临床投资杂志。2004年5月1日；113(9): 1344–1352.
删除表达香草醛受体1的初级传入神经元用于疼痛控制
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拉斯洛·卡拉伊
1美国马里兰州贝塞斯达国家牙科和颅面研究所。2宾夕法尼亚大学兽医学院，美国宾夕法尼亚州费城。
多萝西·C·布朗
1美国马里兰州贝塞斯达国家牙科和颅面研究所。2宾夕法尼亚大学兽医学院，美国宾夕法尼亚州费城。
安德鲁·曼内斯
1美国马里兰州贝塞斯达国家牙科和颅面研究所。2宾夕法尼亚大学兽医学院，美国宾夕法尼亚州费城。
斯蒂芬·T·康纳利
1美国马里兰州贝塞斯达国家牙科和颅面研究所。2宾夕法尼亚大学兽医学院，美国宾夕法尼亚州费城。
雅各·布朗
1美国马里兰州贝塞斯达国家牙科和颅面研究所。2宾夕法尼亚大学兽医学院，美国宾夕法尼亚州费城。
迈克尔·甘达尔
1美国马里兰州贝塞斯达国家牙科和颅面研究所。2宾夕法尼亚大学兽医学院，美国宾夕法尼亚州费城。
Ofer M.Wellisch先生
1美国马里兰州贝塞斯达国家牙科和颅面研究所。2宾夕法尼亚大学兽医学院，美国宾夕法尼亚州费城。
约翰·纽伯特
1美国马里兰州贝塞斯达国家牙科和颅面研究所。2宾夕法尼亚大学兽医学院，美国宾夕法尼亚州费城。
佐尔坦·奥拉
1美国马里兰州贝塞斯达国家牙科和颅面研究所。2宾夕法尼亚大学兽医学院，美国宾夕法尼亚州费城。
迈克尔·伊达罗拉
1美国马里兰州贝塞斯达国家牙科和颅面研究所。2宾夕法尼亚大学兽医学院，美国宾夕法尼亚州费城。
1美国马里兰州贝塞斯达国家牙科和颅面研究所。2宾夕法尼亚大学兽医学院，美国宾夕法尼亚州费城。
收稿日期：2003年11月3日；2004年2月25日接受。
摘要
癌症、神经病和术后疼痛的控制常常不充分，或因使人虚弱的副作用而受到影响。抑制或去除某些伤害性神经元，同时保留所有其他感觉模式和运动功能，将代表一种控制严重疼痛的新治疗方法。瞬时受体电位阳离子通道，V亚家族，成员1（TRPV1；也称为香草受体，VR1）在背根和三叉神经节的伤害性神经元中的富集表达使我们能够测试这一概念。将有效的TRPV1激动剂树脂毒素（RTX）注入神经元胞周，通过打开TRPV1离子通道和选择性清除伤害性神经元，诱导钙细胞毒性。这种治疗可以阻止大鼠的实验性炎性痛觉过敏和神经源性炎症，也可以阻止狗自然发生的癌症和虚弱的关节炎疼痛。两个物种的触觉、本体感觉、高阈值机械感受性痛觉以及运动功能保持不变。在针对术后疼痛控制的单独实验中，皮下注射RTX会暂时破坏伤害性神经末梢，产生可逆镇痛。在人背根神经节培养物中，RTX诱导香草醛敏感神经元细胞内钙的长期增加，而其他相邻神经元则不受影响。结果表明，伤害性神经元或神经末梢缺失作为疼痛管理策略将是有效且广泛适用的。
引言
在从儿科到老年人的患者群体中，使用目前可用的止痛药控制剧烈疼痛通常不太理想(1–三). 阿片类药物仍然是治疗中重度疼痛的主要药物，但它们不能普遍缓解疼痛。一些癌症患者的疼痛对包括阿片类镇痛在内的传统药物治疗是难以忍受的，他们中的许多人经历了令人厌恶的、剂量有限的副作用。尽管100多年来一直在寻找治疗重度疼痛的新的药理方法(4–6)目前，阿片类药物的替代品是非选择性化学或外科神经消融干预和姑息性镇静(7–9). 然而，这两种选择都不令人满意。通过神经消融干预，负责运动、膀胱和肠道功能的神经元可能会被不加区分地破坏，而使用姑息性镇静则会失去意识；在这两种情况下，生活质量都可能受到影响(10). 持续鞘内给药的植入式泵可能会缓解症状，但泵的放置费用昂贵，需要手术治疗，有其自身的并发症，可能不适合或对晚期癌症完全有效(11).
