2.8±0.6倍(图2B). Western blotting分析显示，服用CCl后，肝脏中PPARγ蛋白水平显著降低₄持续3周(图2C). 34米治疗1周后，PPARγ蛋白水平的下降显著逆转（约80%）。相反，对照肽没有这种作用。

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图2

34-mer诱导体内活化HSC中PPARγ的表达。

腹腔注射CCl诱导肝纤维化₄每周两次，共三周。然后每两天向小鼠注射一次PEDF肽，持续一周。(A类)四个独立实验的代表性图片显示通过结蛋白（绿色标记）、PPARγ（红色标记）和融合蛋白对HSC进行双重免疫荧光染色(黄色的; PPARγ阳性HSC）。原始放大倍数，×400。(B类)qPCR检测肝脏提取物中PPARγmRNA。相对mRNA表达水平归一化为GAPDH mRNA含量。数据代表三个独立实验，每组六只小鼠*P（P）<0.001与对照肽+CCl₄-治疗组。(C类)采集肝脏蛋白提取物，并用所示抗体进行western blot分析。显示了来自3个独立实验的代表性斑点和密度分析*P（P）<0.05与对照肽+CCl₄-治疗组。

PEDF与PDGF诱导的34米反向HSC激活

为了研究PEDF衍生的短肽是否保留灭活HSC的全长PEDF效应，在体外使用永生化大鼠HSC（HSC-T6细胞）和原代大鼠HSCs进行研究。用PEDF或PEDF衍生肽（34-mer和44-mer）预处理HSC两天，然后刺激PDGF一天。如所示图3PDGF刺激诱导HSC激活，其中细胞增殖和成纤维反应增加。与UT细胞相比，HSC-T6细胞暴露于PDGF后，α-SMA和COL1A1蛋白的诱导率分别为3.5±0.24倍和2.6±0.18倍(图3A和3B). 同样，与UT细胞相比，原代大鼠HSC暴露于PDGF后，α-SMA和COL1A1蛋白分别增加10.1±1.0倍和11.1±0.91倍(图3C和3D). 重要的是，PDGF诱导的α-SMA和COL1A1表达通过PEDF或34-me预处理显著降低；而44-mer预处理对原代大鼠HSC或HSC-T6细胞并没有这种作用。

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图3

PEDF和34-mer抑制PDGF诱导的HSC激活。

HSC-T6细胞(A和B)和原代大鼠HSC(C和D)未经处理或用PEDF或34-me预处理2天，然后用PDGF（20 ng/ml）刺激24小时。典型的western blot(A和C)和SD密度计分析(B和D)从3～4个单独的实验被显示*P（P）与UT细胞相比，<0.05（第1列）**P（P）与对照肽/PDGF处理的细胞相比，<0.05（第5列）。(电子)免疫荧光分析。F-肌动蛋白(红色)和α-SMA(绿色)在原代大鼠中，分别用罗丹明结合的卵磷脂和抗α-SMA抗体对HSC进行染色。用Hoechst 33258染色观察DNA。比例尺：20µM。原始放大倍数×400。来自三个独立实验的代表性图像。(F类)BrdU标记分析。BrdU阳性细胞(红色)免疫荧光显微镜（原始放大倍数×400）检测。所示变化代表三个独立实验的SD*P（P）与UT细胞相比<0.01**P（P）与对照肽/PDGF处理的细胞相比，<0.05。

我们进一步研究了HSC内的应力纤维结构，这是PDGF诱导HSC活化的特征[4]丝状肌动蛋白罗丹明-球蛋白染色和α-SMA免疫荧光染色。如中所示图3E与未经处理的细胞相比，PDGF处理的原代大鼠HSC细胞质中观察到丰富的F-actin和α-SMA染色。相反，PDGF对34-mer预处理的细胞没有这种作用，表明PDGF激活HSC被34-mer阻断。

PDGF还可以诱导HSC增殖，这从细胞周期中从G1期向S期过渡的关键调节因子cyclin D1的增加可以看出。PEDF和34-me也降低PDGF诱导的细胞周期蛋白D1蛋白水平(图3A–3D). 这一发现表明，PEDF和34-mer均可抑制PDGF诱导的HSC增殖。HSC增殖也通过BrdU脉冲标记法的DNA合成进行研究。在未经处理的（UT）细胞中发现约3%的BrdU阳性原代大鼠HSC。UT细胞暴露于PDGF后，BrdU阳性率增加了4.6±1.2倍（UT/PDGF；图3F). 然而，PEDF和34-me处理的细胞暴露于PDGF后，BrdU阳性细胞分别增加了1.8±0.19倍和0.88±0.17倍。这表明PDGF的有丝分裂活性受到PEDF或34-mer预处理的抑制。另一方面，用44米对照肽预处理未能抑制PDGF诱导的细胞增殖。采用台盼蓝排除试验排除PEDF/34-mer对原代大鼠HSC的细胞毒性作用导致细胞增殖减少的可能性（数据未显示）。总的来说，PEDF及其34米肽可以阻止PDGF诱导的原代大鼠HSC和HSC-T6细胞的活化和增殖。

34-mer上调HSC-T6细胞PPARγ表达并降低β-catenin蛋白

研究了34-mer诱导HSC-T6细胞PPARγ基因表达的能力。在用50–200 nM的34聚体刺激24小时后，qPCR分析显示PPARγmRNA水平以剂量依赖性的方式增加（1.6±0.19倍至2.3±0.49倍；图4A). 此外，放线菌素D预处理完全阻断了34-me介导的转录诱导，表明mRNA浓度的增加依赖于转录。刺激48小时后，34-me也以剂量依赖性的方式增加PPARγ蛋白水平，通过western blotting检测（1.6±0.37倍至2.8±0.30倍；图4B).

