肿瘤相关突变型p53驱动Warburg效应

Mutp53促进GLUT1易位

葡萄糖通过细胞质膜（PM）的转运是葡萄糖代谢的第一个速率限制步骤，由葡萄糖转运蛋白（GLUTs）介导，包括GLUT1-4。GLUT4是胰岛素应答脂肪和肌肉组织中表达的主要葡萄糖转运蛋白。胰岛素显著刺激GLUT4向PM的移位，促进脂肪和肌肉中的葡萄糖摄取。GLUT1-3负责细胞和组织中的基础葡萄糖摄取²⁵其中，GLUT1在几乎所有类型的细胞和组织中广泛表达，并负责其基础葡萄糖摄取，而GLUT2和3负责某些特定组织的基础葡萄糖摄取²⁵虽然GLUT4信号的失调是2型糖尿病的重要原因，但GLUT1-3信号的失调，尤其是GLUT1，有助于肿瘤的发生。例如，GLUT1在肿瘤中经常过度表达，这有助于Warburg效应^26,27确实，在H1299和第53页−/−MEF细胞大大增强了细胞中的葡萄糖摄取、糖酵解速率和乳酸生成(补充图S1a–d). 众所周知，GLUT1从细胞内池向PM的易位增加可促进葡萄糖转运^25,28有趣的是，mutp53促进了细胞中GLUT1向PM的易位。mutp53的异位表达大大增加了PM上的GLUT1水平，但没有改变H1299细胞中GLUT1的总水平，这是使用分离PM组分进行Western-blot分析所测得的(图3a). 为了证实这一结果，用表达GLUT1的pLPCX-Myc-GLUT1载体转导细胞，在其第一个外周环中使用Myc标记，并通过抗Myc抗体的免疫荧光（IF）染色和流式细胞术分析测量细胞表面或整个细胞中的Myc-GLUT1水平。Mutp53明显增加PM上Myc-GLUT1蛋白的水平，但不影响H1299细胞中的总Myc-GLOT1水平(图3b). pLPCX-Myc-GLUT1载体转导细胞的IF染色也观察到类似结果；H1299中mutp53的表达明显促进了Myc-GLUT1蛋白从细胞质向细胞表面的移位(图3c). 此外，敲除SK-BR3和MDA-MB468细胞中的内源性mutp53明显降低了PM中内源性GLUT1的水平，而不是Western-blot分析中细胞中GLUT1总水平(图3d)流式细胞术中IF分析显示，降低PM上外源性Myc-GLUT1的水平，但不降低细胞中Myc-GLOT1的总水平(图3e). IF染色显示，两种细胞系中mutp53的敲除明显减少了Myc-GLUT1在细胞表面的分布，并增加了其在细胞质中的分布(图3f).

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图3

Mutp53刺激GLUT1转位到质膜在体外和中活泼地

（a）Western-blot分析检测到H1299细胞中R175H、R248Q和R273H mutp53的异位表达促进了GLUT1向质膜（PM）的移位。PM蛋白Na⁺/K（K）⁺ATP酶起到负荷控制作用，Calnexin起到PM分数的负控制作用。总计：全细胞裂解物。（b）在流式细胞术分析的H1299细胞中，Mutp53促进Myc-GLUT1易位到PM。左、中面板：细胞表面（左）和整个细胞（中）的Myc-GLUT1荧光染色图像。右侧面板：与细胞内总Myc-GLUT1水平归一化后细胞表面的相对Myc-GLUT1水平。在检测前48小时，用pLPCX-Myc-GLUT1载体或pLPCX载体（作为阴性对照）转导细胞。（c）H1299对照细胞和异位表达R175H、R248Q或R273H mutp53的细胞中Myc-GLUT1的IF染色。比例尺，10µm。（d，e）通过shRNA敲除SK-BR3和MD-MBA468细胞中的内源性mutp53可减少内源性GLUT1的易位（如Western-blot分析（d）所测），并通过流式细胞术（e）测量Myc-GLUT1向PM的易位。（f）用mutp53敲除和对照细胞对SK-BR3和MD-MBA468细胞中的Myc-GLUT1进行IF染色。比例尺，10µm。在d–f中，使用了两种针对p53的shRNA载体，并观察到类似的结果。（克，小时）R172H mutp53促进内源性GLUT1向PM的易位，Western-blot分析（g）和流式细胞术（h）分析Myc-GLUT1至PM第53页^R172H/R172HMEF细胞。（i）肝组织PM内源性GLUT1水平升高第53页^R172H/R172H小鼠与第53页通过Western-blot分析检测到−/−小鼠。对6只/组小鼠进行分析，其中3只/组。（j）Mutp53不促进内源性GLUT2或GLUT3在H1299或MEF细胞中的移位或表达。（k）流式细胞术分析表明，Mutp53不促进H1299和MEF细胞中Myc-GLUT2或Myc-GLUT3的PM易位。在检测前48小时用pLPCX-Myc-GLUT2或GLUT3载体转导细胞。数据以平均值±标准差（n=4）表示。*：第页<0.005; #:第页<0.01; 双尾学生t吨-测试。