在本文中，我们探索选择性伤害性神经元缺失作为控制实验模型和自然发生的临床条件中伤害性过程的一种方法。这种方法利用了位于感觉神经节的伤害感受性（主要是小的无髓鞘C纤维神经元）的特定基因表达模式。这些神经元传递由有毒热量和内源性炎性痛觉物质产生的感觉，并表达高水平的瞬时受体电位阳离子通道，V亚家族，成员1（TRPV1；也称为香草酸受体，VR1），钠/钙离子通道，与背根（DRG）或三叉神经节（TG）的其他感觉神经元相比(12–14). 对原代DRG培养物和体外表达TRPV1的细胞进行的直接活细胞成像表明，树脂毒素（RTX）是一种有效的TRPV1激动剂(15)导致细胞内游离钙浓度（[Ca2+]我). 由此产生的钙细胞毒性迅速减弱，然后仅删除表达TRPV1的神经元或细胞(16). 这些数据为在体内DRG或TG神经元胞体附近应用RTX将删除TRPV1的治疗干预提供了一个机理基础+神经元，从而消除对主要与炎症、痛觉过敏和癌症相关疼痛相关的伤害性输入的敏感性。由不表达TRPV1的神经元介导的其他感觉方式不会受到影响（例如本体感觉和高阈值机械感觉）。我们进一步推断，应用于外周伤害性神经末梢的相同机制将可逆地抑制疼痛转导，但保留DRG中远离RTX应用部位的神经元胞周。因此，研究了基于RTX差异应用的三种疼痛调节策略：单节内、多节（鞘内）和外周神经终末。我们在大鼠身上采用了强健、特征鲜明的伤害性实验模型，以及一种呈现与人类直接相关的自然发生条件（癌症、骨关节炎）的犬兽医模型。为了预测疗效并确定在人类中是否会发生同样的选择性，我们将人类DRG神经元的原代培养物暴露于RTX。活细胞成像揭示了只有DRG神经元的亚群表现出RTX的激活；这与之前培养的大鼠DRG神经元的结果一致。概述的程序应该为各种以剧烈疼痛为特征的疾病提供镇痛，这些疾病可能包括三叉神经痛、关节炎、周围神经瘤和晚期转移性疾病。
结果
在大鼠实验模型中单次神经节内注射。
将RTX单侧神经节内微注射到TG中（图，A和B）减弱或消除了C纤维神经元支持的传入（伤害性）和传出（神经源性炎症）功能（图（C–E）。神经节内RTX减轻了血浆外渗；这是C纤维介导的神经源性炎症和传出功能的指标(17,18). 静脉注射Evans Blue染料与血浆蛋白结合，描绘出神经支配完整的区域（图C） 把它们染成深蓝色。RTX微注射侧的皮肤大部分保持白色，表达TRPV1的三叉神经细胞被删除。注射后24小时，通过对C纤维功能的敏感测试，即角膜应用辣椒素（CAP）后的眼部反应，即可观察到镇痛作用。神经节内剂量为20 ng的RTX几乎消除了擦拭行为，而200 ng则完全抑制了擦拭行为（图D） 。单次RTX注射的抗伤害作用维持了至少1年（图E） ●●●●。TRPV1免疫反应（TRPV1-IR）神经元的长期行为效应和丢失（图（F和G）表明RTX镇痛是永久性细胞去除的结果，而不是长期受体脱敏的结果；在急性体外电生理实验中，当CAP应用于神经元时，观察到后一种现象(19–21). CAP化疗敏感性的丧失并不影响角膜对液滴本身的机械敏感性。此外，在梳理方面没有观察到可能表明存在感觉障碍的变化。
单次神经节内治疗。采用经颅立体定向方法，将RTX单侧注射到TG中。(A类)考马斯蓝染料描绘了颅底三叉神经注射部位(B类)切除、染色TG(C类)通过Evans蓝染血浆蛋白外渗评估RTX诱导的神经源性炎症的阻断作用。皮肤的蓝色区域表示C纤维神经支配完整的区域。RTX注射侧的外渗被阻断，仍为白色。(D类)单侧神经节内RTX给药后角膜伤害性传入传递的剂量相关阻断。注射后1-3天评估CAP眼管反应*成对t吨测试；P（P）< 0.01;n个=200 ng、20 ng和车辆的给药分别为30、6和18。(E类)在单侧神经节内治疗的大鼠中，CAP诱导的眼-管反应的阻滞在大约1年内是明显的，这与TRPV1-IR神经元的永久性缺失一致，如F类和G公司（*成对重复t吨测试；P（P）< 0.01;n个= 7). 在RTX处理侧(F类)，减少（～80%，与RTX治疗后1至3天内检查的动物相似；见图)TRPV1-IR神经元与对侧非治疗侧比较(G公司). 棒材：100μm。
