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格利亚。作者手稿；PMC 2015年3月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
格利亚。2014年3月；62(3): 411–427.
2014年1月10日在线发布。 数字对象标识：10.1002/glia2.22613
预防性维修识别码：项目经理3991476
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院558160
PMID：24415225

DNA甲基化在中枢神经系统发育过程中作为Kir4.1表达的关键调节器发挥作用

Sinifunanya E Nwaobi公司,艾丽卡·林,Sasank R Peramsetty公司、和米歇尔·奥尔森
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

Kir4.1，一种胶质特异性K+通道对正常的中枢神经系统发育至关重要。利用Kir4.1的全局和胶质特异性敲除进行的研究表明，中枢神经系统发育异常，通道丢失。具体而言，Kir4.1基因敲除动物的特征是共济失调、严重髓鞘减退和出生后早期死亡。此外，Kir4.1已成为几种中枢神经系统疾病的关键参与者。值得注意的是，Kir4.1蛋白表达降低发生在一些人类中枢神经系统疾病中，包括中枢神经系统缺血性损伤、脊髓损伤、癫痫、ALS和阿尔茨海默病。尽管Kir4.1在正常和病理条件下具有新的意义，但其调节机制尚不清楚。这里我们报道了第一个K的表观遗传调控+中枢神经系统中的通道。大鼠Kir4.1表达的强大发育上调与Kir4.1基因的DNA甲基化降低一致，KCNJ10型染色质免疫沉淀显示KCNJ10型和DNA甲基转移酶1。最后，去甲基化KCNJ10型启动子是转录所必需的。这些发现表明DNA甲基化是Kir4.1转录的关键调节器。鉴于Kir4.1在正常中枢神经系统发育中的重要作用，理解这种K+通道的调节对于理解正常神经胶质生物学至关重要。

关键词：星形胶质细胞，表观遗传学，发育

介绍

Kir4.1，一种内在修复K+通道，在一些大胶质细胞群中表达，包括放射状胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和NG2+少突胶质前体细胞（OPC）(Kofuji等人，2002年;Kofuji等人，2000年;Poopalasundaram等人，2000年;Higashi等人，2001年;Maldonado等人，2013年;Neusch等人，2001年). 虽然Kir4.1在成年期的所有上述细胞类型中都表达，但在发育过程中，Kir4.1的表达从少突胶质细胞显著转移到星形胶质细胞(Kalsi等人，2004年a)以及在产后第四周和第五周OPC上调(Maldonado等人，2013年). 这些表达方式的变化被认为反映了渠道功能需求的变化(Higashi等人，2001年;Maldonado等人，2013年;Kalsi等人，2004年a). 关于星形细胞，许多研究强调了Kir4.1在调节包括K在内的多种星形细胞功能中的重要性+缓冲、谷氨酸吸收和水分调节(Seifert等人，2009年;Olsen等人，2006年;Kofuji等人，2000年;Neusch等人，2006年;Haj-Yasein等人，2011年;Kucheryavykh等人，2007年;Djukic等人，2007年;Connors和Kofuji，2006年;Pannicke等人，2004年;Dibaj等人，2007年). 药物抑制、敲除或完全敲除该通道会导致星形胶质细胞膜阻力增加、静息膜电位去极化和细胞外钾动力学改变(Kucheryavykh等人，2007年;Djukic等人，2007年;Chever等人，2010年;Olsen等人，2006年;Seifert等人，2009年;Kofuji等人，2000年;Haj-Yasein等人，2011年). [K失调后+]e（电子），Kir4.1 KO动物患有共济失调、癫痫发作和出生后早期死亡(Neusch等人，2001年). 强调了Kir4.1广泛的胶质特异性表达的重要性，该通道的敲除也影响少突胶质细胞的成熟并导致脊髓髓鞘减退(Neusch等人，2001年). 该通道的功能缺失突变是SESAME综合征的病因。这些患者表现出几种神经功能缺陷，包括：；早期发作的癫痫发作、严重的认知缺陷、运动性肢体无力、共济失调和感觉神经性耳聋暗示该通道在大脑发育中起着重要作用(Bockenhauer D等人，2009年;Scholl UI等人，2009年). 除了在中枢神经系统正常发育和神经胶质细胞生理学中的作用外，基因连锁分析、突变筛查和各种损伤范式将Kir4.1与广泛的中枢神经系统疾病联系起来，包括癫痫、自闭症谱系障碍、多发性硬化和中枢神经系统损伤(Ferraro等人，2004年;Buono等人，2004年;Lenzen等人，2005年;Sicca等人，2011年;Srivastava等人，2012年;Stewart等人，2010年;D'Ambrosio等人，1999年;Olsen等人，2010年). 尽管Kir4.1在正常和病理状态中发挥着重要作用，但没有关于其调节的信息。

表观遗传学是指DNA和染色质的修饰，改变基因表达，而不改变序列(伯德，2002). DNA甲基化是通过细胞分裂维持DNA甲基化模式而调控基因表达的一种遗传机制(伯德，2002). 尽管DNA甲基化看起来是永久性的，但它会根据暴露和经验发生变化。例如，神经表观遗传学的新兴领域强调了DNA甲基化在学习和记忆中的作用。研究表明，在经历早期逆境的啮齿动物中，BDNF的恐惧条件作用和超甲基化后，BDNF-、reelin和PP1基因的DNA甲基化发生改变（对学习和记忆过程都至关重要）(Miller和Sweatt，2007年;Lubin等人，2008年;Roth等人，2009年). Perisic最近进行的一项研究等。，证明GLT-1是主要的星形细胞谷氨酸转运体，通过DNA甲基化进行调节，突显了DNA甲基化在非神经元基因中的作用(Perisic等人，2012年). 有趣的是，中枢神经系统具有最高水平的DNA甲基化，并在出生前和出生后的发育过程中显示出DNA甲基化的强大和动态变化(Tawa等人，1990年;Ono等人，1993年). 我们的团队试图探索Kir4.1是否通过表观遗传机制，特别是DNA甲基化，对中枢神经系统的正常和病理状态起着关键作用。

这里我们显示Kir4.1表达的发育增加与Kir4.1基因的DNA甲基化减少一致。此外，我们发现DNA甲基转移酶1（DNMT 1）通过细胞分裂维持甲基化模式，在发育过程中与Kir4.1基因表现出动态相互作用。最后，我们表明，去甲基化的整体状态可以驱动Kir4.1转录，而启动子的完全甲基化导致启动子活性降低。总之，这些结果表明Kir4.1的表达受DNA甲基化的调控。

材料和方法

动物

所有动物均按照美国国立卫生研究院指南进行处理。阿拉巴马大学伯明翰分校动物护理和使用委员会批准使用动物。出生后0至28岁的Sprague-Dawley（SD）大鼠为混合性别。性成熟后，只使用雄性SD大鼠进行组织采集。用于Itakura产生的荧光激活细胞分选实验（FACS）的eGFP-S100β大鼠等，al(Itakura等人，2007年).