在中观察到一致的结果第53页^R172H/R172HMEF细胞；R172H mutp53明显促进MEF细胞内源性GLUT1和Myc-GLUT1的GLUT1移位(图3g和h). 在中观察到类似的结果第53页^R172H/R172H老鼠；与…相比第53页−/−小鼠，mutp53明显增加了PM上的GLUT1水平，但没有增加来自第53页^R172H/R172H小鼠，包括肝脏(图3i)肺和小肠组织(补充图S2).

有趣的是，mutp53并不影响GLUT2或GLUT3的易位，GLUT2和GLUT3是另外两种葡萄糖转运蛋白，调节特定类型组织和细胞的基础葡萄糖摄取。H1299细胞中R175H、R248Q或R273H mutp53的表达第53页^R172H/R172H与对照H1299细胞相比，MEF不会影响PM或整个细胞中内源性GLUT2/3或Myc-GLUT2/3的水平第53页分别为−/−MEF单元(图3j&k). GLUT4的表达及其向PM的易位也在H1299和第53页^R172H/R172HMEF细胞。GLUT4的水平太低，无法在这两种细胞系中检测到(图3j)表明GLUT4并不是mutp53在刺激这些细胞中Warburg效应中发挥作用的主要因素。

为了测试增强的GLUT1易位是否介导突变p53对Warburg效应的刺激作用，细胞中的内源性GLUT1被shRNA敲低。GLUT1过度表达促进了Warburg效应(补充图S1)，GLUT1敲除明显降低H1299和MEF细胞的葡萄糖摄取、糖酵解速率和乳酸生成(图4a&b). 值得注意的是，GLUT1基因敲除在很大程度上消除了mutp53对H1299细胞和第53页^R172H/R172HMEF细胞(图4a和b). 在SK-BR3和MDA-MB468细胞中，GLUT1敲除明显降低了Warburg效应，类似于mutp53敲除的效应(图4c). 然而，在这两种细胞系中同时敲除mutp53和GLUT1并没有对Warburg效应产生加性抑制作用(图4c)进一步表明GLUT1介导mutp53对细胞中Warburg效应的刺激作用。

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图4

GLUT1介导mutp53对细胞Warburg效应的刺激作用

（a）shRNA载体敲除GLUT1在很大程度上消除了R175H、R248Q和R273H mutp53对H1299细胞中Warburg效应的刺激作用。Con-shR：控制shRNA；GLUT1-shR：GLUT1 shRNA。（b）siRNA敲低GLUT1基因可消除R172H mutp53对p53中Warburg效应的刺激作用^R172H/R172HMEF公司。（c）shRNA敲除GLUT1后，R175H和R273H mutp53分别对SK-BR3和MDA-MB468细胞的Warburg效应产生刺激作用。（d）shRNA敲低GLUT3并没有明显影响mutp53对H1299细胞中Warburg效应的刺激作用。H1299细胞中只有GLUT3被敲除，因为在H1299中检测不到GLUT2表达（图4j）。（e）siRNA对GLUT2或GLUT3的敲除并没有明显影响R172H突变p53对小鼠Warburg效应的刺激作用第53页^R172H/R172HMEF公司。a-e中的左侧面板：通过Western-blot分析分析的细胞中GLUT1、GLUT2或GLUT3的敲除。分别针对GLUT1、2和3使用两种不同的shRNA载体或siRNA寡核苷酸，并观察到类似的结果。数据表示为平均值±SD（n=3）。#：第页<0.01; *:第页<0.005; 双尾学生t吨-测试。

与GLUT1基因敲除对Warburg效应的影响类似，H1299和MEF中shRNA载体敲除内源性GLUT3后，葡萄糖摄取、糖酵解率和乳酸生成大大降低，与GLUT基因敲除产生的水平相似(图4d和e). 然而，GLUT3基因敲除并未明显影响mutp53对Warburg效应的促进作用，这在GLUT3敲除导致糖酵解率较低的两种细胞系中仍能清楚地观察到(图4d和e). 同样，击倒GLUT2明显降低了年的Warburg效应第53页^R172H/R172HMEF，但没有明显影响mutp53对Warburg效应的促进作用(图4e). 这些结果强烈表明，mutp53对Warburg效应的促进作用是由GLUT1介导的。综上所述，这些结果表明mutp53可以特异性促进GLUT1向PM的易位，这是mutp5刺激肿瘤细胞Warburg效应的重要机制。