早在RTX治疗后1–3天，免疫组织化学就可以观察到神经节内RTX给药导致TRPV1表达神经元的广泛缺失（图，A–D）。为了确定另一类感觉神经节神经元保持完整，我们对具有大直径有髓鞘轴突的神经元中表达的神经丝蛋白（N52）进行了染色(22). 对单染色和双染色（N52和TRPV1）切片进行检查。注入的TG含有许多N52+神经元（684±32，图中为棕色，C和D），但很少有TRPV1+神经元（123±36，紫色），而对侧TG显示N52+（709±23）和TRPV1+（604±68）个神经元（图、E和F）。TRPV1的损失+神经元显著(P（P）< 0.01). 使用RT-PCR也可以明显看出损失；然而，少量RNATRPV1型在RTX注射的神经节中可以检测到（图G） 与细胞计数一致，显示TRPV1-IR神经元大量缺失，N52神经元保留不表达TRPV1（图、C和D）。
微量注射RTX（200 ng）后TRPV1-IR感觉神经节神经元选择性丢失。(A类)与对侧未注射TG相比，注射RTX后TRPV1免疫染色显示IR神经元胞体广泛缺失(B类). (C类_F类)双重标记显示大的有髓N52+RTX注射侧保留感觉神经元（棕色），而TRPV1+神经元（紫色）被删除(C类). 在对侧非注射侧，N52和TRPV1神经元均完好无损(D类). 定量显示RTX后N52-IR周核数无显著差异，而TRPV1减少80%+神经元发生(E类和F类). 图中的横线表示注射后1至3天评估的3至5只不同大鼠TG三个部分的平均神经元计数(*P（P）< 0.01). (G公司)RT-PCR显示mRNA减少TRPV1型在两个不同的大鼠中。M（M）第页、标记；NO，无底漆；SC，脊髓；T、 RTX治疗；C、 对侧TG.棒材：0.5 mm(A类和B类)和50微米(C类和D类).
大鼠RTX的多神经节给药。
晚期转移性疾病继发的严重疼痛通常更为弥漫，且不局限于一两个皮肤节。在这些情况下，多个神经节可以通过脑脊液进行双侧治疗。为了验证这一点，通过腰椎穿刺给予RTX，靶向支配尾部和下肢的神经节。通过测量（a）有害的热反应和炎症反应的选择性衰减，（b）通过与前肢的行为比较来评估药物的传播程度，对应于细胞缺失的空间范围，以及（c）运动活性和机械感觉的保留，来评估治疗有效性和特异性。鞘内注射RTX（10，50 ng）对辐射性有害热刺激的戒断潜伏期略有增加(23,24)而当剂量为100和200 ng时，许多动物的后爪和尾部刺激达到14秒的截止时间，而不影响前爪潜伏期（图A） ●●●●。鞘内注射RTX还阻断了角叉菜胶诱导的热痛觉过敏，这与TRPV1的重要作用一致+实验性炎症状态下的神经元（图B） ，如有针对性地中断TRPV1型基因(25,26). 行为效应通过腰神经节和背角TRPV1和降钙素基因相关肽（CGRP）免疫反应性的降低在细胞水平上反映出来，这与TRPV1表达神经元的缺失一致（图，D–G）。相反，TRPV1+远离腰椎RTX应用水平的颈神经节神经元未受影响（图C） ，对应于正常前爪-拖曳潜伏期的保持（图A） ●●●●。因此，通过靶向一个或多个神经节，分别使用神经节内或鞘内途径，可以调整治疗作用的空间范围，以匹配不同的临床表现。
鞘内（多神经节）或外周RTX可减弱热伤害感受和炎性痛觉过敏。(A类)腰椎鞘内注射RTX的剂量反应(n个=50，每组10人*,#P（P）< 0.05). 低于50 ng的剂量无效。在100和200 ng的剂量下，对尾部和后肢进行了强效镇痛(B类)卡拉胶炎性痛觉过敏(n个=每组4人**P（P）<0.05）在200 ng鞘内RTX后逆转(*P（P）< 0.05). 前爪无镇痛作用(A类)与颈神经节TRPV1-IR神经元的滞留相关(C类)以及它们在腰骶神经节的丢失(D类). 服用RTX后3天，腰髓内CGRP-IR（一种由伤害性传入终末表达的神经肽）的剂量相关减少(E类_G公司). 使用加速旋转连杆检查时，对运动性能没有显著影响(H（H）). 外周左后爪（LHP）给予100ng RTX产生单侧和可逆（约20天）的热镇痛（*ANOVA与Scheffe的事后检验；P（P）< 0.005) (n个=每组5人）。右侧，右后爪；FP，前爪。(我)注射RTX后L5 DRG中TRPV1-IR神经元的保留（箭头）(J型)和未注射(K（K）)后脚掌。TRPV1-IR围节的细胞计数显示左右腰神经节之间没有显著变化（见结果）。钢筋：50μm(C类和D类); 100微米(J型和K（K）); 300微米(E类_G公司).
