记忆T细胞上IL-7受体的选择性表达可识别CD40L依赖的早期CD8生成⁺记忆性T细胞亚群

摘要

众所周知，CD4⁺T细胞帮助可以调节或形成病原特异性CD8⁺记忆T细胞反应(1). 在缺乏T细胞帮助的情况下，T细胞启动后，保护性免疫质量逐渐降低(2–4)和“无帮助”CD8⁺T细胞对抗原再激发反应很差。CD8（CD8）⁺CD4中产生的T细胞⁺T细胞缺乏的环境在转移到CD4正常的受体小鼠后维持这种改变的记忆表型⁺T细胞室，表明启动期的“指导性”事件决定了T细胞记忆的质量(2–4). CD40–CD40L相互作用已被证明参与T细胞帮助的关键步骤(5–7); 然而，CD4缺失时记忆缺陷的确切性质⁺T细胞或CD40–CD40L相互作用尚未确定。识别这一现象背后的机制对于理解保护性免疫是如何产生的具有普遍重要性。例如，辅助机制招募不足可能解释了大多数基于T细胞的疫苗无法长期维持有效的抗原特异性记忆T细胞群，尽管这些疫苗的初始T细胞反应通常相当强烈。此外，缺少T细胞帮助可能是CD8无效的原因⁺HIV患者和其他免疫缺陷患者的T细胞反应。

尚不清楚“无帮助”CD8是否⁺记忆性T细胞不会随着时间的推移而维持，或者如果在没有CD4的情况下产生了具有真正功能差异的记忆性T细胞⁺T细胞。我们决定更详细地描述CD8⁺产生记忆T细胞体内无论是否有CD4⁺T细胞帮助。我们选择小鼠感染单核细胞增多性李斯特菌(Lm（磅）)作为一个模型，因为最近的一些报告已经证明了T细胞在这个实验系统中帮助记忆T细胞发育的重要性(三,4). 然而，由于缺乏区分效应T细胞和记忆T细胞表型的标志物，小鼠记忆T细胞的分析变得复杂。此外，记忆T细胞室本身似乎是异质的。中央存储器T细胞（T_厘米)亚群优先存在于淋巴器官，缺乏直接效应器功能，具有强烈的稳态和抗原驱动的增殖；T的维护_厘米似乎依赖于T细胞生长因子（如IL-2、IL-15或IL-7）通过普通γ链受体发出的信号(8–10). 另一方面，外周效应器记忆T细胞（T_{相对长度单位})存在以抗原再计数器即时效应器功能为特征的亚群(11–13). 学习中的主要问题之一体内记忆T细胞发育是指，迄今为止，具有效应功能的记忆T细胞无法与“后”效应T细胞明确区分，后者被认为在原代T细胞反应后迅速删除；两个效应T细胞（T_E类)效应记忆T细胞优先迁移到非淋巴样器官，其维持依赖于局部“微纤毛”提供的生存因子_E类，T型_{相对长度单位}、和T_厘米)，在描述体内记忆性T细胞分化的状态（即使是我们自己在本研究中的数据也表明，在亚群中可能存在额外的异质性），记忆性T淋巴细胞两个主要亚群（T_{相对长度单位}和T_厘米)最近，小鼠“全身”T细胞分析令人信服地证实了具有不同迁移模式(11,12). 在人类中，不同的记忆T细胞亚群可以通过CCR7表达与CD45RA结合来进行表型区分(13)尽管最近的一些研究表明这些标记并不总是与相同的功能分化模式相关(14). 在鼠标中，我-选择素（CD62L）的表达介导T细胞迁移到淋巴器官，已被用作区分T细胞的标记物_厘米从T开始_{相对长度单位}(15,16)，但CCR7和CD62L的表达与T_厘米(15,17).

