mTORC1在Ser 757磷酸化Ulk1。(一)mTORC1磷酸化Ulk1 S/T结构域。从转染的HEK293细胞制备Ulk1缺失突变体，用于在体外mTORC1分析。磷酸化通过32通过western blot（底部）测定P-放射自显影图（顶部）和蛋白质水平。(b条)Ser 757被mTORC1磷酸化。左图：所示的重组GST–mUlk1突变体从大肠杆菌和用于在体外mTORC1测定作为底物。缺失分析分离出片段（753-771）作为mTORC1的靶点。Ulk1（753–771）片段包含五个保守的丝氨酸/苏氨酸残基，即Thr 754、Ser 757、Ser 760、Thr 763和Thr 770。右：Ser 757突变通过mTORC1消除了Ulk1磷酸化在体外GST作为mTORC1磷酸化反应的阴性对照。磷酸化测定方法32P-放射自显影（顶部），而蛋白质水平通过考马斯染色检测（底部）。(c（c）)Rheb增加Ulk1 Ser 757磷酸化。从转染的HEK293细胞中免疫沉淀HA–Ulk1野生型和S757A突变体。提示联合转染Rheb和雷帕霉素（Rapa）治疗。western blot检测Ulk1 Ser 757磷酸化。(d日)Rheb在野生型Ulk1中诱导迁移，但在Ulkl中没有诱导迁移S757A型突变体。将HA–Ulk1转染到HEK293细胞中，无论是否含有Rheb。在富含营养的培养基下，从细胞中免疫沉淀HA–Ulk1，并用western blot检测Ulkl的迁移率。(电子)内源性Ulk1 Ser 757磷酸化在Tsc1型−/−MEF公司。Tsc1型+/+（重量）和Tsc1型−/−（KO）MEF缺乏葡萄糖（4小时），或用50 nM雷帕霉素治疗（Rapa，1小时）。用磷酸化-Ulk1 Ser 757抗体检测内源性Ulk1的Ser757磷酸化。斑点的未裁剪图像如所示补充图S5.