保持其他躯体感觉功能和运动。
重要的是，对机械刺激的反应保持不变。在所有RTX治疗的动物中，尾巴、前爪和后爪上都有带齿镊子的夹伤定位和拔出，并且反应在性质上与对照组相似。与对照动物相比，使用von Frey毛发对RTX处理的动物（3天、10天和1年）的机械反应进行定量评估也没有变化。未经治疗的对照组（轻度接触组10.9±1.8 g，提足组20.3±5.7 g）、3天后接受治疗的动物（11±1.8 g、46±30.6 g）、10天后接受治疗动物（10.1±1.1 g、22±4.6 g）之间的轻度接触或提足阈值无显著差异1年后治疗动物（11.7±0.0克，33.7±16克）。没有任何机械性疼痛的迹象，例如长时间停下来触摸冯·弗雷毛发，或从针刺中停下来评估的机械性疼痛（所有动物的停下来持续时间均为0.5秒或更短）(27).
用加速的Rota-Rod评估运动功能未发生变化，表明暴露于RTX的神经节中存在完整的运动轴突和感觉本体感受神经元（图、D和H）。犬类受试者的运动也很正常（见下文）。与三叉神经微注射一样，没有观察到感觉忽视或失神经诱导的感觉过敏综合征（例如，自闭行为）的迹象(28,29). 这些特征增强了RTX的临床适用性，因为疼痛的病理、炎症相关方面被消除，而机械感觉、运动功能和其他感觉方式保持不变。
外围RTX管理。
将同样的配体激活的钙细胞毒性概念应用于外周神经末梢，以暂时减少伤害性传递。将100 ng RTX皮下注射到后足，大约20天内显著减轻了热伤害。镇痛活性仅限于注射的后爪，对侧爪或前爪的潜伏期没有变化（图一） ●●●●。由于注射距离细胞体较远，因此预测这种影响是暂时的，TRPV1+细胞将保持完整；观察到了这两个预测结果（图，I–K）。L5神经节八个节段的TRPV1-IR神经元计数显示，注射侧119±23个神经元，对侧113±10个神经元。因此，RTX应用的剂量和解剖位置关键性地决定了镇痛作用是可逆的，如术后疼痛所需的，还是不可逆的（如晚期癌症疼痛）(30,31).
兽医临床应用。
建立犬模型是为了评估初级传入神经元缺失对更接近人类情况的临床问题的高阶哺乳动物的疗效。根据在初始队列中测定的热反应衰减，在全身麻醉下通过池穿刺给予单剂量的RTX鞘内注射（1‰g/kg）。注射前疼痛状态的视觉模拟量表（VAS）评分平均为62±7.6（平均值±SEM）；在2周的随访中，这些评分急剧下降（11±3.0），并在6周和10周时保持不变（分别为9.6±5.3和7.5±4.2）（图A） ●●●●。这些动物最初在行走时会有肢体保护，但随着时间的推移，这种保护会有所改善，日常活动也会增加，从视频记录中可以明显看出。事实上，在鞘内RTX治疗后，这些狗的整个行为表现都有所改善。RTX作用的有效性进一步通过以下方面得到证明：（a）停止或大大减少补充镇痛药的使用（所有八只狗中的阿片类药物和非甾体抗炎药），以及（b）肿瘤进展并没有减少RTX诱导的镇痛。
RTX对狗体内自然发生的肿瘤或骨关节炎的镇痛作用，以及随着时间的推移，狗DRG和大鼠TG中细胞缺失的形态学方面。(A类)鞘内RTX减少了主人在肿瘤（N）、关节炎（a）和肿瘤加关节炎（N+a）犬中使用VAS的疼痛报告(n个= 8). 条形图代表动物个体；inset表示汇总数据（*ANOVA和Scheffe的事后检验；P（P）< 0.05). (B类)神经节内给予200 ng RTX 24小时后，成年大鼠TG的高倍（∞40）图像显示大体正常。(C类)肿大显示许多中小型神经元（黑色箭头）的嗜酸性细胞质肿胀，细胞核错位，核膜部分呈波浪状，具有钙细胞毒性。大神经元（红色箭头）是正常的。(D类)鞘内注射RTX 21天后，一只成年犬的DRG显示卫星细胞呈片状增生。(E类)高倍镜下，神经吞噬明显（黑色箭头）。还可以看到一个坏死的神经元，其中的核膜在浓缩的核物质周围隐约可见（红色箭头）。在狗神经节中，30天时，受损和死亡的神经元被称为长叶结节的增殖卫星细胞集落所取代，长叶结节可视为一个增殖细胞球（未显示）。(F类)RTX治疗一年后，大鼠TG显示无细胞嗜酸性区域扩大，周围环绕着玫瑰花状卫星细胞，高倍镜下显示为红色星号(G公司). 没有证据表明胶质细胞过度扭曲增殖。棒材：100？m(B类,D类、和F类); 25英寸(C类,E类、和G公司).