在这项研究中，我们将IL-7受体α链的表面表达确定为记忆性T细胞标记物，特别是使我们能够在早期的时间点区分效应性T细胞和记忆性T淋巴细胞体内免疫反应。

材料和方法

老鼠和细菌。BALB/c和C57BL/6小鼠取自Harlan Winkelmann（德国Borchen）；MHC II类（MHC II）-/-小鼠（B6/I-Aβ-/-）、BALB/c Thy1.1和CD40L-/-鼠（BALB/c-背景，由耶鲁大学R.Flavell善意提供）是在特定无病条件下通过内部繁殖获得的。通过静脉注射WT进行感染实验Lm（磅）10403s菌株（BALB/c小鼠）或李斯特菌属表达重组卵清蛋白（由费城宾夕法尼亚大学H.Shen善意提供），用于C57BL/6实验(18). 剂量≈2×10⁴静脉注射Lm（磅）10403s代表LD₅₀用于BALB/c小鼠。

用MHC多聚体试剂进行T细胞表型分析。氢-K^d日/LLO公司_91–99和H2-K^b条/SIINFEKL多聚体试剂的生成如下所述(19). 为了区分活/死细胞，细胞与乙炔单酰肼（分子探针）孵育，然后在4°C下进行MHC多聚体和表面标记染色45分钟。使用了以下单克隆抗体：抗CD8α（克隆53-5.8）、抗CD4（克隆RM4-5）、抗CD62L（克隆MEL-14）、抗-CD127（克隆SB/14；阻断抗体），均来自Pharmingen，以及抗CD127（克隆A7R34，eBioscience，San Diego；刺激抗体）。用于与H2-K配套^b条/使用SIINFEKL四聚体、抗CD8α特异性单克隆抗体（克隆CD8α；Caltag，加利福尼亚州南旧金山）。数据通过FACSCalibur（Becton Dickinson）或CyAn分析仪（DakoCytomation）获得。采集的数据进一步分析牢房任务或flowjo公司（Tree Star）软件。

细胞内细胞因子染色、细胞毒性测定和增殖试验。抗原特异性T细胞用可逆MHC多聚体试剂（链霉菌）染色，然后用MoFlo（DakoCytomation）直接分类到d日-含生物素的缓冲液，用于从细胞表面去除MHC多聚体（均在4°C下完成）。分类抗原特异性T细胞李斯特菌属-将受感染的小鼠在照射过的、带有相关表位（10）脉冲的自体脾细胞中短暂孵育5小时^–6M） ；在最后3小时，添加Brefeldin A（GolgiPlug，Pharmingen）。根据制造商的建议，使用Cytofix/Cytoperm试剂盒（Pharmingen）对IL-2、IFNγ和肿瘤坏死因子α（Pharmingen）进行细胞内细胞因子染色。为了进行细胞毒性实验，将BALB/c小鼠的分类T细胞亚群在⁵¹Cr标记的肽脉冲P815靶细胞。细胞增殖由在体外孵化体外在抗CD3-刺激Ab和经照射的自体脾细胞存在下，分选、羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记的抗原特异性T细胞群3天；流式细胞术观察细胞分裂。

细菌清除。质量李斯特菌属-通过测量感染高剂量（≈10×LD）后3天脾脏的细菌负荷来确定特异性保护₅₀)第页，共页Lm（磅）通过在脑心输液肉汤琼脂糖上镀出系列稀释液(18).

在体内BrdUrd接收。对于体内增殖试验，将BrdUrd（Sigma）添加到饮用水中（0.8 mg/ml），在再次感染Lm（磅）在再次感染后第3天或第5天采集脾细胞，并如所述对BrdUrd进行染色(20). FITC-偶联抗BrdUrd单克隆抗体（Becton Dickinson）用作流式细胞术分析的检测试剂。

过继细胞移植。LLO公司_91–99-特定CD8⁺T细胞来自李斯特菌属-感染的Thy1.1 BALB/c小鼠在用APC缀合的可逆MHC多聚体染色后，通过在MoFlo上基于流式细胞术的细胞分选（DakoCytomation）分离；在1mM存在下纯化后去除表面结合的MHC多聚体d日-生物素(21). 然后5×10⁵将细胞静脉注射到Thy1.2 BALB/c小鼠体内；在转移后3周处死小鼠，并对脾、肺和淋巴结（LN）的淋巴细胞进行Thy1.1和CD8α染色。在过继细胞移植后的感染实验中，小鼠感染了10只^三 Lm（磅），通过Thy1.1阳性CD8染色追踪不同器官中转移的细胞⁺如上所述的T细胞。