免疫印迹和定量实时PCR（qRT-PCR）

Sprague-Dawley大鼠在二氧化碳暴露下被安乐死。斩首后，解剖大脑皮层、海马、小脑、脑干和脊髓。蛋白裂解物通过使用玻璃浆液均质器在RIPA缓冲液（10%SDS，10%Tris缓冲液，双蒸馏水中pH 7.5）中均质制备，然后在70%条件下进行2轮超声处理10秒。将裂解液在12000 rcf下旋转5分钟。蛋白质浓度通过BCA分析（Thermo Scientific）测定。将10μg蛋白质加载到Biorad小型蛋白TGX 4-20%预制凝胶上并进行分解。蛋白质在100V下转移到PVDF膜上60分钟。用TBS-T中10%的牛奶封闭膜。然后用一级抗体探测斑点，冲洗，然后用结合辣根过氧化物酶的二级抗体探测。Millipore Luminata经典Western HRP基板用于放射自显影胶片上的可视化。利用Image J软件进行密度分析。使用GAPDH计算相对密度以归一化数据。对于qRT-PCR，使用Qiagen All-Prep DNA/RNA Mini Kit连续分离总mRNA和基因组DNA。使用Invitrogen Superscript VILO cDNA合成试剂盒将1000 ng mRNA转化为cDNA。cDNA用DEPC处理过的水稀释1:3。应用生物系统公司Taqman探针与Taqman Universal Mastermix II一起使用，无UNG。qPCR在Applied Biosystems StepOne和Applied Biosystems 7900HT上进行。循环参数为：50℃2 min，95℃10 min，40次重复95℃15 s，60℃1 min。Gapdh被用作看家基因。ΔΔCt法测定mRNA的相对折叠表达。

免疫组织化学

用腹腔注射氯胺酮（100mg/kg）麻醉eGFP-S100β动物，并用4%多聚甲醛溶液灌注25分钟。去除皮层并将其储存在4%的多聚甲醛中。在磷酸盐缓冲盐水中清洗后，使用振动仪（牛津仪器）切割100μM切片。切片在10%山羊血清和0.2%Triton-X100磷酸盐缓冲液（BB）中封闭1h。一级抗体（GFAP，Millipore）用磷酸盐缓冲盐水在BB 1:3中稀释。切片与一级抗体在4°C温和搅拌下孵育过夜。然后将切片在稀释的磷酸盐缓冲盐水中清洗三次，将其与从分子探针获得的四甲基罗丹明异硫氰酸盐结合二级抗体在室温下孵育60分钟。用稀释的BB清洗切片两次，然后用4'6-二氨基-2-苯基吲哚（10-4mg/mL；Sigma），最后用磷酸盐缓冲盐水清洗两次，然后安装到玻璃盖玻片上。使用蔡司LSM 510 Meta Confocal获得荧光图像。

荧光活化细胞分选（FACS）

eGFP-S100β动物在30秒的二氧化碳暴露下短暂麻醉并斩首。使用木瓜蛋白酶分离系统（沃辛顿生物化学公司）解剖并分离皮层组织。简单地说，在剥离皮层组织后，将组织切成小块，放入木瓜蛋白酶溶液中（37°C下热活化，与95%的O平衡）2：5%一氧化碳2)孵育15分钟。使用10mL移液管研磨组织。细胞悬液在室温下以300×g离心5分钟。将细胞颗粒重新悬浮在DNA酶/蛋白抑制剂溶液中，然后将其添加到蛋白抑制剂溶液的顶部，以形成不连续的密度梯度。悬浮液在室温下以70×g离心6分钟。丢弃上清液，将颗粒细胞重新悬浮在含有0.02%牛血清白蛋白和1mg/mL DNase I的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中。在Becton Dickinson FacsAria II上对细胞进行分类。用488nm激光激发eGFP。在正向散射/侧向散射（FSC/SSC）图上可以看到两个不同的种群。经过反复试验，SSC轴上较低的人群被确定为目标人群。在这些人群中，我们对GFP+细胞进行了分类。将分离的星形胶质细胞在2000 rcf下在4°C下旋转5分钟，以使细胞颗粒化。使用Qiagen All Prep DNA/RNA Mini Kit提取RNA和DNA，并分别通过qRT-PCR和焦磷酸测序进行分析。

甲基化敏感性-高分辨率熔体分析（MS-HRM）

使用Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit分离总基因组DNA。使用酵母菌EZ DNA甲基化试剂盒将来自发育样品和甲基化标准物0-100%（EpiGenDx）的1000ng gDNA转化为亚硫酸氢盐。使用纳米滴对转化DNA的浓度进行量化，并将每个样品的浓度调整为20ng/uL。利用Applied Biosystems MeltDoctor Mastermix扩增亚硫酸氢盐转化的DNA。PCR引物经验证，产品经1%琼脂糖凝胶验证(表1). 在Applied Biosystems 7900HT上进行PCR扩增和熔融曲线。循环条件为：95°C 10分钟，重复40次95°C 15秒，60°C 1分钟。熔化曲线参数为：95°C 10秒，60°C 1分钟，95°C 15秒（1%爬升率），以及60°C 15秒钟。将0-100%范围内的大鼠甲基化标准品与发育样品一起使用。在放大和生成熔体曲线后，提取数据并导入Applied Biosystems HRM软件2.0.2版。在熔体转变开始时设置启动前和启动后参数，并彼此相隔约0.2至0.5°C；停止前和停止后的参数设置类似。使用软件算法观察变量调用。从甲基化标准和未知样品中提取峰值温差数据。使用甲基化标准品的线性回归计算未知物的估计甲基化百分比。证明甲基化百分比估计低于零的样品被绘制为零。

表一

用于MS-HRMA的底漆

列出了用于MS-HRMA的底漆。列出了每个扩增产物中靶向的CpG位点。

目标CpG站点正向底漆反向底漆
1到55’TTGTAGGTAGAGAGTGTTTGT 3’5“AAACTCTAACATCCCRTACATT 3”
6至115'TTAGGAATTTTAGGTGAATTAGGTTAAGG 3'5“CCTATCAAAAAATAAAAAAAAACCAAAAAC 3”
12至205’TTTGGTTTTTTTTTGATAGGG 3’5“ACATCCRAAAACTAAATCCA 3”
21至25（NT）
26至345’AATTTTTAGGTTYGGGTTTG 3’5’CCCTCCCTACAATAAA 3’
35至435’TTGGTTTTGTATTTAGAGGG 3’5’AAACTCTTAACCCCCAACTAA 3’
44至51（新界）
52至535“ATTTGGATATAAAGGTGGAA 3”5“ACTACCCCTTTAATTCTCC 3”
64至655’CCCTTCTCTAAAAAAAATTTCTCTCT 3’5’TTAGTTGAGAGAAAAGTGGTA 3’
66至675’ATGGTGAAAAAGAGAGTTGATT 3’5’AAATTCCCCTCTACCTCTTAA 3’
68至705“GGAATGTGTTAGGATTGTA 3”5'CTTTACCTCTCTCTACAAAA3'
71至735’AAATTCTCCTACTACAAAAA 3’5'agtagatgtttttttgttttttt3'
74至785’TTGTTTTGTTTTTTGTAGATGA 3’5’CTTTTATCAAAACCCTCCTC 3’
79至845’CTCCTCCCAAAACTTTC 3’5’AAAA-CAAAATACCTACAAAAT 3’
85至87（NT）

焦深测序

扩增引物在正向或反向引物上设计生物素标签，用于扩增应用生物系统7900HT上的亚硫酸氢盐转化DNA(表2). 循环条件与HRM实验中描述的条件相同。将5μL每个扩增PCR产物固定在70μL 1X结合缓冲液（pH 7.6）（10mM Tris、2M氯化钠、1mM EDTA和0.1%吐温20）和Streptavidin Sepharose™高性能珠（GE healthcare）中。然后使用PyroMark™真空制备工作站对所得混合物进行处理。将加工好的珠子和单链DNA分别放置在1X退火缓冲液（20mM Tris和2mN四水合醋酸镁）和特定测序引物（20 pmole/μL）的溶液中，以分别用于扩增PCR引物(表2). 使用PyroMark™HS96测序器（Qiagen）和Pyro马克MD软件进行焦磷酸测序反应和序列分析。甲基化标准物与所有样品一起运行，作为焦磷酸测序的对照。除CpG位点54-63和CpG部位85-87外，所有标准物在所有分析区域的预期甲基化百分比的+/-5%范围内，这两个位点的甲基化程度高于预期（>+/-5%）。

