AMPK直接磷酸化Ser 317和Ser 777的Ulk1。(一)AMPK磷酸化Ulk1 S/T结构域在体外顶部：用于绘制磷酸化位点的Ulk1结构域结构和缺失结构的示意图。小鼠Ulk1蛋白由N末端激酶域（KD；1–278）、丝氨酸/苏氨酸富集域（S/T域，279–828）和C末端域（CTD，829–1051）组成。底部：从转染的HEK293细胞中免疫纯化所示Flag–Ulk1缺失突变体，并用于在体外AMPK分析作为底物。磷酸化通过32western blot检测P-放射自显影和蛋白水平。(b条)Ulk1中AMPK磷酸化位点的测定。所示的重组GST–Ulk1突变体从大肠杆菌，用作在体外AMPK磷酸化。缺失分析表明，S/T结构域中的两个Ulk1片段279-425和769-782被AMPK高度磷酸化在体外Ser 317突变消除了Ulk1片段279-425中的大部分磷酸化。在片段769-782中，五个丝氨酸残基（774号、777号、778号、779号和780号）突变为丙氨酸，表示为（769-782）5SA，完全消除了AMPK的磷酸化作用。在该突变背景（769–782）4SA-S777中重组Ser 777，而不是其他四个残基中的任何一个，恢复了AMPK的磷酸化。GST和GST–TSC2F（TSC2片段1300–1367包含Ser 1345的AMPK磷酸化位点）分别用作AMPK反应的阴性和阳性对照。磷酸化测定方法32考马斯染色检测P-放射自显影和蛋白水平。(c（c）)葡萄糖饥饿诱导的Ulk1磷酸化需要Ser 317/Ser 777体内将HA–Ulk1和突变体转染到HEK293细胞中。如图所示，细胞缺糖4小时。HA–Ulk1进行免疫沉淀，并通过western blot检测其流动性。(d日)AMPK诱导Ulk1 Ser 317和Ser 777的磷酸化。如图所示，野生型HA–Ulk1或S317/777A突变体与AMPK共同转染到HEK293细胞中。HA–Ulk1被免疫沉淀（IP），Ser 317和Ser 777的磷酸化被western blotting检测。斑点的未裁剪图像如所示补充图S5。