结果

IL-7受体的鉴定α链（CD127）作为记忆性T细胞的标记物。在寻找新的标记物来定义小鼠效应和记忆T细胞亚群的同时，我们分析了IL-7受体α链/CD127的表面表达(图1一). 在主要响应期间Lm（磅）根据CD127的表达水平，可以区分抗原特异性脾T细胞群的不同亚群。CD127低表达细胞（CD127^低的)在急性效应期占主导地位。然而，在过渡到记忆T细胞阶段的过程中，CD127^低的细胞逐渐消失，而人群表达高水平（CD127^高的)随着时间的推移，尺寸保持显著稳定(图1一和c（c）). 这些不同的动力学值强烈表明CD127表达是长寿记忆T细胞的一个选择性特征。在效应器阶段，CD127^低的CD8（CD8）⁺T细胞优先迁移到非淋巴样器官，而只有CD127^高的CD8（CD8）⁺LN中检测到T细胞(图1b条). 脾脏是一个“中间器官”，在免疫后早期发现所有不同的亚群(22,23). 在记忆期的后期，所有器官中的抗原特异性T细胞都以CD127为特征^高的表型(图1b条和c（c）). CD127的性能比较^低的和CD127^高的抗原特异性T细胞在刺激下增殖，显示出两个亚群之间的显著差异。如所示图1d日，已净化李斯特菌属-特定CD127^高的T细胞在抗CD3刺激后迅速增殖，而CD127^低的T细胞增殖不良。这些增殖差异不太可能反映出CD127阳性细胞通过Ab介导的IL-7R刺激的优势，因为具有已知CD127激活或阻断活性的不同mAb克隆在短期内表现出相同的效果在体外刺激试验（数据未显示）。

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图1。

CD127（IL-7R）表面表达作为记忆性T细胞的标记物。(一)一组BALB/c小鼠被亚致死剂量（≈0.1×LD）感染₅₀)WT的Lm（磅）其次是继发感染（≈10×LD₅₀)5周后。脾细胞的代表性点图（活体CD8上的门控⁺T细胞）用H2-K染色^d日/LLO公司_91–99四聚体(年轴）和用于CD127表面表达(x个轴）显示了主要过程中指示的时间点(上部)和召回(下部)回应。(b条)在初级效应器（感染后7天）和记忆（感染后35天）阶段，分离不同器官的淋巴细胞。代表性直方图在CD8上选通⁺和H2-K^d日/LLO公司_91–99四聚体阳性细胞，显示CD127染色（开放）和未染色对照（填充）。(c（c）)绝对数动力学(年轴）CD127高（填充）和低（开放）表达CD8⁺和H2-K^d日/LLO公司_91–99四聚体阳性细胞；每个时间点六只老鼠。(d日)CD127高表达和低表达CD8⁺，H2-K^d日/LLO公司_91–99多聚体阳性细胞直接分类体外10天后李斯特菌属感染。检测抗CD3刺激后羧基荧光素琥珀酰酯类标记细胞的增殖情况；CD127型^高的（粗体行）或CD127^低的（细线）细胞。

为了更直接地证明长寿记忆T细胞只存在于CD127高表达区体内启动后，我们使用最近开发的可逆MHC多体染色技术进行了过继转移研究(21)直接从功能上分离抗原特异性T细胞体外CD127过户后^高的LLO公司_91–99-来自感染10天的小鼠的特异性T细胞Lm（磅）数周后，在幼年受体小鼠的脾脏中仍能检测到转移的细胞(图2一)而CD127转移后的细胞数^低的细胞处于检测极限。这一观察结果并非由于体内转移CD127的迁移^高的和CD127^低的细胞，因为我们发现肺部有类似的差异(图2一)和其他器官（LN和肝脏，数据未显示）。为了进一步支持CD127的解释^高的T细胞专门维持抗原特异性记忆细胞，受体小鼠在过继移植后受到李斯特菌属感染。同样，只有接受CD127的小鼠^高的感染前的T细胞是转移的LLO的快速扩增_91–99-可检测的特异性T细胞(图2b条). 同样，这一结果并不是由于转移CD127的维护或扩展导致的迁移差异所致^低的其他器官中均未检测到T细胞(图2b条和数据未显示）。虽然过继转移研究的结果强烈支持了CD127中只存在长寿记忆T细胞的假设^高的T细胞室，我们也观察到这种实验方法的实质性局限性。特别是，具有即时效应功能的记忆性T细胞似乎对过继转移实验非常敏感，在纯化和静脉注射后迅速死亡；尽管如果不动，它们可以存活数月至数年体内(11). 因此，尽管我们从过继转移中获得的结果符合CD127是长寿记忆T细胞的标记这一解释，但我们不能排除与不同T细胞亚群存活有关的内在问题也会对这些实验的结果产生影响。