表二

用于焦磷酸测序的引物

列出了用于PCR扩增和焦磷酸测序的引物。生物素标记的引物用“biosg”表示。每个测序引物的靶位点以粗体列出。请注意，根据反应是正向还是反向，将按照表中列出的正向或反向顺序读取位点。

CpG站点扩增引物测序引物：靶向位点
1到5F： 5’TTTTAGGTGAAGTTGTTAGGT 3’5“AGGTAGAGATGGTTTTGTA 3”：1、2、3
R： 5'/5biosg/TCCCRTACAATTCTCCAAATTTT 3'5“TATATAGGGAATAA 3”：4、5
6至11F： 5’TTAGGAATTTTAGGTGAATTAGGTTAAGG 3’5“AGGTTAAGTTTGTTATAG 3”：6、7
R： 5'/5biosg/CCTATCAAAAAAAAAA AAAAAAAC 3'5“ATTAATTGGTTTTAGT 3”：8、9、10、11
12至25没有针对性没有针对性
26-34F： 5'/5biosg/TGTATTTATTTTTTTTATTTTTAGG 3'体重5’TTTTT AGGTTYGGGTTTGGTG 3’：28，29
（26；27；30-34无目标）R： 5'/5biosg/CCCTCCCTACAATAAAA 3'
35至43F： 5'/5-biosg/TTGGTTTTGTATTTAGAGGG 3'5“GGTTTTAATTTTTTTT 3”：35、36、37、38、39、40
R： 5’/5’biosg/AAACTCTTAACCCCACACTAA 3’5“GTTTTYGGTYGGTTYGATTT 3”：41、42、43
44至49F： 5'agttggggtttaagagtttggg3'5“GGTTTGGTTAGTGGTTATAGT 3”：44、45、46
R： 5’/5’biosg/AAAACCCTTCCCAAAAAAAATCC 3’5’GGTTTGGTTTTATTTATTATTAG 3’：47，48
5’GGTTTTAGGAAAAGTTGTTTGG 3’：49，50
51F： 5'/5biosg/GGGAAGGGTTTTTATTAAGAGG 3'5“AATAAAAAACCTAAAAAC 3”：51
R： AACCCCATACACTACAAATAC 3’
52至53F： 5“ATTTGGATATAAAGGTGGAA 3”5“TGATTGTGGAGATTGG 3”：52、53
R： 5'/5biosg/ACTACCCCTTTAATTCTCC 3'
54至63F： 5'标签3'5“TGAGAATTAAAGGGGTAGT 3”：54、55、56、57
R： 5’/5’biosg/AACTCTATTCCCACTAACCAAC 3’5'TYGTGYGTTYGAGYGTG 3':58、59、60、61
5“TGTGTGATGTATAAGAATG 3”：62、63
64至65F： 5“GGGAAGAGATTTTATTAAAGAGA 3”5'TAAAGTAAATAGAGGTAG3’：64
R： 5'/5biosg/AATCAACTCTCTCTTTTCACCAT 3'5“TAAGTTTGATTATATGATTTTGAT 3”：65
66至67F： 5'/5biosg/ATGGTGAAAAAGAGAGAGTTGATT 3'5’CATTTACTCTAAAATAC 3’：66
R： 5’AAATTCCCCTCTACCTCTTAA 3’5’CTCTACCTCTTTTAAAC 3’：67
68至70F： 5'/5biosg/GGAATGTGTATGTTAGGATTGTA 3'5“CCAACTCCTCTTAAATTC 3”：68、69、70
R： 5’CTTTACCTTCATCTACAAAAA 3’
71至73（71无目标）F： 5'/5biosg/TTTAAGAGAGAGATGGTTTT 3'5“AAAATAATTACAAAATC 3”：72
R： 5'TCATCTACAAAAAAACAAAAACAA 3'
5“TCATCTACAAAAAAACAAAAACAC 3”：73
74至78F： 5英尺高3英尺高5“GTTAAGGTTTATTAGATTAG 3”：74、75、76
R： 5'/5biosg/CTTTTATCAAAACCCCTCTC 3'5“TTAGTGGTTTTAGGAATA 3”：77，78
79至84F： 5’GAGGAGGTTTGATAAAAG 3’5’GGTTTGATAAAAAGATGG 3’：79，80
R： 5'/5biosg/AAAAA CCAAAATACCTACAAAAT 3'5“GAGTATTGTGATAAG 3”：81
5“ATTTAAGGATTTATGG 3”：82
5“GATTTTATTGTATGTAGTAGT 3”：83
5’TTATAGTTTTTGTTTTTTTTT 3’：84
85至87F： 5'/5biosg/CGATTTTATTGATATGTAGTGGC 3'5'ACRACCAAAATACCACACAC 3’：85
R： TTAACAAAAATCCCAACCAAAC 3’5“AACTCCAACAAATCCCC 3”：86、87

细胞培养和DNMT抑制剂

将人胚胎肾（HEK-293T）细胞接种在10cm培养皿上，以15%的汇合度进行4天的药物治疗。电镀24小时后，用DNMT抑制剂-5-氮杂胞苷（5-aza-CR）、泽布林（Zeb）和RG-108处理细胞。每种药物的剂量为：5-aza-CR为10μM，Zeb为300μM，RG-108为300μM（Tocris Bioscience）。每24小时重复施用5-aza-CR，每48小时重复施用Zeb。由于RG-108的半衰期延长，无需再次用药。药物治疗后4天收集细胞，提取mRNA进行qRT-PCR分析。

染色质免疫沉淀分析

将大脑皮层和脊髓组织切开，在冰上切成小块。处理后的组织总重量为400-1200mg。Millipore Magna ChIP G组织试剂盒用于ChIP分析。简单地说，样品在含有蛋白酶抑制剂的组织稳定溶液中剪切。然后在室温下用1%甲醛固定样品10分钟。将甘氨酸添加到样品中，并在室温下培养5分钟。然后用PBS清洗样品3次。在带有蛋白酶抑制剂的组织溶解缓冲液中，通过在冰上培养15分钟来溶解组织。裂解后，样品在800×g下4°C离心5分钟。将颗粒重新悬浮在500uL稀释缓冲液和蛋白酶抑制剂中。成熟的动物样品在冰上以30%的振幅进行5轮20秒脉冲和50秒休息的声波处理。年轻的动物样品以20%的振幅在冰上进行1轮10秒脉冲和25秒休息的超声波处理。对于每个年龄段，这些声波参数产生的碎片大小为200-1000 bp。超声处理后，样品在4°C下在12000 rcf下离心10分钟。向每个样品中添加稀释缓冲液和蛋白酶抑制剂。对于每个免疫沉淀，1%的总量被移除并储存以供输入。将G蛋白磁珠添加到每个免疫沉淀反应中。使用IgG作为阴性对照，RNA聚合酶II作为阳性对照，以及DNMT1（Abcam）对样品进行免疫沉淀。所有探针均在2.5μg下使用，并在4°C下培养过夜。隔夜培养后，使用磁性分离器去除蛋白质G磁珠。蛋白G珠抗体/染色质复合物按以下顺序进行连续洗涤，5分钟培养：低盐免疫复合物洗涤缓冲液、高盐免疫复合液洗涤缓冲液和氯化锂免疫复合物清洗缓冲液。最后，将珠子重新悬浮在TE缓冲液中。制备带有蛋白酶K的ChIP洗脱缓冲液，并将其添加到每个样品中，包括输入。样品在62°C的干燥培养箱中培养2小时，然后在95°C下培养10分钟。磁选机被用来造粒。上清液被转移到新的试管中。使用提供的DNA纯化柱进行DNA净化。样品从柱上洗脱到50μL洗脱缓冲液C中。DNA样品用TE缓冲液稀释1:2，然后进行定量PCR分析。使用了针对Kir4.1的CpG岛1（位点20-43）和CpG岛屿2（位点62-67）中CpG位点的引物。使用相对于IgG阴性对照的折叠表达分析来确定DNMT与靶向区域的Kir4.1 DNA的相互作用。