大鼠和犬感觉神经节的比较组织学研究表明，RTX消除了两种动物中许多小直径神经元细胞体，对周围神经膜没有明显损伤（图，B–G）。在6、12和24小时处死的大鼠中研究特异性细胞缺失的早期形态学征象。在此期间，观察到特定神经节神经元的核膜皱褶和细胞核移位，表明神经元损伤的早期阶段（图、B和C）。在狗身上，鞘内RTX治疗3周后，濒临死亡的神经元周围发生卫星细胞激活和神经吞咽，逐渐发展为Nageotte的特征性结节，这在人类疾病的病理感觉方面已被描述（图、D和E）(32). 1年后，在大鼠神经节内观察到大尺寸神经元的滞留和卫星细胞花环内精细ECM的沉积，没有异常的瘢痕形成（图、F和G）。
RTX对人DRG神经元的影响。
用于疼痛控制的配体激活细胞缺失方法基于感觉神经节神经元亚群中TRPV1的丰富表达。进行免疫细胞化学和活性细胞成像，以确定TRPV1在成人感觉神经节中的表达，并证明在人类中给药时是否可以预期选择性（图). 而克隆的人类TRPV1已经在异源表达系统中进行了研究(33)在一个永生化的人类神经元细胞系中(34)，目前还没有关于人类DRG原代神经元对香草醛刺激的生理反应和选择性的数据。图图为正常成人DRG的结构，免疫荧光（绿色）显示人类TRPV1表达神经元。Hoechst 33342周围有“空的”腔隙+被神经元占据的卫星细胞（蓝色），其对人类TRPV1表达呈阴性。
人类DRG神经元对RTX治疗表现出选择性敏感性。(A类)H&E切片，成人DRG（*大型神经元）。(B类_D类)绿色免疫荧光人类TRPV1-IR神经元（箭头），与卫星细胞核（蓝色）形成对比。(C类)TRPV1-IR（绿色）被肽抗原吸附(D类). 通过[Ca增加评估人类胚胎DRG神经元对RTX的选择性反应2+]i使用Fluo-4 AM成像(E类和F类). 箭头表示有反应的神经元，箭头表示无反应的神经元。E类显示了图中标准化数据的前30秒的基线荧光值接近0(G公司). 在F类，跨膜钙通量导致特定神经元内的细胞内钙增加，并发出明亮的荧光。放大倍数∞200。(G公司)香草醛敏感感觉神经元中单个细胞的痕迹显示出实质性和突然的反应（痕迹1_4）。[Ca标高2+]长时间的i提示对香草醛治疗有反应的细胞即将发生细胞死亡。RTX效应具有明显的选择性；无反应细胞（痕量5~7）维持正常钙水平。归一化荧光强度增加（编号为ØF/F0的痕迹是指E类和F类). 棒材：100？m。
RTX打开人类TRPV1离子通道并增加[Ca2+]我人体TRPV1内部+DRG神经元。[Ca的这种变化2+]我可以用Fluo-4 AM检测，根据[Ca改变其荧光发射强度2+]我（图，E–G）。Fluo-4 AM成像清楚地区分了两类神经元：香草醛敏感型和香草醛不敏感型。[加利福尼亚州]2+]我对人类神经元作出反应（图，E–G；细胞1-4）长时间处于高水平，表明细胞处于受损、丧失功能状态，细胞即将死亡。无响应细胞的图像和线迹（图，E–G；细胞5-7）也很重要，因为它们证明了RTX治疗的选择性以及对无反应神经元或卫星细胞的无毒性。
讨论
这些数据证明了TRPV1的关键和必要作用+神经元在支持炎症性痛觉过敏、骨关节炎和癌症引起的痛觉感受中发挥作用，以及如何利用这一点来产生一种新的疼痛治疗方法。RTX干预消除了“C纤维通讯线路”，但并不等同于阻断这些神经元释放或反应的多种神经活性物质之一的药物（例如P物质、CGRP、谷氨酸、缓激肽、前列腺素）。参与疼痛产生的递质和受体的多样性表明，仅阻断一种元素可能不会产生有效的镇痛作用(6,12,35). 相反，消除神经末梢或胞体周围表达TRPV1的神经元的参与，揭示了这些神经元的痛觉特征及其作为药理靶点的潜力。此外，目前的化学细胞敲除并不等同于在TRPV1 KO小鼠中去除TRPV1分子(25,26)尽管RTX神经元缺失的行为表现非常相似，并进一步证明TRPV1是伤害性刺激转导中的关键分子。
RTX诱导钙2+细胞毒性是治疗性细胞缺失的拟议机制(16). 体内实验证明RTX的行为有效性，免疫组织化学证实RTX删除TRPV1+神经元。我们的结果与早期体外观察到的CAP/RTX介导的损伤和清除培养的大鼠DRG神经元或体外表达TRPV1的细胞的结果一致，似乎不支持镇痛作用的受体脱敏机制(21,36–39). RTX的效力产生了细胞内钙升高的持续时间和程度，这使其在成年动物中对细胞缺失从根本上比CAP更有效，CAP虽然具有高度的痛觉(40)，是TRPV1的一种容易可逆的激动剂(16,41,42).