Mutp53通过RhoA激活刺激Warburg效应

据报道，小GTPase蛋白，如Rab和Rho家族，参与调节胰岛素刺激的GLUT4向PM的移位以及胰岛素刺激的脂肪和肌肉（两种胰岛素反应组织）的葡萄糖摄取^25,29.RhoA是一种属于Rho家族的小GTPase。RhoA在肿瘤中经常过度表达或激活，并通过促进肿瘤细胞的增殖和转移而促进肿瘤的发生^30,31.RhoA还参与刺激GLUT4向PM的移位，以响应脂肪和肌肉细胞中胰岛素的刺激^32,33有趣的是，最近有报道称，mutp53通过上调RhoA阳性调节物（包括RhoGDI和Rho GEF-H1）的表达来激活RhoA^34–37这些发现提出了一种可能性，即mutp53可能通过激活肿瘤细胞中的RhoA促进GLUT1易位并刺激Warburg效应。然而，GLUT1和GLUT4在细胞中的易位调控差异很大，这是高度细胞类型特异性的^25,32例如，胰岛素显著刺激GLUT4易位，而GLUT1易位不受胰岛素显著调节^25,32目前，尚不清楚RhoA是否可以调节GLUT1易位从而影响基础葡萄糖摄取，以及RhoA激活是否可以促进癌细胞中的Warburg效应。

我们首先测试了mutp53是否激活我们用于本研究的细胞中的RhoA。细胞中非活性GDP结合态和活性GTP结合态之间的RhoA循环^31,38。如所示图5a，mutp53的表达显著增加了H1299和p53中RhoA-GTP的水平，但不增加总RhoA的水平^R172H/R172HMEF细胞，而且内源性mutp53的敲除大大降低了MDA-MB468和SK-BR3细胞中RhoA-GTP的水平，但没有降低总RhoA的水平。我们进一步研究了RhoA激活是否促进GLUT1易位和Warburg效应，以及RhoA活化是否介导mutp53的GOF刺激癌细胞中的Warburge效应。RhoA在H1299和H1299中的异位表达第53页−/−MEF细胞极大地促进了GLUT1的易位(图5b)对首相来说，更进一步，极大地刺激了华伯格效应(图5c). 一贯地，shRNA载体或siRNA寡核苷酸敲低RhoA明显减少了内源性GLUT1的易位(图5d)和Myc-GLUT1至PM(图5e–g)并降低了Warburg效应(图5h–j)H1299、MDA-MB468和第53页^R172H/R172HMEF细胞。重要的是，RhoA敲除在很大程度上消除了mutp53对GLUT1易位到PM的促进作用(图5d–g)和Warburg效应(图5h–j)在这些细胞中。在SK-BR3细胞中也观察到类似的结果(补充图S3a–c). 有趣的是，与mutp53对GLUT2和3的影响一致，RhoA对GLUT2-3向PM的易位没有明显影响(补充图S4). 这些结果一起清楚地证明了RhoA在肿瘤发生中的新功能；RhoA激活促进GLUT1易位到PM，从而促进癌细胞中的Warburg效应，这是mutp53刺激癌细胞中Warburge效应的重要机制。

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图5

Mutp53通过激活RhoA刺激Warburg效应

（a）Mutp53增强了RhoA活性，表现为细胞中RhoA-GTP水平增加。上部面板：表示Western-blot分析的结果。下面板：单元格中相对RhoA-GTP/总RhoA水平。数据表示为平均值±SD（n=4）。（b）表达载体异位表达RhoA促进了H1299和H1299中Myc-GLUT1向PM的易位第53页−/−MEF电池。（c）RhoA的异位表达促进了H1299和第53页−/−MEF电池。（d）shRNA或siRNA对RhoA的敲除在很大程度上消除了mutp53对H1299、MEF和MDA-MB468细胞内源性GLUT1易位到PM的刺激作用。（e、f、g）RhoA敲除基本上消除了mutp53对H1299（e）、MDA-MB468（f）和MEF（g）细胞中Myc-GLUT1易位到PM的刺激作用。（h，i，j）RhoA敲除基本上消除了R273H mutp53对H1299（h）、MDA-MB468（i）和MEF细胞（j）中Warburg效应的刺激作用。在d-j中，使用了两种不同的针对RhoA的shRNA载体或siRNA寡聚体，并观察到类似的结果。数据表示为平均值±SD（n=4）。##：第页<0.05; #:第页<0.01; *:第页<0.005; 双尾学生t吨-测试。