甲基化和非甲基化4.1-CpG-luc质粒的产生

通过PCR扩增CpG岛1-3序列（CpG1:从-886到+311；CpG2:从+15549到+16062；CpG3:从+28050到+28488），并克隆到luc2萤火虫荧光素酶报告基因（pGL4.10载体，Promega）。4.1用SacI-HF线性化CpG-luc质粒。在30°C下用CpG甲基化酶（M.SssI，ZymoResearch）处理质粒过夜或保持未甲基化。在使用Qiagen进行清理后，甲基化和非甲基化质粒在37°C下进行了一夜的双重限制性消化。消化的DNA在1%琼脂糖凝胶上运行；从凝胶中切除甲基化和非甲基化插入物以及非甲基化载体，并使用苯酚萃取（Fisher生物试剂）进行纯化。使用T4 DNA连接酶（NEB）将甲基化和非甲基化插入物重新连接到非甲基化载体。使用QIAquick®凝胶提取试剂盒（Qiagen）纯化连接样品。

荧光素酶报告试验

将D54细胞接种在0.14×10的12孔板上6细胞/孔。24小时后，使用Lipofectamine®LTX和Plus试剂（生命科技公司的Invitrogen）将等浓度的甲基化或非甲基化4.1-CpG-luc质粒转染到D54细胞。200ng pGL4.74[hRluc/TK](雷尼利亚荧光素酶Promega）载体共转染为对照报告基因。根据制造商的建议（Promega双荧光素酶报告检测系统）进行双荧光素酶检测。简言之，转染细胞24小时后，使用被动裂解缓冲液进行15分钟的搅拌裂解。使用光度计（TD-20/20光度计特纳设计）读取样品。向100μL荧光素酶分析试剂II中添加20μL细胞裂解。通过移液管和萤火虫测定荧光素酶活性。随后立即添加100μL Stop和Glo®试剂；样品被涡旋雷尼利亚荧光素酶活性测定。的比率萤火虫荧光素酶活性雷尼利亚获得荧光素酶活性。以相对光单位表示的数据归一化为非甲基化质粒活性。

统计

对MS-HRMA和焦磷酸测序数据进行Kruskal-Wallis检验。克鲁斯卡尔·沃利斯（Kruskal-Wallis）被选中的原因是，数据所代表的百分比低于30-70%。采用单因素方差分析确定HEK和DNMT抑制剂的显著性在体外检测和FACS甲基化研究。对ChIP数据进行双向方差分析。进行单尾t检验以确定甲基化与非甲基化启动子活性的统计学显著性。对于所有数据集，均采用代表s.e.m的误差条报告平均值。表示Ns的数量，并以文本形式报告P值。

结果

Kir4.1的发育上调与mRNA转录增加一致

星形胶质细胞代表异质细胞群；曾经未经认可的可变蛋白表达现在被认为是提供了多种表型和功能的手段(Oberheim等人，2012年). 认识到星形细胞异质性在中枢神经系统功能中的重要作用，我们首先对大鼠中枢神经系统不同区域（包括皮层（C）、海马（H）、小脑（M）、脑干（BS）和脊髓（SC）的发育过程中Kir4.1蛋白的表达进行了详细检查。Kir4.1蛋白的Western blot分析表明，从出生后第0天（p0）开始，无论大脑区域如何，Kir4.1蛋白质的发育都会显著增加，并持续到p7、p14、p28和p100（显示了代表性的Western blots，每个年龄段n=2）(图1A-E). 皮质western blot的密度分析可作为Kir4.1表达发育增加的代表性量化(图1G). 有趣的是，我们发现，虽然每个评估区域都显示出强大的发育上调，但Kir4.1表达存在区域特异性差异。总的来说，Kir4.1的表达沿着吻尾轴增加。在一个发育时间点p28检测Kir4.1蛋白的表达，我们观察到脑干和脊髓中的蛋白表达相对于大脑皮层中观察到的蛋白表达水平显著增加(图1F和1H).

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Kir4.1蛋白经历强大的发育上调，具有区域特异性表达水平

（A-E）Western blotting显示，Kir4.1蛋白在不同脑区随年龄从p0增加到p100而增加。Kir4.1分别以约50kDa和200kDa的单体和四聚体形式出现。Tubulin或gapdh被用作负荷控制。(G公司)皮质western blot的密度分析提供了Kir4.1发育上调的代表性量化。(F类)对一个年龄段（p28）不同脑区的蛋白质分析显示Kir4.1的区域特异性表达水平。与脊髓（SC）和脑干（BS）相比，皮层（C）、海马（H）和小脑（M）的Kir4.1蛋白水平较低，而脊髓（SC，BS）的Kir 4.1蛋白水平最高。(H（H）)密度分析量化了中枢神经系统中Kir4.1表达的区域特异性水平。

为了确定Kir4.1蛋白的表达是否受到转录调控，我们接下来通过多个大脑区域的发育来检测Kir4.1的mRNA水平。我们观察到，Kir4.1蛋白在发育早期的增加与Kir4.1基因转录的增加平行，KCNJ10型（每个年龄段和大脑区域的n=3，样本一式三份）(图2A).KCNJ10型从出生到年轻成年，海马和皮层的mRNA表达增加了10倍。在同一时间段内，脑干和脊髓中的mRNA表达水平峰值超过25倍；这些尾侧脑区的初始基因表达先于前脑。因为星形胶质细胞数量在出生后的前三周内迅速增加(Bandeira等人，2009年)，我们接下来试图解决这些增加是否是由于星形胶质细胞数量增加，或者更确切地说，是由于单个星形胶质细胞中Kir4.1转录增加。为了解决这个问题，我们使用在S100β启动子下表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的转基因大鼠。S100β是一种可溶钙结合蛋白，用作星形胶质细胞的标记物(Ludwin等人，1976年;Cahoy等人，2008年). 从4周龄eGFP-S100β的皮层获得的代表性图像如所示图2B和图2CGFAP双标记（红色）表明eGFP的表达仅限于GFAP阳性的星形胶质细胞(图2C). 星形胶质细胞中eGFP的表达使荧光激活细胞分选（FACS）能够分离出富集的星形胶质细胞群。正如预期的那样，GFAP mRNA显著增加，而MAP2（一种神经元标记物）显著降低(图2D和2E). 来自FACS分类和非FACS分类皮层组织的qPCR显示Kir4.1 mRNA显著富集（与非FACS、年龄匹配的分类动物相比，在1周（p5-7）和3周（p20-21）FACS分类动物中Kir4.1分别增加了2.5倍和12.6倍，n=每个年龄段3个，分类样本与非分类样本）(图2F). 此外，这些数据表明，在一个相对纯净的星形胶质细胞群体中，GAPDH在检测的发育时间点内稳定表达。与出生后第一周的动物相比，三周大的动物Kir4.1的表达增加了10倍，表明单个星形胶质细胞中Kir4.1表达上调。