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图4

34-mer通过抑制Wnt信号传导诱导PPARγ表达。

(A类)qPCR检测。用不同剂量的34-mer处理细胞24小时，或用5 ng/ml放线菌素D（Act D）预处理细胞1小时，然后用34-mer再培养24小时。显示了三次重复实验中PPARγmRNA的平均水平*P（P）与UT细胞相比<0.005**P（P）<0.005对100 nM 34米处理细胞。（B） 将HSC-T6细胞在指定浓度下用34-mer处理48 h，并用所示抗体通过western blot分析检测蛋白质。图中显示了三个独立实验的代表性斑点（面板下方）和SD密度分析（上图）*P（P）与UT细胞相比<0.05。34-mer抑制β-catenin蛋白的表达。将HSC-T6细胞暴露于34-mer或IWR-1中48小时，然后使用所示抗体制备总细胞裂解物进行免疫印迹。代表性斑点(C类)用SD进行密度分析(天)从四个单独的实验中显示*P（P）与未经处理的细胞相比，<0.01**P（P）与未经处理的细胞相比，<0.05；(电子)将HSC-T6细胞暴露于34-mer或IWR-1中48 h，然后制备核提取物，并进行核β-catenin和PPARγ的western blot分析。相对核蛋白表达水平归一化为组蛋白H1。来自两个独立实验的代表性印迹。(F和G)β-catenin siRNA或LRP6 siRNA抑制Wnt信号上调HSC-T6细胞中PPARγ的表达。用β-catenin、LRP6 siRNA或对照siRNA转染细胞16 h，使其在完全培养基中再恢复48 h，然后收获用于western blot分析。“Mock”表示细胞仅用转染试剂处理。来自三个独立实验的代表性斑点。(H（H）)用指定浓度的Wnt3a处理HSC-T6细胞1h，并用LRP6活性磷酸化形式和活性β-连环蛋白抗体通过western blot分析检测蛋白质。通过用抗LRP6或β-肌动蛋白抗体重制膜，证实了蛋白质负载量相等。显示了三个独立实验的代表性斑点。(我)34-mer抑制Wnt3a诱导的LRP6磷酸化和活性β-catenin的形成。用Wnt3a处理HSC-T6细胞，或在指定浓度下与Wnt3a和34-mer/44-mer共同处理1 h，然后用所示抗体通过western blot分析检测蛋白质。图中显示了三个独立实验的代表性斑点（左面板）和密度分析（右图）。*P（P）与Wnt3a处理的细胞相比，<0.005；**P（P）与Wnt3a处理的细胞相比，<0.01。

Wnt/β-catenin信号通路通过下调PPARγ表达的机制与维持HSC激活相关[15],[16]34mer诱导PPARγ表达的一种可能的机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin。Western blot分析显示，34-mer治疗显著降低HSC-T6细胞中总β-连环蛋白和活性β-连环素蛋白的表达，而PPARγ蛋白水平增加约2.3倍(图4C和4D). Wnt拮抗剂IWR-1也有类似的效果(图4C和4D). 34mer或IWR-1处理后α-SMA蛋白水平的降低支持了HSC-T6细胞活化被抑制的结论。如免疫印迹所示图4E34-mer或IWR-1治疗导致核β-catenin水平下降，表明β-catentin介导的转录受到抑制。为了研究β-连环蛋白对PPARγ表达的特异性影响，用β-连环素特异性siRNA转染HSC-T6细胞。Western blotting证实了siRNA的功能，β-连链蛋白的蛋白水平显著降低(图4F，印记1）。重要的是，与模拟或对照siRNA转染相比，β-catenin siRNA处理显著增加了PPARγ蛋白的表达（blot 2）。这些结果证实了β-catenin在抑制HSC PPARγ表达中的重要性。