ROCK介导mutp53的作用

据报道，RhoA可以调节许多蛋白质和不同的信号通路。其中，ROCK（Rho-associated protein kinase）是RhoA的直接下游效应激酶。ROCK有两种亚型，ROCK1和ROCK2（ROCK1/2）^30,38据报道，ROCK可以调节胰岛素刺激的GLUT4移位和脂肪和肌肉组织中的葡萄糖摄取^39–41然而，由于GLUT1和GLUT4在细胞中的易位调控差异很大，并且具有高度的细胞类型特异性^25,32目前尚不清楚ROCK激活是否能促进GLUT1易位和癌细胞中的Warburg效应。

我们研究了ROCK是否介导mutp53 GOF刺激Warburg效应。MYPT1（肌球蛋白磷酸酶靶亚基1）和MLC2（肌球酶轻链2）是ROCK的两个众所周知的下游靶点，它们分别可被ROCK在Thr696和Ser19处磷酸化^30,38首先，我们通过使用酶免疫分析法测量MYPT1的Thr696磷酸化水平，来检测mutp53是否增强细胞中ROCK1/2的活性。mutp53的表达增强了H1299和MEF细胞的ROCK1/2活性，而mutp53基因敲除则降低了SK-BR3和MDA-MB468细胞的ROCK1/2活性(图6a). 蛋白质印迹分析证实了这一结果，显示突变p53的表达明显增加了H1299细胞中Thr696处MYPT1和Ser19处MLC2的磷酸化(补充图S5a)而内源性mutp53的敲除明显降低了MDA-MB468细胞的磷酸化水平(补充图S5b). 当RhoA或ROCK1/2被shRNA载体或siRNA寡聚体敲除时，这种突变p53的作用基本上被消除了(补充图S5a–d)表明mutp53通过激活RhoA/ROCK信号调节MYPT1和MLC2的磷酸化。

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图6

Mutp53通过ROCK激活刺激Warburg效应在体外和体内

（a）酶免疫测定结果显示，Mutp53增强了H1299、MEF、SK-BR3和MD-MB468细胞中的ROCK活性。（b）ROCK抑制剂Y27632（10µM，6 h）在很大程度上消除了mutp53对H1299和MEF细胞中GLUT1易位到PM的刺激作用。PM：质膜；总量：全细胞提取物。（c、d）Y27632处理和siRNA敲低ROCK1/2在很大程度上消除了mutp53对H1299细胞中Myc-GLUT1易位到PM（c）和Warburg效应（d）的刺激作用。用pLPCX-Myc-GLUT1载体转染细胞后，在检测前24小时用siRNA寡核苷酸转染细胞，以同时敲低ROCK1/2。实时PCR检测证实ROCK1/2基因敲除(补充图S5d).（e、f）Y27632处理（10µM，6 h）和ROCK1/2敲除在很大程度上消除了mutp53对Myc-GLUT1易位（e）和Warburg效应（f）的刺激作用第53页^R172H/R172HMEF细胞。（g）不同组织中RhoA-GTP水平升高第53页^R172H/R172H小鼠与p53−/−小鼠进行比较。左侧面板：表示Western-blot分析的结果。右侧面板：相对RhoA-GTP/总RhoA水平。数据以平均值±SD表示（n=6只小鼠，重复两次）。（h）不同组织中ROCK活性增加第53页^R172H/R172H小鼠与第53页−/−小鼠。（i）Y27632基本上消除了R172H mutp53对小鼠不同组织中GLUT1易位到PM的刺激作用。在注射Y27632（i.p.；10µg/g体重）后3 h处死小鼠进行分析。（j）Y27632基本上消除了R172H mutp53对小鼠不同组织葡萄糖摄取的刺激作用。在葡萄糖摄取试验前3小时，向小鼠注射Y27632（i.p.）。（k）Y27632基本上消除了R172H mutp53对小鼠血清乳酸生成的刺激作用。在c–f中，分别使用了两种不同的siRNA寡核苷酸来对抗ROCK1和ROCK2，并观察到类似的结果。在g–k中，每组使用6只小鼠进行分析。数据表示为平均值±SD（n=4 in a–f，n=6 in h，j，k）。##：第页<0.05; #:第页<0.01; *:第页<0.005; 双尾学生t吨-测试。