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KCNJ10 mRNA水平与Kir4.1蛋白的发育增加平行

（A）qPCR分析显示皮质、小脑和海马中KCNJ10转录物从p0增加到p100。减少25倍和15倍KCNJ10型脊髓和脑干分别在p100处观察到转录本。对于qPCR分析，折叠表达与gapdh相关，并归一化为皮层的p0（所有脑区和年龄的n=3）。(B类和C类)显示了FACS分类实验中使用的转基因eGFP-S100β动物大脑皮层切片的代表性图像。GFAP（红色）染色显示eGFP表达与GFAP阳性星形胶质细胞共定位。虚线框表示图2C中显示的缩放区域。比例尺为50μm。(D类和E类)GFAP和MAP2的qPCR分析作为FACS的对照；与未分选的细胞（NS）相比，在FACS细胞中观察到GFAP的同时增加和MAP2的减少。(F类)与未分类（NS）样本相比，eGFP+星形胶质细胞（FACS）的FACS表现出2.5倍和12.6倍的富集KCNJ10型分别在1周龄（p5-7）和3周龄（p20-21）的动物中进行转录。误差条代表标准误差。

Kir4.1转录水平与基因甲基化降低相关

接下来我们试图了解Kir4.1的转录调控是如何发生的。一些研究表明DNA甲基化与星形胶质细胞的发育有关(Shimozaki等人，2005年;Fan等人，2005年;Teter等人，1996年). 考虑到mRNA和蛋白质的同时变化，我们假设Kir4.1蛋白的发育增加是由转录调控介导的，特别是Kir4.1基因的DNA甲基化降低。为了研究DNA甲基化在Kir4.1表达的发育调控中的作用，我们首先进行了生物信息学分析Kir4.1基因，KCNJ10.A公司示意图生物信息学分析KCNJ10型表示三个胞嘧啶-磷酸二酯酶-鸟嘌呤（CpG）岛(图3). CpG岛是含有高百分比CpG二核苷酸的DNA区域，是DNA甲基化的转录调控位点。在Kir4.1的所有3个CpG岛屿中，共发现87个CpG-位点。

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生物信息学分析KCNJ10型基因揭示了3个CpG岛

Kir4.1大鼠序列被输入Applied Biosystems Methyl Primer Express。确定了3个CpG岛。CpG岛1为1198 bp，跨越第一个非编码外显子。CpG岛2为514 bp，位于内含子片段。CpG岛3为438 bp，与第二编码外显子重叠，包括该外显子的转录起始位点。

使用甲基化敏感高分辨率熔体分析（MS-HRMA）和焦磷酸测序这两种互补技术，检测了Kir4.1 CpG岛的甲基化状态。虽然我们利用FACS分离富集的星形胶质细胞群体以进行Kir4.1的mRNA分析，但我们选择利用整个组织，因为当破坏年龄大于p20的动物的FACS组织时，获得的细胞活性较低。对于MS-HRMA实验，设计的引物针对每个CpG岛的整体(表1). 由于大脑皮层和脊髓显示出明显不同的蛋白质和mRNA表达水平和模式，我们集中精力研究这两个对比鲜明的大脑区域(图1F). 从p0、p28和p60岁的动物身上提取皮层和脊髓DNA，并进行亚硫酸氢转化。将皮质和脊髓各年龄段扩增产物的熔融曲线与0至100%的甲基化标准进行比较。根据甲基化标准，利用线性回归分析计算每个扩增子的估计甲基化百分比。使用这种方法，我们发现大脑皮层12个靶区中9个的甲基化状态显著降低（n=4，p<0.05，Kruskal Wallis）(图4A)脊髓12个靶区中的7个通过发育(图4B). 虽然MS-HRMA提供了一组CpG位点甲基化状态的半定量信息，但焦磷酸测序用于提供单核苷酸的高度定量甲基化状态。因此，我们接下来生成了在正向或反向扩增引物上带有生物素标签的扩增引物和测序引物，以靶向KCNJ10型焦磷酸测序基因(表2). 对于这些实验，我们能够针对与Kir4.1 CpG岛相关的所有CpG站点的80%。从这些实验中获得的数据表明，在成功靶向的位点中，约54%（皮层）和42%（脊髓）的甲基化随着年龄的增长而显著降低（n=4，p60 SC除外，其中n=3，Kruskal Wallis）(图4C和表3和表4). 对于皮质和脊髓，CpG岛1的甲基化状态较低（在具有统计学意义的变化的位点中，皮质（C）和脊髓（SC）的p60处甲基化的中位数分别为31.95和13.13），而CpG岛屿2的甲基化水平较低（甲基化的中位数分别为72.53（C）及50.48（SC）p60）和CpG岛3（p60时80.06（C）和71.1（SC）甲基化的中位数%）(表3和表4). 尽管有类似的趋势，我们发现脊髓在早期发育时表现出较低的甲基化状态。这些数据与皮层和脊髓中Kir4.1的mRNA和蛋白表达水平相平行，支持Kir4.1发育增加至少部分由基因DNA甲基化模式的改变介导的假设。

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KCNJ10型显示发育过程中的差异甲基化

通过MS-HRMA评估皮层Kir4.1 CpG岛的甲基化状态(一个)和脊髓组织(B类)来自p0、p28和p60年龄段的动物。标记每个区域内的CpG位点。指明了非目标站点（NT）。CpG1在皮层和脊髓中的甲基化水平最低。大脑皮层和脊髓的12个区域中有9个和12个区域的7个区域的甲基化水平随着年龄的增长而降低。对于两个大脑区域：n=4；误差线代表s.e.m.；*（P<0.05）；**（P<0.01）***（P<0.001）。(C类)显示了Kir4.1 CpG岛1-3中发现的CpG位点甲基化百分比的热图表示。通过焦磷酸测序分析p0、p28和60岁时大脑皮层和脊髓（SC）中的位点。皮层和脊髓表现出平行的甲基化模式；然而，SC在总靶向CpG位点中54.3%的甲基化水平较低。在皮层和脊髓发生显著变化的部位中，95.5%的SC甲基化水平较低。表S3和表S4总结了随着年龄的增长表现出显著变化的站点。每个年龄段的n=4，p60时的SC除外，n=3。