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图2。

过继转移研究表明，长寿记忆T细胞仅存在于CD127阳性区室中。CD127高表达和低表达CD8⁺，H2-K^d日/LLO公司_91–99直接分选BALB/c Thy1.1小鼠的多聚体阳性细胞体外10天后李斯特菌属感染。将细胞转移到原始BALB/c（Thy1.2）受体小鼠中，3周后对脾和肺进行供体细胞染色（CD8⁺和Thy1.1⁺). (一)条形图总结了Thy1.1绝对数的数据⁺CD127转移后每个器官的细胞数^高的单元格（打开）或CD127^低的（填充）T细胞。(b条)数据采集和数据呈现与中所述相同一感染后5天，10^三 Lm（磅）.

抗原特异性T细胞群体与CD127和CD62L的结合允许记忆T细胞亚群之间的区分。CD127的进一步表征^高的T细胞群显示，它可以细分为表达高水平和低水平CD62L的亚群(图3). 直接体外功能分析(21)纯化的T细胞（感染后10–12天，脾脏中所有亚群都能同时检测到）发现了进一步的功能差异。鉴于CD62L^低的T细胞亚群表现出活力和即时性体外细胞溶解活性，CD127^高的/CD62L型^高的T细胞表现出对肽包被靶细胞的溶解能力很差(图3). 分类亚群的细胞内细胞因子染色显示CD127^高的/CD62L型^低的T细胞，如CD127^低的/CD62L型^低的亚群，产生效应细胞因子INF-γ和肿瘤坏死因子α；相反，CD127^高的/CD62L型^高的亚群产生IL-2，但不产生IFN-γ和肿瘤坏死因子α。因此，CD127和CD62L的标记组合能够识别与前面描述的人类T细胞亚群特征非常相似的T细胞亚群体。CD127型^低的/CD62L型^低的T细胞显示了真实效应T细胞群（T细胞）的所有已知特征_E类，增殖活性差，有限体内生存和即时效应器功能）。CD127^高的/CD62L型^高的子集匹配T的特征_厘米和CD127^高的/CD62L型^低的T细胞符合T的描述_{相对长度单位}.

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图3。

CD127/CD62L双重染色区分不同CD8⁺T细胞亚群；在人类身上也可以发现类似的结果。CD8双重染色⁺，H2-K^d日/LLO公司_91–99表面表达CD62L的多聚体阳性细胞(年轴）和CD127(x个轴）感染后Lm（磅）; 指出了象限中各亚群的相对百分比。CD127型^低的/CD62L型^低的，CD127^高的/CD62L型^低的和CD127^高的/CD62L型^高的直接对亚群进行排序体外12天后李斯特菌属感染并转移到不同的功能检测中。在靶细胞和LLO存在的情况下培养分选细胞后，评估细胞溶解活性_91–99肽（方形）或无肽（圆形）。细胞内细胞因子染色体外分类LLO_91–99-对IL-2进行了特定的亚群（如上所示）(顶部)，干扰素-γ(中部)和肿瘤坏死因子α(底部)简短之后在体外用LLO重新刺激_91–99肽（黑色区域；白色区域代表未刺激的对照）；显示了细胞因子阳性细胞的百分比。

不同记忆T细胞亚群的产生依赖于CD40L介导的T细胞帮助。由于我们认为，仅根据过继细胞移植实验来解释CD127表达可作为区分效应细胞和长寿记忆T细胞的标记可能有问题，因此我们决定分析T细胞记忆生成缺陷的小鼠突变系。如果CD127确实是一个“早期”记忆T细胞标记物，我们应该能够识别记忆缺陷小鼠CD127阳性亚群在早期和晚期时间点的差异。

因为最近的研究表明T细胞对产生长期记忆反应的重要性(2–4)，我们决定确定CD4是否存在⁺CD8期间的T细胞帮助⁺T细胞启动导致在早期后效应期检测到的抗原特异性T细胞亚群组成的差异。缺乏传统CD4的MHC II缺陷小鼠⁺T细胞有缺陷CD8⁺内存响应和保护质量会随着时间的推移而降低(2–4). 初次感染10天后T细胞亚群染色显示CD127^高的/CD62L型^低的亚群在MHC II–/–小鼠中几乎完全缺失(图4一); 其他亚群的出现频率与WT C57BL/6小鼠相似。这些数据表明，T细胞的缺乏有助于阻止具有效应记忆表型的T细胞亚群的有效生成，这似乎对快速体内扩展和效应器功能。