我们进一步测试了ROCK激活是否促进肿瘤细胞中GLUT1易位和Warburg效应，以及ROCK活化是否介导mutp53在刺激GLUT1转位和Warburg效应中的作用。Y27632，一种广泛使用的ROCK1/2抑制剂^30,38,42，用于阻断细胞中的ROCK1/2活性。通过酶免疫分析和Western-blot分析测定，Y27632明显降低了ROCK活性，表现为Thr696处MYPT1和Ser19处MLC2的磷酸化降低(补充图S5e&f). 此外，Y27632在很大程度上消除了mutp53对细胞ROCK活性的促进作用(补充图S5e&f). 值得注意的是，Y27632大大减少了GLUT1向PM的易位(图6b和c)以及H1299细胞中的Warburg效应(图6d). 在中观察到一致的结果第53页^R172H/R172HMEF细胞(图6b、e和f). 重要的是，Y27632在很大程度上消除了mutp53对GLUT1向PM易位的促进作用(图6b、c和e)以及这些细胞中的Warburg效应(图6d和f). 在SK-BR3和MDA-MB468细胞中观察到一致的结果(补充图S6).

为了进一步证实ROCK在介导mutp53对GLUT1易位和Warburg效应的作用，内源性ROCK1/2被siRNA寡核苷酸敲除。与Y27632治疗的结果一致，ROCK1/2的敲除大大降低了GLUT1易位和细胞中的Warburg效应，并且在H1299中大大消除了mutp53对GLUT1转位的刺激作用和Warburge效应(图6c和d),第53页^R172H/R172HMEF公司(图6e和f)和MDA-MB468细胞(补充图S6c&e). 这些结果清楚地表明，作为RhoA的下游效应器，ROCK介导mutp53在刺激GLUT1易位和癌症细胞中的Warburg效应中的作用。

据报道，PI3K/AKT和ERK通路是癌症中经常激活的两条通路，可促进细胞葡萄糖摄取^43–45为了研究这两种途径是否有助于mutp53对Warburg效应的促进作用，我们首先通过测量Thr473处AKT的磷酸化水平和Thr202/Tyr204处ERK1/2的磷酸化水平来检测mutp53是否可以在我们用于本研究的这些细胞系中激活这两种途径，分别是。Mutp53略微增加了H1299细胞的AKT活性，这与之前的报告一致⁵但在MDM-MB468或MEF细胞中没有，这表明mutp53激活AKT是细胞类型和环境依赖性的(补充图S7a)⁴⁶在这些细胞系中，Mutp53对ERK信号没有明显影响(补充图S7b). 为了进一步测试阻断AKT和ERK信号通路是否影响mutp53在Warburg效应中的作用，用PI3K/AKT抑制剂Wortmann和LY294002处理有或无mutp52表达的H1299细胞^43,45，或ERK抑制剂，U0126和PD98059⁴⁴，并检测了它们对mutp53对葡萄糖摄取的影响。所有这些处理都大大降低了H1299细胞的葡萄糖摄取。然而，这些治疗并没有明显影响mutp53对葡萄糖摄取的促进作用(补充图S7c&d). 这些结果强烈表明，PI3K/AKT和ERK信号通路对mutp53对这些细胞中Warburg效应的促进作用没有显著贡献。

胰岛素/IGF-1（Insulin/ligF-1，Insulin-like growth factor-1）信号通路在调节胰岛素反应肌肉和脂肪组织中葡萄糖转运蛋白的移位和葡萄糖摄取中起着重要作用²⁵激活的IGF-1/IGF-1受体信号在癌症中也起着重要作用⁴⁷为了研究激活的胰岛素/IGF-1信号是否有助于mutp53对GLUT1易位的影响，分别用胰岛素和IGF-1处理H1299细胞，以激活胰岛素/IGF1信号。胰岛素和IGF-1均适度诱导了H1299细胞中GLUT1蛋白的表达（治疗后8小时增加了约2倍），并且轻微促进了GLUT1向PM的易位（治疗后10分钟、4小时和8小时增加约20–30%）(补充图S8). 然而，这些作用不是mutp53特异性的，因为在没有mutp53表达的H1299细胞中观察到类似的作用。此外，与mutp53的作用相比，胰岛素和IGF-1对GLUT1易位的影响要弱得多。这些结果表明，激活的胰岛素/IGF-1信号对mutp53对H1299细胞GLUT1易位的影响没有显著作用。

Mutp53通过RhoA/ROCK刺激Warburg效应体内

我们进一步研究了mutp53是否通过激活RhoA/ROCK信号刺激Warburg效应体内正如我们在培养细胞中观察到的那样。事实上，mutp53对RhoA和ROCK活性的刺激作用也在第53页^R172H/R172H老鼠。与p53−/−小鼠相比，RhoA-GTP水平更高(图6g)和ROCK活动(图6h;补充图S9)在p53的不同组织中观察到^R172H/R172H小鼠，包括肝脏、肺和小肠。用Y27632（i.p.注射）治疗小鼠明显减少了GLUT1向PM的易位(图6i)和葡萄糖摄取(图6j)不同组织和血清乳酸水平(图6k). 重要的是，Y27632在很大程度上消除了mutp53对ROCK激活的影响(补充图S9)，GLUT1易位(图6i)，葡萄糖摄取(图6j)，和血清乳酸水平(图6k). 这些结果清楚地表明，激活的RhoA/ROCK信号传导介导了mutp53对GLUT1易位的促进作用和Warburg效应体内.

