内皮一氧化氮：健康心理的保护者^†

脑血管内皮中的一氧化氮

血管内皮具有产生和释放血管活性物质的能力，从而积极参与局部控制血管直径和组织灌注。内皮细胞中NO的产生被认为是最重要的血管扩张机制，负责维持适当的血管舒缩功能。在发现NO并确定内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的酶活性是NO的主要来源后不久，人们推测NO的丢失是内皮功能障碍发病的中心机制。事实上，在大脑和外周血管中，NO可用性的降低会导致血管功能的重大有害改变，包括血管收缩倾向、动脉血压升高和动脉粥样硬化的发展。²内皮细胞NO的丢失也会促进平滑肌细胞的增殖、血小板聚集、白细胞粘附和炎症，从而在血管疾病的发生和发展中发挥重要作用。在脑循环中，保护内皮细胞NO的生成是预防脑血管疾病和中风的重要策略。eNOS的激活通过维持脑血流量、防止炎症、血小板聚集、血栓形成和细胞凋亡，介导对中风的保护作用。²此外，eNOS在祖细胞动员和新生血管形成中起着关键作用。^三认识到内皮细胞的局部旁分泌功能直接影响神经功能，大大扩展了内皮细胞功能障碍的概念。⁴完整的内皮细胞可以在大脑中提供细胞保护和自我平衡功能，这一事实提出了一个有趣的可能性，即大脑循环中的内皮细胞功能障碍可能导致神经系统疾病，如果不是真正导致的话。在这方面，内皮细胞释放的NO直接影响神经细胞功能的能力值得关注。这一概念可能有助于定义血管风险因素、内皮NO损失和神经系统疾病发病机制之间联系的分子机制。

血管危险因素与内皮一氧化氮

由活性氧（主要是超氧阴离子）过度产生引起的氧化应激被认为是危险因素剥夺内皮细胞NO的最重要机制。鲁班伊和万霍特的精液观察⁵关于超氧阴离子化学灭活内皮衍生舒张因子/NO的能力，引发了一场确定超氧阴离子内皮来源的激烈努力。此外，该观察为研究氧化应激在血管疾病发病机制中的作用提供了一个机制框架。现已明确，在内皮细胞中，除线粒体外，NADPH氧化酶、未偶联eNOS、环氧合酶和黄嘌呤氧化酶的活性也是超氧阴离子的重要来源。⁶血管危险因素促进NADPH-氧化酶活性的上调，产生超氧阴离子，并随后对NO进行化学灭活。此反应产生一种强有力的氧化剂，过氧亚硝酸盐。⁷过氧亚硝酸盐产量增加引起的氧化应激可能会氧化四氢生物蝶呤（BH4），这是eNOS活性所需的一个重要辅助因子。如果BH4的浓度变为次优，eNOS就会解偶联，从而导致内皮细胞NO生成减少，超氧阴离子和过氧亚硝酸盐生成增加。⁸在这篇综述的背景下，重要的是要指出，在脑循环中，淀粉样前体蛋白（APP）的顺序裂解[通过β位点APP-裂解酶1（BACE1）和γ-分泌酶的活性]产生的淀粉样β（Aβ）肽的局部浓度增加；图1]刺激产生超氧阴离子。⁹β淀粉样蛋白是定义阿尔茨海默病（AD）的神经血管病理学的关键因素。同样重要的是，Aβ对脑循环的有害影响先于认知功能下降，因此提示脑血管功能受损可能在认知功能障碍的发病机制中发挥重要作用。¹⁰

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图1

在非淀粉样变途径中(A类)APP首先被Aβ序列中的α-分泌酶裂解，从而生成APPsα外结构域。γ-分泌酶的进一步处理导致p3片段的释放。在淀粉样蛋白生成途径中(B类)β-分泌酶（BACE1）裂解APP并生成APPsβ外结构域。γ-分泌酶的进一步处理导致细胞毒性Aβ的释放（经参考文献允许复制⁵⁰).