这里提供的数据表明，通过“分子神经外科”进行细胞切除在选择性、有效性和无副作用方面比神经外科、化学（苯酚、乙醇）或射频神经消融技术具有一些优势。RTX去除一类神经元，而其他治疗缺乏感觉方式选择性，如果运动轴突受损，则会导致肌肉失去控制。传统的消融方法通常会导致不完全缓解或演变为耳聋疼痛综合征(43). 神经节神经元的肆意破坏会导致胶质细胞、炎症细胞和结缔组织细胞的广泛增殖，从而导致疤痕形成和神经病理性感觉问题(43,44). RTX删除TRPV1+神经元以这样一种方式避免异常解剖结构的形成。在RTX治疗的动物中，缺乏慢性行为适应障碍也可能是由于不表达TRPV1的传入纤维滞留、C纤维神经元不完全切除以及C纤维初级传入纤维上下五个或更多的皮肤节(45). 所有这些影响都可以防止因失去突触接触而引起的营养障碍和继发性神经元改变。此外，TRPV1细胞缺失并不等同于周围神经切断。以前，研究人员认为，A-β纤维的重排发生在外周神经损伤时，这刺激了A-β光纤向浅背角的侧支发芽，并在动物中产生机械敏感性超敏反应和异常行为（自闭）(28,46). 最近的证据表明，发芽率大大低于最初报道的水平(47,48).
删除痛觉感受器对阻断大鼠的炎性痛觉过敏和狗的疼痛临床表现特别有效。然而，TRPV1的损失+痛觉感受器并不能消除所有类型的疼痛感。许多动物对热刺激仍有反应，但并不是所有的动物都达到了行为极限。鞘内注射CAP也未发现对有害机械感觉的反应有明显改变(37)，表明存在不表达TRPV1的高阈值机械感受传入。对机械刺激（von Frey毛发或针刺后的退出时间）的敏感性没有增加的趋势，这表明TRPV1神经元的缺失，如本文所述，不会诱发神经病理性疼痛状态(49).
RTX给药的解剖学指导性质允许使用干预程序针对伤害性产生的部位（或多个部位）进行治疗，以可逆或不可逆结果为治疗目标。给药途径可以包括单次或多次神经节内注射，对播散性疼痛问题进行鞘内应用，或注射到周围部位。在所有情况下，受体介导钙的原理相同2+细胞毒性是有效的(50)但目前的数据表明，远端注射并没有消除表达TRPV1的DRG神经元，因此镇痛作用是暂时的。外围数据支持一种空间分隔的Wallerian-like变性，这种变性在局部发生，特别是在香草醛敏感纤维中(31,51). 由于受损的末端仍然与完整的细胞体相连，末端重新为皮肤提供神经，这一过程在本研究中大约需要20天。这种神经再支配与局部应用CAP的研究一致(52)和使用RTX的最新数据(31). 髓鞘纤维未受到早期CAP报告的影响(53). 可逆变性的程度与RTX的应用有关。虽然神经节内和外周注射定位良好，但鞘内和池内注射途径有可能通过脑脊液到达大脑。我们在RTX治疗的大鼠中未观察到行为异常。在这些狗中，即使是脑干内给药，也没有出现异常人格改变的报告。RNA印迹(14)我们自己的免疫组织化学研究也没有检测到TRPV1在大脑区域或免疫阳性神经元中的表达。行为改变的缺乏表明，尽管有CAP行动的报告(54,55)，RTX结合位点(56)，或TRPV1表达式(57)脑池内或鞘内给药对大脑高级中枢没有实质性影响。
本文概述的方法的要素分散在文献中，但由于以下几个可能的原因，尚未纳入明确的治疗干预：（a）早期研究使用CAP，这种方法对细胞删除效果较差；（b） 香草酸激动剂通常被认为是痛觉剂；（c）拟议的作用机制要么定义模糊，要么不一致，从而构成人体临床试验的基础(21,36–38,40,41,52,58). 相反，实时直接观察RTX对体外DRG神经元或表达TRPV1的细胞的作用，为治疗应用提供了直观的机制(16).