Mutp53增强肌动蛋白聚合

Rho家族蛋白，包括RhoA，诱导肌动蛋白聚合，并在囊泡运输中发挥重要作用，这对葡萄糖转运蛋白的转运至关重要^29,48,49肌动蛋白聚合是将肌动蛋白单体组装成细丝（聚合肌动蛋白或F-Actin），在囊泡运输中起着关键作用^29,48,49据报道，ROCK通过调节肌动蛋白聚合来调节胰岛素刺激的GLU4移位和脂肪和肌肉中的葡萄糖摄取³⁹有趣的是，我们发现mutp53促进肌动蛋白聚合。mutp53的表达明显增加了H1299细胞中聚合肌动蛋白的水平，但不增加总肌动蛋白水平(图7a). 通过抑制RhoA/ROCK信号传导，包括RhoA敲除和Y27632处理，mutp53对肌动蛋白聚合的这种影响可以在很大程度上被消除(图7a). 细胞松弛素D和latrunculin B，两种广泛使用的肌动蛋白聚合抑制剂^50,51从而消除了mutp53对肌动蛋白聚合的促进作用(图7b)，也在很大程度上消除了mutp53对内源性GLUT1易位的刺激作用(图7c)和Myc-GLUT1(图7d)至H1299电池中的PM。最重要的是，细胞松弛素D和latrunculin B在很大程度上消除了mutp53对H1299细胞中Warburg效应的刺激作用(图7e). 这些结果在第53页^R172H/R172HMEF公司(图7f–h)和MDA-MB468细胞(图7i–k). 这些结果强烈表明，mutp53可以通过激活RhoA/ROCK信号来增强肌动蛋白聚合，这是导致GLUT1转位增强到PM和癌症细胞中Warburg效应的机制之一。

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图7

Mutp53促进肌动蛋白聚合，促进GLUT1转位到质膜

（a）Mutp53刺激肌动蛋白聚合，在表达R175H、R248Q或R273H Mutp53的H1299细胞中，RhoA shRNA和ROCK抑制剂Y27632（10µM，6小时）可以消除肌动蛋白的聚合。（b）肌动蛋白聚合抑制剂，细胞松弛素D（Cyto D）和latrunculin B（Lat B），消除了mutp53对H1299细胞肌动蛋白聚集的促进作用。（c、d）Cyto D和Lat B阻断了mutp53对H1299细胞内源性GLUT1（c）和Myc-GLUT（D）向质膜（PM）移位的刺激作用。总量：全细胞提取物。（e）细胞D和Lat B在H1299细胞中消除了mutp53对Warburg效应的刺激作用。（f）Mutp53促进肌动蛋白聚合第53页^R172H/R172HMEFs，可以被Cyto D废除。（克，小时）Cyto D和Lat B消除了mutp53对Myc-GLUT1易位到PM（g）的刺激作用和Warburg效应（h）第53页^R172H/R172HMEF公司。（i）敲除R273H mutp53可减少MDA-MB468细胞中肌动蛋白聚合，而细胞D可消除肌动蛋白的聚合。（j，k）Cyto D和Lat B在MDA-MB468细胞中消除了mutp53对Myc-GLUT1易位到PM（j）的刺激作用和Warburg效应（k）。在分析之前，用（+）或不用（−）Cyto D（20µM）或Lat B（10µM。对照组（Con）用二甲基亚砜治疗。数据表示为平均值±SD（n=3）。#：第页<0.05; *:第页<0.005; 双尾学生t检验。

体内葡萄糖摄取测定和血清乳酸测定

按照所述进行小鼠组织中葡萄糖摄取的检测^56,57简单地说，五周大的雄性p53+/+，p53−/−和第53页^R172H/R172HC57BL6/J小鼠⁸（Gigi Lozano医生慷慨的礼物）注射了^三注射后1.5小时收集H-2脱氧葡萄糖（1µci/g体重）和组织，以测量^三H-2-脱氧葡萄糖-6-磷酸在组织中积累。为了研究ROCK抑制剂Y27632对组织葡萄糖摄取的影响，小鼠在注射（i.p.）^三H-2-脱氧葡萄糖。根据制造商的说明（Biovision），使用乳酸检测试剂盒测定血清中的乳酸水平。所有小鼠实验均获得罗格斯大学动物护理和使用委员会的批准。