表III

大脑皮层甲基化发生显著变化的部位

大脑皮层中的CpG位点随着年龄的增长表现出统计学上的显著变化。列出了具有统计意义的站点以及相关的p值。

年龄p值
CpG站点第0页第28页第60页p0与p28p0与p60p28与p60
站点135.27537.62541.70.29330.01380.0849
站点221.77529.525.7250.00340.07510.0867
站点79.5512.7257.9750.04510.27850.007
站点446.97530.9532.7750.00010.00010.1853
站点456.127.328.350.00010.00010.3576
站点468.2529.82531.950.00010.00010.023
站点475.5515.220.0750.00010.00010.0001
站点489.97512.17514.7750.03560.00040.0171
站点4925.1535.77539.90.00010.00010.0074
站点5034.9544.745.2750.0020.00140.8062
站点5125.2537.17536.40.00010.00010.4211
站点5294.391.1590.5250.01140.00420.5453
站点5484.42573.87569.9667<0.0001<0.0010.1159
站点5590.685.82584.23330.00120.00030.1715
站点5692.7579.174.8333<0.0001<0.0010.006
站点5791.285.4582.1<0.0001<0.00010.0005
站点5984.52578.8573.60.05510.0040.0909
站点6085.978.87575.50.00130.00020.065
站点6182.476.872.53330.00470.00020.0255
站点6290.02567.22568.4667<0.00010.00020.7247
站点6383.1564.2559.5<0.0001<0.00010.0027
站点6484.3562.159.7<0.0001<0.00010.1159
站点6585.858.67555.5<0.0001<0.00010.0964
站点6687.72578.474.9250.0007<0.00010.0945
站点6892.4594.22568.9750.73670.00130.0008
站点7084.4566.4561.35<0.0001<0.00010.0569
站点7291.4583.280.275<0.0001<0.00010.0436
站点7483.32567.97564.8<0.0001<0.00010.002
站点7593.884.22580.075<0.0001<0.00010.0031
站点7692.483.483.8750.00240.00330.8306
站点7784.576.57574.80.0002<0.00010.2051
站点7895.0591.17591.2250.02120.02250.9721
站点7997.57590.57592.7250.00430.02770.2748
站点8086.82580.0578.1250.00220.00040.2595
SIte第84页86.978.72578.525<0.0001<0.00010.8216
站点8593.37591.0591.3750.00530.01190.6216
站点8698.07595.194.9250.01490.01120.8638
站点8791.5585.12584.475<0.0001<0.00010.2106

表四

脊髓甲基化显著改变的部位

显示SC随年龄变化具有统计学意义的CpG位点。具有统计学意义的位点与相关的p值一起列出。

年龄p值
CpG站点第0页第28页第60页p0与p28p0与p60p28与p60
站点710.7255.3759.833330.02270.67560.0617
站点1117000.0320.04321
站点4611.76671414.66670.00920.00340.3228
站点477.266679.3511.60.00470.00010.0032
站点503820.3530.30.03910.33590.1966
站点5133.323.37526.4667<0.00010.00040.0198
站点5291.7585.5570.9333<0.0001<0.0001<0.0001
SIte第53页94.674.555.1<0.0001<0.0001<0.0001
站点5477.966758.67560.8333<0.0001<0.00010.2604
站点5787.2578.3570.56670.0004<0.00010.0004
站点6469.944.0539.5333<0.0001<0.00010.0334
站点6572.9538.32535.5333<0.0001<0.00010.1445
站点6684.67569.457.53330.0002<0.00010.0015
站点6766.72533.52534.13330.00250.00430.9433
站点6971.5537.27535.4<0.0001<0.00010.5678
站点7080.548.67545.8667<0.0001<0.00010.057
站点7288.02575.471.2333<0.0001<0.00010.016
站点7479.4553.77540.7<0.0001<0.0001<0.0001
站点7592.0257457.9333<0.0001<0.0001<0.0001
站点7688.475.761.3<0.0001<0.00010.0001
77号场地81.22568.07555.2<0.0001<0.0001<0.0001
站点7893.07587.983.20.03070.00170.0587
站点7993.82588.782.43330.0260.00050.015
场地8080.52570.758.36670.0002<0.00010.0001
站点8185.580.4576.40.0018<0.00010.0094
站点8280.4757970.96670.37790.00050.0015
站点8391.17588.07582.83330.0063<0.00010.0004
网站8483.02573.07558.3667<0.0001<0.0001<0.0001
站点8592.333391.4584.80.77440.04910.0598
站点8789.933382.876.6333<0.0001<0.0001<0.0001

我们质疑是否会观察到KCNJ10型在孤立的星形胶质细胞群中。因此，使用FACS分类的来自1周龄（p3-4）、3周龄（p19-22）和7周龄（p41-54）动物的星形胶质细胞，我们评估了其甲基化状态KCNJ10型在CpG岛2和3中，发育过程中甲基化发生显著变化的两个区域(图5A和5B). 与我们对全组织匀浆的研究平行，我们观察到发育过程中甲基化状态的降低(图5). 有趣的是KCNJ10型与全组织匀浆相比，FACS分选的星形胶质细胞中几乎每个CpG位点的含量都较低。这些数据表明，包含不表达Kir4.1的细胞类型会使数据偏向更高的甲基化状态，因为这些细胞类型会通过甲基化沉默基因。总的来说，这些研究表明KCNJ10型发生在星形胶质细胞发育过程中。

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FACS分类的星形胶质细胞显示出类似的DNA甲基化状态的降低KCNJ10型

对1周龄、3周龄和7周龄动物（3-4只/组）的EGFP+星形胶质细胞进行FACS分类和基因组DNA分离。进行焦磷酸测序以评估CpG岛2中每个CpG位点的DNA甲基化水平(一个)和CpG岛3(B类)在每个时间点，误差条代表s.e.m.；*（P<0.05）；**（P＜0.01）***（P＜0.001）。与从全脑匀浆中分离出的DNA中观察到的结果类似，从富含星形胶质细胞的DNA中分离出来的DNA显示，随着成熟，DNA甲基化水平降低。

DNA甲基转移酶1（DNMT1）与Kir4.1基因的物理相互作用

DNMT1与DNA甲基化的维持有关(Teter等人，1996年). 此外，多项研究表明这种酶在星形胶质细胞中是活跃的(Shimozaki等人，2005年;Fan等人，2005年;Teter等人，1996年). 我们的数据表明，在星形胶质细胞发育的早期，Kir4.1基因在几个CpG位点发生了高甲基化。我们假设，在同一早期发育时期，DNMT-1和CpG位点之间的相互作用会增强，显示它们具有高水平的DNA甲基化。为了验证这一点，我们对DNMT1蛋白与Kir4.1 CpG位点的相互作用进行了ChIP分析探测(图6). 因为与皮层相比，脊髓在更多的CpG位点显示出更强劲且持续的从p28到p60的递增下降(表3和表4)，我们利用脊髓组织进行ChIP分析。这些实验的结果表明，甲基化水平降低的CpG位点（CpG部位20-43）与DNMT1的相互作用水平较低，在观察年龄段内与DNMTl的相互作用没有显著变化（分别从p0到p60富集3.7倍和3.9倍-与IgG背景信号相关的数据；n=3，单向方差分析）(图6A). 相反，高度甲基化的CpG位点（CpG位62-67）在发育早期与DNMT1有高水平的相互作用，通过发育这种相互作用显著减少（分别从p0到p60富集14.0到1.8倍；n=3，单向方差分析）(图6B). 我们的数据表明DNMT1与Kir4.1 CpG位点存在动态相互作用。值得注意的是，在发育过程中表现出DNA甲基化最强烈下降的位点也表现出DNMT1相互作用的最显著下降。鉴于DNMT-1在介导DNA甲基化中的作用，这些数据为Kir4.1的DNA甲基化如何在发育过程中发生观察到的变化提供了机制支持。

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DNMT1在发育过程中与Kir4.1 DNA表现出动态相互作用