内皮一氧化氮在阿尔茨海默病发病机制中的作用

从历史上看，对Aβ脑血管效应的兴趣是由Selkoe和Hardy于1991年提出的AD淀粉样蛋白假说引起的。^11,12在过去20年中，APP的淀粉样蛋白生成过程过度和Aβ局部浓度升高明显导致脑血管内皮功能障碍。¹³在AD的实验模型中，幼年动物的脑血管内皮功能早在AD病理发展和出现可检测的认知功能下降之前就受损了。¹³从机制上讲，AD模型中的内皮功能障碍似乎是由NADPH-氧化酶活性产生的超氧阴离子的增加引起的。¹⁴NADPH-氧化酶催化亚单位Nox2的基因失活可预防年轻APP转基因小鼠的内皮功能障碍。¹⁵此外，药物抑制NADPH-氧化酶或Nox2基因失活可恢复老年APP转基因小鼠脑动脉的内皮功能。¹⁵Aβ1-40激活清道夫受体CD36是信号传递中的关键步骤，负责NADPH氧化酶的上调以及随后大脑动脉中超氧阴离子生成的增加。¹⁶CD36也促进脑淀粉样血管病。¹⁶相反，在AD实验模型中，CD36的基因失活可保护脑小动脉免受Aβ1-40的有害脑血管作用。最值得注意的是，CD36的缺失也会显著改善AD小鼠的认知能力。¹⁶这些观察结果支持了CD36是AD内皮功能障碍发病机制的关键信号分子的概念。有趣的是，在过度表达突变形式APP的转基因小鼠中，循环血液和大脑中的aβ可以升高（如Tg2576小鼠^17,18)或主要在大脑中（Tg-SwDI小鼠¹⁷). 尽管在两种AD模型中均观察到内皮依赖性舒张功能受损，但在Tg2576小鼠中，这种受损更为明显，因此表明循环Aβ的增加显著导致内皮功能障碍。

大脑动脉没有外部弹性层，因此在AD进展过程中，Aβ1-40和Aβ1-42（从神经组织释放）的聚集形式积聚在中小动脉血管内，导致大脑淀粉样血管病。¹⁹Aβ累积的周向条带表明Aβ也可能起源于血管平滑肌细胞。¹⁹平滑肌层的这些病理变化很可能是血管舒张受损、高碳酸血症和神经血管耦合的原因。内皮一氧化氮的丢失是否会影响人类脑淀粉样血管病的发生和发展尚不清楚，尚待确定。

考虑到大脑没有淋巴管，血管周围的空间充当淋巴系统，^20,21神经细胞和其他细胞产生的Aβ通过毛细血管和动脉壁基底膜上的间质液体的血管周引流从大脑中排出，最终将Aβ排入颈部淋巴结。²¹血管脉动被认为会刺激间质液体沿血管壁流动。²¹随着年龄增长，动脉硬化，可以想象血管搏动的幅度会降低，从而导致脑引流系统受损。²¹内皮细胞NO的丢失可能会显著导致脑血管硬化，从而对aβ的清除产生不利影响。事实上，先前的研究表明，内皮NO的可用性降低会增加动脉硬化。²²

形成血脑屏障（BBB）的内皮细胞也积极参与Aβ向循环血液的清除，BBB清除功能障碍被认为是AD发病的重要机制。²³晚期糖基化终产物受体（RAGE）介导循环Aβ通过血脑屏障流入和重返大脑。另一方面，低密度脂蛋白受体相关蛋白-1（LRP）介导Aβ从大脑向循环血液的清除。²³肝脏和肾脏负责系统清除游离Aβ以及循环可溶性LRP和Aβ之间的复合物。内皮NO的丢失是否会影响BBB依赖性或aβ系统清除的机制尚未研究。然而，现有证据表明，脑毛细血管中eNOS的表达与阿尔茨海默病损害负荷之间存在显著的负相关。²⁴这些结果表明，eNOS可能是内皮细胞aβ转运蛋白（包括LRP和RAGE）的直接调节剂。另外，观察到的毛细血管eNOS表达减少可能是AD进展导致的血管损伤和内皮细胞稳态丧失的次要现象。