细胞葡萄糖摄取的测量

葡萄糖摄取量通过测量^三细胞H-2-脱氧葡萄糖^21,58简单地说，在12孔板中培养的细胞在无葡萄糖培养基中预先培养30分钟。^三然后将H-2脱氧葡萄糖（1µCi/孔）添加到细胞中并孵育30分钟，然后用PBS清洗细胞并在1%SDS中溶解。细胞裂解物的放射性在液体闪烁计数器中测定，并归一化为细胞裂解物中的蛋白质浓度。

细胞糖酵解速率的测量

糖酵解速率通过监测5-^三H-葡萄糖^三高-高₂O（运行）^19,21简单地说，电池（1×10⁶)在PBS中清洗，然后在37°C下在1 mL Krebs缓冲液中重新悬浮30 min，无葡萄糖。然后将细胞重新悬浮在含有10 mM葡萄糖和5µCi的0.5 mL Krebs缓冲液中-[^三H] 将100µL等分三磷酸盐转移到含有100µL0.2 N HCl的无盖PCR试管中，并将试管转移到含有0.5 mL H的闪烁瓶中₂O。将闪烁瓶密封并放置48小时，以允许发生扩散。扩散和未扩散的数量^三H在液体闪烁计数器中测定。

细胞内乳酸生成的测量

细胞在新鲜无酚红培养基中培养，并在收集培养基之前培养12–24小时。根据制造商的说明（Biovision），使用乳酸检测试剂盒测定乳酸水平，并根据细胞数进行标准化²¹.

Western blot分析

使用标准Western blot分析和以下抗体分析蛋白质表达。GLUT1（Abcam；1:4000）；GLUT2（Abcam；1:2000）；GLUT3（Abcam；1:2000）；GLUT4（圣克鲁斯；1:2000）；RhoA（Millipore；1:2000）；p53（圣克鲁斯；1:1000）；β-肌动蛋白（西格玛；1:20000）；纳⁺/K（K）⁺ATP酶（Novus；1:3000）；Calnexin（Abcam；1:5000）；标志（Sigma；1:10000）；Myc（罗氏；1:1000）；p-AKT（Ser473）（细胞信号；1:1000）；AKT（圣克鲁斯；1:4000）；p-ERK1/2（细胞信号；1:2000）；ERK1/2（细胞信号；1:2000）；p-MYPT1（Thr696）（EMD Millipore；1:2000）；MYPT1（细胞信号；1:2000）；p-MLC2（Ser19）（细胞信号；1:1000）；MLC2（细胞信号；1:2000）。

定量实时PCR分析

用RNeasy试剂盒（Qiagen）制备总RNA。使用TaqMan逆转录试剂盒制备cDNA，并根据标准协议使用TaqMan-PCR混合物（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行实时PCR²¹.人类Taqman引物岩石1（Hs01127699_m1），人类岩石2（Hs00178154_m1），人类肌动蛋白（Hs99999903_m1），鼠标岩石1（Mm00485745_m1），鼠标岩石2（Mm01270843_m1）和鼠标肌动蛋白（Mm01205647_g1）购自Applied Biosystems。的表达式岩石1和岩石2细胞中的肌动蛋白基因。

RhoA和ROCK活动分析

对于RhoA活性分析，使用Rho活性试剂盒（Millipore）进行GST-Rhotekin Rho结合域（RBD）下拉分析，以测量细胞中GTP-结合RhoA（RhoA-GTP）的水平⁵⁹Rho效应蛋白Rhotekin的RBD与RhoA-GTP特异性结合。沉淀的RhoA-GTP水平通过使用RhoA抗体的Western-blot分析进行测量，并归一化为细胞中的总RhoA水平。使用ROCK活性测定试剂盒（Millipore）通过酶免疫测定测定ROCK的活性。简言之，ROCK1和ROCK2（ROCK1/2）从细胞裂解物中免疫沉淀，并添加到96个预先涂有重组MYPT1的平板中，重组MYPT1含有可被ROCK1/2磷酸化的Thr696残基⁵⁹用磷酸化MYPT1-Thr696抗体（1:1000）和HRP-结合二级检测抗体（1:2000）检测Thr696上MYPT1磷酸化水平，这代表ROCK1/2活性。