Wnt诱导的LRP6-Frizzle受体二聚化是典型Wnt信号传导的关键步骤，促进LRP6磷酸化以启动β-catenin介导的信号传导[17]这增加了LRP6在抑制HSC中PPARγ表达中发挥作用的可能性。为了解决这个问题，我们分析了LRP6 siRNA对HSC-T6细胞PPARγ去表达的影响。如所示图4G与模拟或对照siRNA转染相比，siRNA转导导致LPR6蛋白表达显著降低，PPARγ表达增加。这表明LRP6参与了Wnt介导的HSC PPARγ抑制。综上所述，这些结果表明Wnt信号通路的阻断可能是HSC PPARγ诱导过程中的一个重要分子事件。我们使用针对活性磷酸化形式LRP6（p-LRP6）和活性β-catenin的抗体，通过western blot分析，研究Wnt3a是否影响HSC-T6细胞中的Wnt信号传导。在用0.8-5 nM的Wnt3a刺激1小时后，p-LRP6水平以剂量依赖的方式增加（1.5±0.14倍至3.6±0.31倍；图4H). 同时，Wnt3a还以剂量依赖性的方式增加活性β-连环蛋白水平，通过western blotting检测（1.7±0.26倍至2.4±0.27倍）。接下来我们分析了34-mer能否阻止Wnt3a诱导的LRP6磷酸化。HSC-T6细胞与34-mer（50nM或200nM）和Wnt3a（2.5nM）共培养1h，western blot分析显示，34-mer几乎完全消除了Wnt3a-诱导的LRP6磷酸化和活性β-catenin形成。44米对照肽没有这种作用。总之，这些结果表明，34-mer通过干扰Wnt诱导的LRP6磷酸化的机制抑制Wnt/β-catenin信号。

PEDF与HSC-T6细胞中34-mer下调PDGFR表达

肝损伤引起的HSC激活是一个渐进过程，HSC中PDGF受体的表达是HSC扩张所需的早期事件之一[18]。如所示图5AqPCR分析显示，HSC-T6细胞表达PDGFR-α和–βmRNA的基本水平（设为100%），与对照组相比，暴露于PEDF和34-mer 48h后，PDGFRαmRNA的水平分别显著降低至55.5±4.94%和18.0±5.49%。同样，PEDF和34-mer分别将PDGFR-βmRNA水平抑制至59.0±7.47%和13.3±2.66%。相反，44米对照肽没有这种作用。Western blotting结果显示，HSC-T6细胞暴露于50–200 nM 34-mer的环境中48小时，PDGFR-α和–β蛋白水平呈剂量依赖性降低(图5B)，100 nM 34-mer是抑制PDGFR-α和–β蛋白表达的有效剂量。

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图5

PEDF和34-mer抑制HSC-T6细胞中PDGFR的表达。

(A类)qPCR检测。在提取RNA之前，HSC-T6细胞在1%FBS培养基中培养2天（UT）或添加PEDF、34-mer或44-mer的1%FBS介质中培养2天后。周期阈值(计算机断层扫描)使用PDGFR-α和–βmRNA的值和对照GAPDH mRNA计算样本间mRNA的相对数量。显示了三次重复实验的PDGFR-α和–βmRNA的平均水平**P（P）与44米对照肽处理细胞相比，<0.002。(B类)将HSC-T6细胞在指定浓度下用34-mer处理48 h，并用所示抗体通过western blot分析检测蛋白质。显示了三个独立实验的代表性斑点。

PEDF抑制PDGF诱导的ERK和Akt磷酸化

PDGF诱导的ERK和Akt磷酸化被认为是导致HSC有丝分裂的重要步骤[6],[19]。如所示图6A用PDGF处理HSC-T6细胞5～40分钟后，磷酸化ERK2（p-ERK2；MW 42 kDa）和p-Akt出现5分钟。ERK2和Akt的磷酸化峰值出现在5～10分钟之间。总ERK1/2或Akt没有明显变化。

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图6

PEDF和34米预处理抑制PDGF信号。

(A类)PDGF诱导HSC-T6细胞ERK和Akt磷酸化。细胞在1%FBS培养基中培养2天，然后暴露于含有PDGF的新鲜无血清培养基中，持续指定的时间。Western blotting用于检测ERK（p-ERK）和Akt（p-Akt）的活性磷酸化形式，如上图所示。通过用总ERK和Akt抗体重制膜以作为负荷控制，证实了蛋白质负荷相等。显示了三个独立实验的代表性斑点。(B类)用PEDF或34-mer处理HSC-T6细胞可防止PDGF诱导的ERK和Akt磷酸化。HSC-T6细胞未经处理或用PEDF或34-mer预处理2天，然后用PDGF刺激指定的时间段。收获细胞并用针对ERK1/2和Akt的磷酸特异性抗体进行蛋白质印迹分析。(C和D)对三份印迹进行密度扫描后，p-ERK2和p-Akt的值分别归一化为总ERK2与Akt**P（P）与对照肽→PDGF处理的细胞相比，<0.05。

通过western blotting检测PDGF诱导的PEDF和34m处理细胞中p-ERK和p-Akt的水平(图6B). PEDF或34米预处理显著阻止p-ERK2和p-Akt的诱导。在所研究的任何时间段内，44-mer预处理对PDGF诱导的p-ERK2和p-Akt水平均无显著影响。与对照细胞（设为100%；图6C). 与对照细胞相比，PEDF和34-mer部分阻断PDGF诱导的Akt磷酸化5分钟（32.0±3.4%和15.5±1.9%）或10分钟（35.8±2.6%和13.3±1.9%(图6D).

我们感谢蒂姆·J·哈里森博士的亲切阅读。我们感谢Chu Ping Ho和Chin Min Wang在蛋白质印迹和qPCR实验方面的支持。