内皮一氧化氮与突触可塑性

现有证据表明，内皮NO可以影响皮层和纹状体的突触可塑性。^25,26目前的文献也有力地支持eNOS在调节海马突触功能中的主要作用，海马是AD发病机制中第一个也是最严重的大脑区域。²⁷事实上，霍珀和加思韦特的研究²⁸表明血管内皮中NO的生成是海马突触功能所需的关键信号。长期增强依赖于神经元NOS激活引起的NO的相控释放，以及eNOS活性引起的NO强直释放。这一结论基于eNOS的药理和基因失活所产生的结果。²⁸NO增强突触活性是通过激活可溶性鸟苷酰环化酶和增加环GMP的产生来介导的。²⁹需要强调的是，在海马体中，eNOS只在血管内皮中表达。³⁰值得注意的是，先前的研究表明，内皮源性NO可以移动到距离内皮细胞约100μm的距离。^31,32脑毛细血管和神经细胞之间的距离为～25μm，在内皮NO扩散范围内。³³与这些观察结果一致，对实验动物的研究，包括大鼠、小鼠、鱼类、鸟类和蜗牛（由Bon和Garthwaite审查²⁹)支持完整的NO/cGMP信号是记忆形成所需的基本机制这一概念。因此，长期暴露于血管危险因素可能导致内皮细胞NO的丢失，从而导致神经功能受损和认知功能下降。与此相关的流行病学研究证实，中年动脉血压升高会显著增加晚期AD的风险。³⁴在这些研究中，在AD诊断前10–20年进行了血压测量。尽管血压升高与AD的确切分子机制尚未明确，可以想象，高血压引起的内皮细胞NO的丢失和cGMP信号的中断可能有助于AD的发展。因此，目前，控制动脉血压和终生保持血管健康被认为是保护大脑免受认知衰退影响的重要策略。³⁵

内皮一氧化氮与淀粉样前体蛋白的加工

以前对eNOS缺乏小鼠的研究证实，脑循环中内皮细胞NO生成的减少不会影响基底脑血流量。³⁶然而，当暴露于局灶性脑缺血时，与野生型动物相比，eNOS-null小鼠表现出更严重的血流动力学缺陷，表现为更大的坏死面积和显著减少的半影。³⁷对表达组成活性eNOS的转基因小鼠的进一步研究表明，在局灶性脑缺血期间，脑血管内皮细胞中NO的生成是一种重要的保护机制，旨在维持正常的脑血流量，并将神经组织的损失降到最低。³⁷

与AD的发病机制有关，在培养的人脑微血管内皮细胞（BMEC）中eNOS的药理学或遗传失活增加了APP和BACE1的表达，从而有利于APP的淀粉样化过程。^38–40此外，在来源于NO-deprived BMEC的细胞培养液中，Aβ1-40和Aβ1-42的水平显著增加³⁸从而表明NO的丢失促进了细胞毒性Aβ肽的产生和释放。这些观察结果还表明NO在调节APP表达和处理中起着重要作用。对eNOS缺乏小鼠的检查表明，NO的调节作用不仅限于脑微血管。eNOS缺乏小鼠大脑中APP和BACE1的表达增加以及Aβ肽浓度升高^38–40(图2)，从而证明内皮NO是APP处理的关键调节剂体内值得注意的是，eNOS失活也增加了人类脑微血管中APP和BACE1的表达（未发表的观察结果）。我们小组还证明，用硝酸甘油补充NO可抑制eNOS-null小鼠脑微血管中APP和BACE1的表达，³⁹从而证明外源NO抑制Aβ肽的生成。总之，这些发现提供了一个新的机制框架，可能有助于确定血管危险因素、内皮NO和认知障碍之间的关系。

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图2

内皮细胞NO的缺失促进eNOS缺乏小鼠大脑中APP的淀粉样生成过程，如APP、BACE1和Aβ肽水平增加所示（经参考文献允许复制³⁸).