PM内源性GLUTs水平分析

根据标准方案分离细胞的PM部分^60,61简单地说，PM部分与包括内质网（ER）在内的其他细胞膜部分分离。通过蛋白质印迹法测定PM组分中GLUT1、2和3的表达水平。A PM蛋白Na⁺/K（K）⁺ATP酶被检测为内标物。检测到Calnexin是一种内质网膜蛋白，以排除其他膜组分（包括内质网）对PM的污染。使用全细胞提取物测量细胞内的总GLUT1、2和3。

PM上Myc标记的GLUT水平的分析

分别使用pEGP-Myc-GLUT1和pcDNA3-Myc-GLUT2载体构建pLPCX-Myc-GLUT1和2载体，这两个载体分别在其第一个外周环中表达带有Myc标记的GLUT1与GLUT2（Jeffrey Pessin博士慷慨捐赠）。通过PCR扩增，构建了第一外周带Myc标记的表达GLUT3的pLPCX-Myc-GLUT3载体。流式细胞术中IF染色检测细胞表面和整个细胞中Myc-GLUT1、2和3的水平^62,63简言之，在用pLPCX-Myc-GLUT1、2或3载体转导细胞后48小时，用2%FBS在PBS中阻断细胞，并用Myc抗体（Roche）染色，以在流式细胞术中检测细胞表面的Myc-GLUT1、2或3。为了测定细胞内Myc-GLUT1、2或3的总水平，在染色前用2%多聚甲醛固定细胞并用0.2%Triton X-100渗透。将Myc-GLUT 1、2或3在细胞表面的相对水平与其在细胞中的总水平归一化后计算。用空pLPCX载体转导的细胞作为阴性对照。

免疫荧光染色

根据标准方案对细胞进行免疫荧光（IF）染色^21,22简而言之，用冰镇PBS清洗盖玻片上培养的细胞，并用甲醇固定。用含有0.2%Triton X-100的PBS渗透细胞。表达Myc-GLUT1的细胞与抗Myc抗体（9E10，Roche；1:100）孵育过夜，然后与Alexa Fluor®488-结合的山羊二级抗体（Invitrogen；1:200）培养1h。盖玻片安装在Vectashide（Vector Laboratories）中，并用共焦激光扫描显微镜进行检查。

肌动蛋白聚合分析

根据标准方案从细胞中分离出聚合肌动蛋白组分⁶⁴简单地说，细胞在400µl裂解和F-actin稳定缓冲液（50 mM PIPES，pH 6.9，50 mM NaCl，5 mM MgCl₂、5 mM EGTA、5%甘油、0.1%NP-40、0.1%Triton X-100、0.1%吐温-20、0.1%β-巯基乙醇、1 mM ATP、蛋白酶抑制剂鸡尾酒）在37°C下保持30分钟。离心（2000 rpm，5 min）后，将一半上清液转移并在100000×g（60 min，37℃）下离心，以形成聚合肌动蛋白颗粒。将含有聚合肌动蛋白的颗粒重新悬浮在含有10µM细胞松弛素D的200µl冰水中。然后将聚合肌动素样品稀释在4×SDS样品缓冲液中，用于Western blot分析。使用单克隆抗肌动蛋白抗体（Sigma）检测聚合肌动蛋白。从用于分离聚合肌动蛋白组分的相同数量细胞中提取的全细胞提取物用于Western-blot分析，以测量细胞中总肌动蛋白的水平。对于肌动蛋白聚合抑制剂的处理，在分析之前用细胞丙氨酸D（5–20µM）或latrunculin B（1–10µM。对照组接受二甲基亚砜治疗。

锚定非依赖性生长分析

在涂有含有0.6%琼脂糖的培养基的培养皿中进行锚定无关生长测定。细胞接种在含有0.3%琼脂糖的培养基上。2-3周后对菌落进行染色和计数。对于半乳糖治疗，细胞在含有半乳糖（25 mM）但不含葡萄糖的培养基中培养。

异种移植致瘤性分析

使用7周龄BALB/c nu/nu雄性裸鼠（Taconic）进行异种移植物致瘤性分析⁶⁵.电池（5×10⁶– 1×10⁷向裸鼠（n=10/组）注射（皮下注射）0.2 mL PBS。注射后，对小鼠进行检查，每周测量肿瘤体积3次，持续3-4周。肿瘤体积=½（长×宽²).

我们感谢Gigi Lozano博士慷慨证明第53页^R172H/R172HJeffrey Pessin博士慷慨证明了pEGP-Myc-GLUT1和pcDNA3-Myc-GLUT2载体。这项工作得到了NIH（R01CA143204）、NJCCR和UMDNJ基金会（给Z.F.）的资助，以及NIH（R1CA160558）、DOD Grant（W81XWH-10-1-0435）和Ellison Medical Foundation（给W.H.）的支持。C.Z.和J.L.获得了NJCCR博士后奖学金的支持。