目前的实验解决了镇痛研究中的另一个关键问题，即在实验模型中对新药的评估与它们在人类临床疼痛中的最终表现之间的预测关系，在人类临床痛苦中，新药往往无效或只有最低的效果。我们引入的犬类模型在非临床啮齿动物数据和最终的人体试验之间提供了一个过渡桥梁，并强化了治疗将是安全有效的这一理念。这项犬科研究也强调了对大型动物研究需要更好的测量工具。RTX的结果足够稳健，可以很容易地由人类观察员进行评级；然而，应该开发新的方法来获得客观、有意义的测量结果。RTX在人类DRG神经元活细胞成像中的选择性提供了基本体外观察和人类临床应用之间的第二种平移观察。这些数据代表了从实验啮齿动物模型到临床兽医模型，再到探索选择性伤害性神经元缺失用于疼痛控制的临床潜力的人类细胞的一系列渐进步骤。细胞删除方法可能是目前治疗的重要替代方法，其最终应用将有助于改善持续疼痛患者的生活质量。
方法
动物。
大鼠研究程序遵循NIH《实验动物护理和使用指南》，并经国家牙科和颅面研究所动物护理和利用委员会批准。研究开始前，宾夕法尼亚大学兽医学院动物护理和使用委员会批准了一项使用RTX治疗狗的方案。
三叉神经微量注射。
雄性Sprague-Dawley大鼠（300 g，n个=54）用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，并安装在立体定向框架内。将10μl Hamilton注射器（美国内华达州里诺市Hamilton公司）放置在前角后方2.5 mm和外侧1.5 mm处。头骨被钻孔，针被向前推进，直到它轻轻地接触到头骨的底部；将针头缩回0.1 mm，在10分钟内以2μl的体积注射RTX（20或200 ng）。RTX的药理级制剂配方如下：PBS，pH 7.2，含有0.1μg/μl RTX、0.05%抗坏血酸和7%吐温80。车辆未包含RTX。NIH临床中心药物开发科对该制剂的药物纯度、稳定性、内毒素和微生物污染进行了表征。
免疫组织化学。
组织在10%的福尔马林缓冲液中固定24小时，并在石蜡中处理。如前所述，用H&E对5μm切片进行染色或用于免疫组织化学(31). 使用的主要抗体是抗大鼠TRPV1，1:1000（Affinity Bioagents Inc.，Golden，Colorado，USA）、CGRP，1:2500和小鼠单克隆N52（1:2000）（Chemicon International，Temecula，California，USA）。
成人DRG的组织学和免疫组织化学。
神经解剖研究的组织是根据特拉华谷肾脏1人类器官捐赠者计划的协议获得的。在停止灌注后1小时内取出DRG，分别对标本进行石蜡处理或冰冻切片进行组织化学或免疫组化。以1:500的稀释度使用人TRPV1特异性抗体（PA1-748；Affinity BioRegents Inc.），并在4°C下培养过夜，用FITC-偶联的AffinitiPure驴抗狂犬病IgG（711-095-152；Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.，West Grove，Pennsylvania，USA）进行可视化，并用Hoechst 33342染料（H3570；Molecular Probes Inc.，美国俄勒冈州尤金）。用于评估非特异性结合的对照组以相同的方式进行处理，除了一级抗体步骤包含2.5？g肽抗原/ml。
人类原代DRG培养。
人类DRG组织从Advanced Bioscience Resources Inc.（美国加利福尼亚州阿拉米达）获得。神经节在冷Lebowitz培养基中收集（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市Invitrogen公司）。在37°C下用0.125%胰蛋白酶消化25分钟后，将细胞接种在涂有聚乙烯的盖玻片上-D类-赖氨酸。培养基中含有DMEM和20 mM HEPES、7.5%FBS、7.5%horse血清和50？g/ml神经生长因子。第一天之后，添加5 mg/ml尿苷和2 mg/ml FUDR（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）以抑制非神经元细胞分裂。
RNA提取和RT-PCR。