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图4。

MHC II–/–和CD40L–/–小鼠的记忆反应受损与不同T细胞亚群生成的早期缺陷相关。(一)重量C57BL/6(左侧)和MHC II缺陷(赖特)小鼠感染了亚致死剂量的表达卵清蛋白的卵清蛋白Lm（磅）; CD8的点图⁺，H2-K^b条/SIINFEKL阳性T细胞CD62L染色(年轴）和CD127(x个axis）显示原发感染后10天。(b条)再次感染后3天脾脏中的活菌数（≈10×LD₅₀; 初次感染后5周）李斯特菌属CD40L–/–（填充）和WT BALB/c（打开）中；n个=每组3人。(c（c）)LLO动力学_91–99-H2-K测定的特异性T细胞^d日/LLO公司_91–99CD40L–/–（•）或WT BALB/c小鼠的四聚体染色(□) 一次之后（0.1×LD₅₀)和回忆感染（2.5×LD₅₀; 初次感染后5周）Lm（磅）; 每个时间点三只老鼠。(d日)WT BALB/c小鼠和CD40L–/–小鼠在召回感染期间通过饮用水接受BrdUrdLm（磅）（2.5×LD₅₀; 原发感染后5周）；点图显示BrdUrd合并(x个轴）在CD8中⁺H2-K染色的T细胞^d日/LLO公司_91–99四聚体(年axis），第5天进行染色。(e（电子）)CD8双重染色⁺，H2-K^d日/洛_91–99CD40L–/–BALB/c小鼠CD62L四聚体阳性细胞(年轴）和CD127(x个axis）初次感染后10天（WT BALB/c对照见图2c（c）). (（f）)LLO绝对数_91–99初次感染10天后，通过CD62L和CD127染色测定脾脏中四聚体阳性T细胞亚群。

因为CD4的重要机制⁺通过CD40和CD40L的相互作用调节T细胞的帮助(24–26)，我们研究了CD40L–/–小鼠是否表现出与MHC II–/–鼠相似的表型。根据其他近期研究(27)，CD40L–/–小鼠初诊后细菌负荷或细菌清除率无差异李斯特菌属感染（数据未显示）且原发CD8正常⁺亚致死剂量的T细胞反应Lm（磅）(图4c（c）). 然而，他们用较高剂量的Lm（磅）（≈10×LD₅₀)减少了(图4b条)，与受损CD8相关⁺记忆T细胞反应(图4c（c）)和大大减少的CD127^高的/CD62L型^低的子集(图4e（电子）和（f）)在效应器后的早期阶段。再次感染期间李斯特菌属，CD40L–/–小鼠中反应性T细胞的增殖与WT小鼠中细胞群的增殖相等，表明该表型并非由于记忆性T细胞增殖能力的一般缺陷所致(图4d日)而是减少记忆T细胞的数量，使其能够对抗原重新计数立即作出反应。该表型由体内-在整个膨胀阶段加入BrdUrd的标记实验(图4d日)和依据体内监测增殖标记丢失的BrdUrd脉冲追踪研究（数据未显示）。