染色质免疫沉淀和随后的qPCR分析（ChIP-qPCR）用于评估DNMT1与Kir4.1在两个区域的相互作用，这两个区域显示了甲基化的对比水平和与年龄相关的变化。IgG作为阴性对照，用于背景信号的归一化。RNA聚合酶II用作阳性对照。在CpG岛1中发现的位点20-43在衰老期间甲基化水平较低且停滞，而在CpG-岛2中发现的位点62-67甲基化水平较高，在衰老期间显著降低。(一个)ChIP分析表明，CpG岛1中评估的位点在从p0到p60的老化过程中，DNMT1相互作用几乎没有变化，富集倍数分别为3.74和3.89。(B类)相反，CpG岛2中评估的位点在发育过程中表现出DNMT 1相互作用的减少，p0时的褶皱富集度为14.02，而p60时为1.81。每个年龄段n=3；误差线代表标准误差*（P<0.05）。

DNA甲基化控制Kir4.1转录

考虑到Kir4.1基因同时发生低甲基化，并且在发育过程中基因转录增加，我们接下来假设甲基化的整体降低足以驱动Kir4.1转录。我们利用人类胚胎肾细胞293（HEK293）-一种通常不表达Kir4.1的细胞系-在在体外驱动Kir4.1表达式的系统(图7A). DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂——5-氮胞苷（5-aza）、泽布林（Zeb）和RG-108——每种抑制剂都具有独特的半衰期特性和阻止DNA甲基化的机制，用于防止DNA甲基化。我们发现，在治疗4天时，使用每个DNMT抑制剂的qPCR检测到Kir4.1转录增加。应用10μM 5-aza可使其增加近5倍（n=3，p<0.0001，单向方差分析）。细胞对斑蝥素和RG 108具有良好的耐受性，并使Kir4.1转录增加近9倍和3倍，分别为n=3，p<0.001和p<0.05，单因素方差分析）(图7A). 这些数据表明，DNA去甲基化足以驱动Kir4.1转录。

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DNMT抑制剂可以驱动Kir4.1转录在体外

(一个)使用5-aza、Zebularine（zeb）和RG-108导致药物治疗后4天Kir4.1转录显著增加。将样本归一化为gapdh，折叠表达与每种药物的对照有关（用0μM表示）。n=3个单独实验；误差线代表s.e.m.；*（P<0.05）；**（P＜0.01）***（P＜0.001）。（B）CpG-Kir4.1 CpG岛甲基化示意图如图所示。切割质粒释放Kir4.1 CpG岛，然后使用CpG甲基化酶进行甲基化。甲基化后，CpG岛被重新整合回非甲基化的luc2（荧光素酶）质粒。4.1-CpG 1-3-luc的甲基化（M）通过血红蛋白II消化。血红蛋白II只消化非甲基化DNA。（C、D）荧光素酶报告子分析表明，CpG岛1和2的甲基化导致启动子活性降低（***p<0.0001和*p=0.0257；n=6和n=3）。误差条代表标准误差。

使用药理学方法抑制DNMT会导致DNA的全局非特异性去甲基化。接下来，我们希望具体评估高甲基化与非甲基化Kir4.1启动子的活性。在最后一组实验中，我们使用了在体外荧光素酶分析系统用于测量神经胶质源性人脑肿瘤细胞系D54中Kir4.1的启动子活性。对Kir4.1基因的每个CpG岛进行PCR扩增，并克隆到荧光素酶报告子上游(卢克2)产生4.1-CpG1-、4.1-CpG2-和4.1-CpG3-luc质粒。将质粒线性化，并用CpG甲基化酶（M.Sssl）处理以使质粒甲基化或保留非甲基化（非甲基化对照质粒的生成与甲基化质粒类似，但它们没有接触CpG甲基酶）(图7B). 甲基化和非甲基化质粒的甲基化状态通过HpaII公司只消化非甲基化位点的消化(图7B). 为了确保luc2基因的甲基化不会影响结果，对甲基化和非甲基化质粒进行限制性消化，以放弃4.1-CpG1-3插入。将非甲基化载体重新分类为甲基化插入物或非甲基化插入体。将甲基化或非甲基化的4.1-CpG-luc质粒转染到D54细胞(图7C和7D). 荧光素酶水平被评估为启动子活性的指标。我们的数据表明，甲基化4.1-CpG 1-luc转染细胞的荧光素酶报告活性显著降低(图7C)和4.1-CpG 2-吕克(图7D)（n=6和n=3，p<0.0001和p=0.0257，单尾t检验）。相反，我们发现甲基化的转录活性与非甲基化的4.1-CpG 3-luc相比没有显著变化（数据未显示）。总的来说，这些研究为DNA甲基化调节Kir4.1基因的转录水平提供了一个偶然的作用。

讨论

在这里，我们研究了Kir4.1的表观遗传调控，这是一种胶质特异性K+通道，已知对正常CNS发育至关重要。随着越来越多的中枢神经系统疾病与Kir4.1相关——ALS、MS、癫痫发作、SeSAME和损伤——更好地理解Kir4.1的正常和病理作用以及调节的重要性再怎么强调也不过分(Scholl等人，2009年;Sicca等人，2011年;Buono等人，2004年;Bockenhauer等人，2009年;Srivastava等人，2012年;Bataveljic等人，2012年). 我们提供了大量证据，证明DNA甲基化在发育过程中作为中枢神经系统Kir4.1转录的强大调节器发挥作用。

中枢神经系统中Kir4.1的区域特异性表达：星形胶质细胞特化的一个新兴参与者

在中枢神经系统中，已经证明单个动作电位可以增加[K+]e（电子）高达1 mM(Ransom等人，2000年). Kir4.1介导的K+缓冲是一种消除这种情况的机制[K+]e（电子）不需要能量。Kir4.1在大脑和脊髓星形胶质细胞中的重要性及其在K+在大鼠和小鼠中使用Kir4.1靶向siRNA证明了体内平衡(Kucheryavykh等人，2007年)、和就地使用常规和条件敲除动物(Djukic等人，2007年;Neusch等人，2001年). 总的来说，这些对来自皮层、海马、脊髓和视网膜的星形胶质细胞的研究表明，缺乏Kir4.1的星形胶质胶质细胞缺乏内向整流电流，输入电阻显著增加，去极化，钾清除不足。值得注意的是，这个不足的K+间隙发生在[K+]e（电子）达到高频放电时所见的异常高水平。有趣的是，Kir4.1基因敲除动物和胶质细胞特异性敲除动物表现出癫痫发作、共济失调和过早死亡（p12-p25）(Djukic等人，2007年). 值得注意的是，虽然我们关注Kir4.1在星形胶质细胞中的表达及其在钾缓冲中的作用，但Kir4.1也在其他胶质细胞群中表达，包括少突胶质细胞和少突胶质前体细胞（OPCs）(Kalsi等人，2004b;Maldonado等人，2013年). 当然，不应低估这些细胞群中Kir4.1表达缺失的后果，这可能是Kir4.1 KO动物中观察到的异常表型的原因之一。

鉴于Kir4.1表达的临床相关性增加，我们试图对中枢神经系统中Kir4.1的蛋白表达模式进行更全面的了解。根据以往的研究，我们发现Kir4.1在出生后早期发育过程中在所有检查的中枢神经系统区域的表达显著增加。这些数据得到了许多电生理学研究的支持，这些研究表明Kir4.1通道活性在出生后的最初几周内都在体外增加(MacFarlane和Sontheimer，2000年;Olsen和Sontheimer，2004年)以及现场(Seifert等人，2009年;Bordey and Sontheimer，1997年). 最显著的表达增加发生在出生后第二周和第三周。有趣的是，我们发现Kir4.1的表达模式存在脑-区域特异性差异，这表明不同的星形胶质细胞群体具有特异性。脊髓和脑干显示Kir4.1蛋白的增长更早且更强劲。Kir4.1的差异蛋白表达模式可能反映了对钾的不同需求+间隙。最近的工作表明，[K+]e（电子）足以导致运动神经元死亡(皮内达和里贝拉，2008年;Kaiser等人，2006年). 此外，在发育中的脊髓中，[K+]e（电子）超过基线约2 mM，持续24小时，通过改变神经元本身功能性钾通道的数量，改变了运动神经元的兴奋性(Pineda和Ribera，2008年). 这些数据表明，中枢神经系统的这一区域具有高度的特异性；这里的神经元对[K的波动特别敏感+]e（电子）因此需要一种更有效的K机制+间隙。Kir4.1全局和胶质细胞特异性KO动物的研究结果证实了这一观点，其中最深刻的病理学，包括脊髓髓鞘减退、轴突肿胀和变性(Neusch等人，2001年).