切除的神经节立即在-80°C下冷冻。提取总RNA并用无RNase DNA酶处理；然后使用Access RT-PCR系统（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）在线性范围内（26个周期）反向转录和扩增5ng。大鼠TRPV1特异性引物TG-5′-AAGCGACCCTGCTCTCTCTC和TG-3′-CTCGAGTGCCTCCCTC产生100-bp的产物；GAPDH特异性引物5′-ACCACAGTCACATGCACATGTCCATCATCAC和3′-TCCACACCCTGTTGCTGTA产生452-bp的RT-PCR产物。DNA在1%琼脂糖凝胶中通过电泳分离，染色，并通过密度测定法定量。
大鼠鞘内注射。
动物(n个=58）用异氟醚麻醉，RTX（10–200 ng，30？l，10分钟）或载体通过将20号导管插入L4/L5间隙进行给药。将PE-10导管插入鞘内空间1 cm。鞘内放置的标准是将干净的脑脊液抽出导管。
足底注射RTX。
大鼠(n个在浓度范围为1、10和100？g/ml的情况下，用载体或RTX（100？l）注射=20）。观察到剂量反应，并显示了1-？g/ml剂量的时间过程数据（图一） ●●●●。对三只大鼠L5神经节同侧和对侧的三个切片进行细胞计数。
感官和生理测试。
采用CAP诱导的眼管反应，在30只大鼠TG微量注射RTX后检测三叉神经传入功能。在75%乙醇、0.05%抗坏血酸（Sigma-Aldrich）中制备5%CAP的储备溶液。稀释至0.01%后，用生理盐水（50？l）将CAP滴入角膜中，并计算1分钟内的擦拭次数。在一年的时间里，对另一组7只大鼠进行了测试。
在大鼠身上测试三叉神经的传出功能(n个=7）注射后7天。用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉大鼠，并用Nair（Carter Wallace Inc.，New York，New York，USA）脱毛。用水彻底清洗后，将含有0.05%抗坏血酸的5%CAP霜均匀地涂抹在整个头部和肩部。15分钟后，对左股静脉进行插管，并注射0.5毫升Evans Blue（Sigma-Aldrich）（20毫克/公斤生理盐水）。
对未受训练的大鼠进行辐射热测试(n个=58）根据之前发布的程序(23,24). 记录的终点是爪子拔出的延迟时间（秒）。热强度设置为产生8-10秒的退出延迟。10秒的拔出潜伏期对应于45.2°C的爪子表面温度(23). 机械感觉刺激包括用带齿镊捏、应用分级冯-弗雷纤维，以及如前所述评估针刺性痛觉过敏(27). 治疗3天、10天和1年的大鼠(n个=每组4个），然后进行机械感测和一组未经处理的对照(n个=4）进行检查。
鞘内注射载体或RTX（200 ng；n个=8，四对一组）。用异氟醚对大鼠进行轻度麻醉，并在左后足跖表面注射溶于生理盐水的100？l4%卡拉胶（C-3889；Sigma-Aldrich）。
对鞘内注射（载体和RTX）的大鼠在加速的Rota-Rod上进行运动和本体感觉评估（5分钟内4–40 rpm；型号7750；Ugo Basile Biological Research Approach，Comerio，Italy）。
鞘内注射狗。
我们招募了患有晚期癌症或骨关节炎的狗(n个=8），其主人将其带到兽医诊所进行评估，因为目前的药物无法很好地控制疼痛。这是一项开放式设计研究，既出于道德原因，也因为单剂量鞘内注射RTX的作用持续时间非常长，我们假设RTX可以持续改善活动和动物个性问题，从而在第三方观察者中维持“安慰剂效应”。
用异氟醚和氧气对狗进行全身麻醉。用一根20号4厘米长的脊柱针刺穿大池。当针头正确放置时，脑脊液会自由流动。在10分钟内注射单次剂量为1？g/kg的RTX，然后注射0.2 ml无菌生理盐水；静脉芬太尼可控制任何唤醒效果。
VAS额定值。
为了评估单剂量鞘内RTX的效果，主人被要求在治疗前后使用100毫米VAS对狗的疼痛进行评分，0表示没有疼痛，100表示可以想象的最严重疼痛。分别在注射前、注射后2周、6周和10周进行评级。（一些病例中缺乏数据是由于主要病理学进展或并发症后的安乐死所致。）
致谢
这项研究得到了NIH临床中心和国家牙科和颅面研究所壁内研究部的“床边到床边倡议”的支持。我们感谢Chino Anyanwu、Ruth Yaskovich和Joseph Nezgoda提供的杰出技术支持。我们还感谢苏珊·胡佛和杰弗里·科恩对人类DRG文化的帮助。
脚注
使用的非标准缩写：降钙素基因相关肽；辣椒素；背根神经节；细胞内游离钙浓度（[Ca2+]我); 免疫反应（IR）；树脂再生素（RTX）；瞬时受体电位阳离子通道，V亚家族，成员1（TRPV1）；三叉神经节；视觉模拟量表（VAS）。
利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。
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