启动后早期具有效应器记忆表型的T细胞子集的减少生成被传输到晚期记忆T细胞池。我们的数据显示，在没有CD4的情况下⁺T细胞或CD40L，CD127^高的/CD62L型^低的启动后早期T细胞亚群显著减少。此外，我们(图4b条)和其他(三–5)证明在T细胞启动期间受损的T细胞帮助导致保护性免疫的质量发生变化Lm（磅）或淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒。为了更清楚地将早期CD127中观察到的缺陷联系起来^高的/CD62L型^低的在这些小鼠中，T细胞具有后续T细胞记忆的质量，我们分析了记忆期（原代后5周）抗原特异性T细胞群李斯特菌属感染）。此时，必须对来自不同组织的细胞进行抗原特异性T细胞分析，因为它们具有不同的迁移行为。除脾脏外，我们选择LN作为淋巴器官的代表组织，而肺作为典型的外周非淋巴小室。此时，这些器官中的抗原特异性T细胞几乎都是CD127^高的(图1b条); 肺中的细胞是CD62L^低的（数据未显示），而LN中大多数抗原特异性记忆T细胞是CD62L^高的(图5b条). 为了确定不同器官中具有明确即时效应功能的抗原特异性记忆T细胞的数量，我们对IFN-γ进行了细胞内细胞因子染色。如所示图5一与WT小鼠相比，CD40L–/–小鼠的特征是具有即时效应功能的抗原特异性记忆T细胞数量显著减少。这一结果在CD8内的频率水平（百分比）上是正确的⁺T细胞室和绝对数(图5一). 然而，LN衍生淋巴细胞的MHC四聚体染色(图5b条)发现与CD62L抗原特异性T细胞数量几乎相同^高的表型。一些CD62L^低的在WT小鼠的LNs中也可检测到抗原特异性T细胞，与产生IFN-γ的细胞的频率相关(图5一). CD40L–/–小鼠的LNs中基本上没有该群体；整个CD8⁺/CD62L型^低的CD40L–/–小鼠的亚群减少，表明该T细胞亚群的生成存在普遍缺陷。总之，我们的数据显示CD40L依赖性CD4的缺失⁺启动期T细胞的帮助导致抗原特异性CD8的数量差异⁺T细胞亚群，表现出效应记忆表型的细胞数量大大减少（CD127^高的/CD62L型^低的). 具有即时早期效应器功能的细胞中的这些数量差异被传递到记忆阶段，并影响保护性免疫的质量。

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图5。

T细胞启动后早期T细胞亚群中CD40L依赖性变化被传递到随后的记忆T细胞池。(一)在初次感染后35天，从WT BALB/c小鼠或CD40L–/–的肺部、脾脏和LN中分离出淋巴细胞Lm（磅）（0.1×LD₅₀). 短时间后进行细胞内IFN-γ染色在体外存在LLO时的再刺激_91–99识别具有即时效应功能的T细胞的肽。点图显示不同器官的代表性结果（如图所示）；数字表明产生IFN-γ的细胞的总频率。第一行条形图总结了IFN-γ产生、LLO频率的数据_91–99-CD8内的特异性T细胞⁺隔间；右边的一行条形图总结了产生IFN-γ的LLO绝对数的数据_91–99-不同器官中的特异性T细胞[CD40L–/–（填充）和WT BALB/c（开放）；n个=每组3人]。(b条)在初次感染后35天取LN细胞，如一; LLO公司_91–99-通过MHC多聚体染色检测特异性T细胞（斑点图，年轴）以及CD8和CD62L的涂层（点图，x个轴）曲面表达式。显示了CD8上选通的单元格的代表性点图⁺T细胞；显示了每个象限内的频率。左边的条形图总结了CD8中MHCS多聚体和CD62L阳性T细胞的频率数据⁺隔间；右边的一行条形图总结了LLO绝对数的数据_91–99/氢-K^d日LN中的多聚体阳性T细胞（CD40L–/–（填充）和WT BALB/c（开放）；n个=每组3人）。

讨论

这些研究揭示了体内记忆T细胞发育。我们将IL-7R/CD127的表达确定为记忆性T细胞标记物，支持最近的数据表明IL-7是一种重要的体内记忆性T细胞的维持因子(9). 最引人注目的是，CD127表达的检测首次在免疫反应早期区分效应性和记忆性T细胞，从而分析早期记忆性T淋巴细胞的生成体内使用此新工具，我们分析了CD8的缺陷⁺记忆T细胞生成在缺乏T细胞的情况下有助于更详细的研究。我们表明，这种缺陷不是由于记忆性T细胞普遍缺乏所致；T细胞帮助的缺乏特别影响具有即时早期效应器功能的记忆T细胞亚型的产生。这些新发现还解释了从MHC II–/–和CD4–/–小鼠获得的一些令人费解的数据，这些小鼠已知能够产生并维持对细胞内病原体的长期保护性免疫，尽管与WT小鼠相比，保护性质量较差(1,27,28). 类似的情况也可能发生在用热杀细菌免疫后，这一方案导致产生记忆性T细胞，但未能诱导立即的保护性免疫(16).