DNA甲基化在Kir4.1基因表达调控中的作用

星形胶质细胞来源于发育较晚的神经前体细胞(Shimozaki等人，2005年). 这种细胞特化需要基因转录的表观遗传调控(Shimozaki等人，2005年). 星形胶质细胞特异性基因通常在晚期神经前体细胞中去甲基化，以便在星形胶质细胞分化之前进行转录(Hatada等人，2008年;Teter等人，1996年). 有趣的是，神经前体细胞中DNA甲基转移酶-1（DNMT1）的条件性敲除导致DNA低甲基化，这足以诱导早熟星形胶质细胞分化(Fan等人，2005年). 这些研究表明，基因转录的表观遗传调控，特别是DNA甲基化，在星形胶质细胞发育中起着重要作用。为了深入了解Kir4.1蛋白在正常发育过程中的表达调控，我们评估了Kir4.1在发育过程中mRNA水平。我们发现Kir4.1蛋白的增加与mRNA的增加平行。我们的发现表明，mRNA水平高度反映了发育过程中中枢神经系统中Kir4.1蛋白质表达的区域特异性差异，表明Kir4.1的转录调控。

使用两种互补技术评估DNA甲基化水平——MS-HRMA和焦磷酸测序——我们发现Kir4.1 CpG岛的DNA甲基化程度与基因转录水平密切相关。例如，与皮层相比，在所有受检年龄段（p0、p28和p60），基因转录水平较高的脊髓甲基化水平较低。此外，与皮层相比，脊髓甲基化状态在早期时间点明显降低。这些数据表明，DNA甲基化是Kir4.1表达的典型负调控因子，可能在调节Kir4.1的区域特异性表达模式中发挥作用。我们选择确定观察到的DNA甲基化变化是否是神经胶质细胞群体特有的。通过使用eGFP FACS分类的星形胶质细胞，我们证实了KCNJ10型在开发过程中。正如预期的那样，分离富集的星形胶质细胞群体导致所有分析年龄段的甲基化状态较低，因为不表达Kir4.1的细胞类型（神经元、小胶质细胞和内皮细胞）被排除在外。尽管甲基化状态总体较低，但我们观察到KCNJ10型在发育过程中，Kir4.1表达增加。从机制上讲，DNA甲基化在调节Kir4.1转录中的作用得到了ChIP分析的支持，该分析揭示了DNMT1与Kir4.1 CpG位点的强大动态相互作用；这种与DNMT1的相互作用似乎与甲基化水平平行，并与发育过程中甲基化状态的变化相一致。

如其他研究所述，与启动子区和转录起始位点（TSS）相关的大多数CpG岛具有低水平的甲基化(Maunakea等人，2010年;迪顿和伯德，2011年). 与这些研究一致，我们发现Kir4.1 CpG岛1（包含TSS和启动子区域）在整个发育过程中具有低水平的甲基化。最近的研究表明，TSS-相关的CpG岛，如Kir4.1的CpG-岛1，不参与组织特异性转录。相反，这些研究提出，基因内DNA甲基化（通常含有高水平甲基化）在介导细胞类型和组织特异性转录中发挥更重要的作用(Maunakea等人，2010年;Lorincz等人，2004年). 有趣的是，正是在基因内CpG岛2和CpG岛屿3（也包含TSS）中，我们观察到甲基化的强烈变化。值得注意的是，我们观察到基因体中甲基化水平降低，特别是CpG岛2和3，这与发育过程中Kir4.1转录和表达增强有关。这一发现与“DNA甲基化悖论”的概念相对照，该悖论中启动子中的DNA甲基化与基因表达呈负相关，而基因体内的DNA甲基化与基因表达呈正相关(琼斯，1999年). 虽然基因体甲基化的作用仍存在高度争议和悬而未决(铃木和伯德，2008;Jjingo等人，2012年)，我们的观察提供了相关和因果证据，证明基因体甲基化水平与KCNJ10型基因。鉴于观察到的Kir4.1甲基化模式，我们假设CpG岛1（包含启动子）的胚胎去甲基化可能作为允许Kir4.1表达的允许信号发挥作用，而CpG岛2和3可能协同或独立地发挥作用，调节我们在皮层和脊髓中观察到的Kir4.1的区域特异性表达水平。

最后，我们提供了DNA甲基化可以双向影响Kir4.1转录的证据。我们的在体外利用HEK细胞和DNMT抑制剂进行的分析表明，在通常不表达该通道的细胞类型中，整体去甲基化足以驱动Kir4.1转录。此外，与非甲基化相比，甲基化的4.1-CpG1-luc和4.1-CpG2-luc的荧光素酶活性降低，表明Kir4.1 CpG启动子和岛的DNA甲基化可降低Kir4.1转录。虽然我们不能排除可能在介导Kir4.1转录中起作用的其他表观遗传机制，但我们的数据表明，Kir4.1 CpG岛的DNA甲基化在发育过程中调节Kir4.1的转录中起着重要作用。

Kir4.1的表观遗传调控是一个合理的治疗靶点

许多研究强调Kir4.1是一个潜在的治疗靶点(Olsen等人，2010年;Sicca等人，2011年;Srivastava等人，2012年;Steinhauser等人，2012年;Wilcock等人，2009年). 然而，研究尚未为靶向Kir4.1表达或通道激活提供可行的途径。我们首次报道了调控Kir4.1转录和DNA甲基化的表观遗传机制，并建议这是表观遗传靶向Kir4.1表达的第一步。未来的研究侧重于了解Kir4.1在正常和病理状态下的表观遗传调控，可能揭示DNA甲基化和其他表观遗传标记作为药物修饰机制，可以积极开发用于治疗缓解各种中枢神经系统疾病。

致谢

这项工作得到了NIH拨款1P30NS069324-02（M.L.O）和5T32NS061788-05（S.E.N.）的支持。作者希望感谢UAB IDDRC核心（由P30 HD38395支持的核心）的S.Phillips开发质粒和荧光素酶分析技术援助；S.Nozell在ChIP和荧光素酶分析方面的技术援助；UAB流式细胞术设施（核心由P30 AR048311支持）的E.Keyser对eGFP+星形胶质细胞进行FACS分类；以及伯明翰阿拉巴马大学的M.Walker，感谢他亲切地提供HEK和D54文化

脚注

作者贡献

S.E.N进行了所有实验。SE.L.设计了焦磷酸测序引物并进行了焦磷酸序列测定反应。S.R.P.分离星形胶质细胞用于FACS焦磷酸测序实验。M.L.O.为所有实验提供了技术援助。S.E.N和M.L.O合作进行了研究设计、数据分析和解释以及手稿撰写。

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