内皮一氧化氮和小胶质细胞

小胶质细胞代表大脑和脊髓的常驻巨噬细胞。这些免疫活性细胞参与神经元组织对不同病理因子和损伤的防御。小胶质细胞不断地观察大脑环境，如果面临病理变化或受伤的组织可能会被激活。⁴¹小胶质细胞参与了AD的发病机制，但其确切作用尚不清楚。小胶质细胞在AD的发展过程中可能发挥有益和有害的作用。⁴²在这方面，有趣的是，eNOS缺陷小鼠的小胶质细胞标记物分化簇（CD）68、电离钙结合接合器分子（Iba）1和主要组织相容性复合体（MHC II）的表达升高。⁴⁰这些观察结果表明，小胶质细胞可以检测到血管内皮中NO的丢失，但eNOS缺失小鼠小胶质细胞激活的确切机制尚待确定。此外，eNOS的基因失活还导致脑内粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-1α和巨噬细胞炎症蛋白-1β水平升高。⁴⁰这些细胞因子的确切来源尚未确定；然而，很明显，内皮细胞中NO生成的缺乏促进了大脑中的促炎表型。由于在某些情况下，炎症可能会对脑组织再生产生刺激作用，因此尚不清楚eNOS基因敲除小鼠大脑中检测到的变化是否代表一种旨在保护神经组织的适应性反应。相反，NO的丢失可能引发炎症反应，可能对神经组织产生有害影响，从而促进AD的发展和进展。值得注意的是，eNOS缺陷小鼠表现出空间记忆缺陷，表明cGMP信号的受损，APP淀粉样蛋白生成过程的增强以及由此产生的炎症环境可能是导致认知下降的重要因素。⁴⁰最重要的是，这些发现提供了证据，表明内皮细胞NO在痴呆发病机制中的作用可能比先前认为的要复杂得多。事实上，除了调节脑血流量外，内皮一氧化氮还影响神经元和小胶质细胞的功能(图三). 因此，可以想象，长期接触血管危险因素可能会降低内皮NO的生物活性，从而显著增加大脑对包括AD在内的神经退行性疾病的易感性。

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图3

内皮NO对脑血管内皮和神经细胞中APP、BACE1和Aβ的抑制作用示意图。此外，内皮NO对小胶质细胞中CD68、Iba-1和MHC-II表达的抑制作用也被显示出来（经参考文献允许复制⁴⁰).

内皮一氧化氮与线粒体功能

线粒体功能障碍被认为是AD发病机制的重要因素。先前的研究证实，内皮NO刺激线粒体生物生成。⁴³eNOS缺乏小鼠的大脑、肾脏、肝脏、心脏和腓肠肌的线粒体含量显著降低，这与低氧消耗和ATP含量有关。⁴⁴NO对线粒体生物发生的刺激作用是由可溶性鸟苷酸环化酶的激活和环状GMP的形成增加介导的。此外，限制热量摄入是一种延长寿命的干预措施，通过诱导eNOS的表达促进线粒体的生物生成。⁴⁵在eNOS-null小鼠中，热量限制对线粒体生物生成的刺激作用被消除，从而表明保持正常的内皮细胞NO生成是组织代谢的重要调节器。事实上，eNOS缺乏小鼠表现出胰岛素抵抗、血脂异常和高血压，这些是代谢综合征的典型特征。⁴⁶因此，保持健康的内皮细胞和NO的正常生物利用度不仅是预防心脑血管疾病的重要目标，也是维持组织实质内稳态功能的重要目标。

与eNOS缺乏小鼠的研究结果相反，对脑血管内皮源NO的生理浓度和作用靶点的分析表明，在生理条件下，NO不会影响脑组织中的线粒体呼吸。⁴⁷乙酰胆碱、缓激肽或磷酸化对eNOS的激活以及随后内源性NO生成的增加并没有达到足够高的浓度来抑制细胞色素c氧化酶和氧气消耗。⁴⁷值得注意的是，环状GMP的水平显著增加，从而表明NO的浓度足以激活环状GMP信号传导，但不能抑制细胞色素c氧化酶。作者进行了广泛的研究，旨在模拟预测的NO浓度体内并得出结论，内皮释放的生理NO浓度过低，不会影响脑线粒体呼吸。该结论与eNOS阴性小鼠的研究结果之间存在差异的确切原因尚不清楚。