几项关于人类记忆T细胞亚群的研究表明，效应器和记忆T细胞发育的渐进模型(29)其中具有“中央记忆样”表型的记忆性T细胞可以分化为具有即时效应功能的记忆性T细胞。每个分化/过渡步骤所需的确切条件和协同刺激因子尚不清楚。如本研究所示，CD40和CD40L的相互作用似乎对体内效应记忆T细胞的生成。T细胞是否有助于CD8⁺启动期早期的记忆性T细胞分化主要通过CD40L介导的与APC的串扰或通过活化CD8上的CD40表达实现⁺T细胞(7)仍需确定。此外，一些实验性感染模型表明记忆性T细胞亚群对抗原反应性的要求也可能取决于细胞的位置，这表明脾和粘膜间室之间存在CD40依赖性差异(30). 由于CD127表达在接触抗原时下调，因此根据MHC II–/–和CD40L–/–小鼠中CD127的表达观察到的不同亚群分离也可能是由于抗原流行率的差异。虽然这种解释符合抗原驱动记忆T细胞向效应T细胞进化的模型，但我们和其他人(27)在MHC II–/–和CD40L–/–小鼠中，在初次接种后，无法观察到细菌负荷和细菌清除率的实质性差异李斯特菌属感染，表明T细胞的更多直接机制有助于导致这种表型。记忆性T细胞的渐进分化模型最近受到小鼠过继移植实验的质疑(15)其中记忆性T细胞亚群仅根据CD62L表达谱定义。我们的数据显示CD62L^低的抗原特异性T细胞群体是非常异质的，这表明从这些过继转移实验中获得的结果必须谨慎解释。虽然我们的数据支持记忆T细胞分化的线性模型，但它可能需要复杂的遗传体内揭示这些亚群确切发育动态的方法。

最近的研究也表明记忆性T细胞的产生可能是一个动态过程，其中一些后效T细胞随着时间的推移“成熟”为记忆表型(31). 这些数据是通过使用微阵列技术测定从脾脏纯化的整个抗原特异性T细胞群的基因表达动力学而产生的。我们的数据表明T细胞亚群的早期表型和功能分离。由于这些细胞亚群具有不同的迁移模式和维持要求，因此所描述的动态变化也可以解释为在某些时间点不同亚群相对流行率的差异，特别是在观察脾脏时(图1). 有趣的是，最初提出记忆生成“动态”模型的小组最近公布了记忆T细胞亚群早期分离的数据(32)，与我们的研究结果非常相似。他们还使用CD127作为记忆T细胞的标记物；然而，他们所有的结论都完全基于收养转移研究，必须谨慎解读。因此，我们决定更清楚地证明CD127确实是一种标记物，它能够区分长寿记忆T细胞和效应T细胞。这是通过对CD127阳性人群中记忆性T细胞亚群的进一步表型分析实现的，并且明确证明，CD127正性细胞室中的所有亚群在T细胞记忆缺陷小鼠中都受到影响。

我们的研究最重要的结果可能是观察到，在启动期后的早期可以监测到不同T细胞亚群的分离。这一结果与研究结果一致，研究表明，在效应器阶段，抗原再激发可以诱导一种特征性记忆反应，表明在这个早期点，已经存在具有记忆T细胞所有特征的T细胞(33). 通过识别新的表型标记来区分效应和记忆性T细胞亚群，我们可以直接可视化记忆性T淋巴细胞亚群的早期发育、分化和分离。这一发现具有特殊的临床意义，因为它可能使人们能够在免疫反应早期（例如接种病原体疫苗后）获得有关长期保护性免疫质量的信息。此外，免疫后早期监测T细胞亚群发育的能力可能会改善疫苗的开发。某些免疫策略可能有利于效应T细胞的产生，但这些细胞不能长期维持；其他方案可能产生具有即时早期效应功能的记忆性T细胞，或者可能由具有CD127的记忆性T细胞支配^高的/CD62L型^高的（“中央记忆”样）表型。在某些临床应用中，每种疫苗都比其他疫苗具有明显优势。更好地理解T细胞子集生成的要求体内将为设计更有效的疫苗提供理论依据。

致谢

笔记

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：Lm（磅）,单核细胞增多性李斯特菌; 淋巴结；T型_E类，效应T细胞；T型_厘米，中央记忆T细胞；MHC II，MHC II类；T型_{相对长度单位}效应记忆T细胞；APC，别藻蓝蛋白。

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