星形胶质细胞衍生信号的声调依赖性血管反应

试剂。

血栓素A₂受体激动剂9,11-二脱氧-11α，9α-环氧甲基前列腺素F_2α（U-46619），前列腺素F_2α，花生四烯酸甲酯氟膦酸酯（MAFP），N个-羟基-N个′-（4-丁基-2-甲基苯基）-甲脒（HET-0016），N个-甲基磺酰基-6-（2-丙炔氧基苯基）-己酰胺（MS-PPOH）、sc-560和奥扎格雷（均购自密歇根州安阿伯市开曼化学公司）作为二甲基亚砜（DMSO）的库存制备，随后添加到aCSF中。实验溶液中DMSO含量≤0.1%。变速箱-1-氨基环戊烷-1,3-二羧酸（t-ACPD；Tocris，Ellisville，MO）在等摩尔NaOH中从50 mM原料中在aCSF中稀释。11,12-EET从Biomol（普利茅斯会议，PA）中获得，并从156μM等分乙醇中添加到所提供的aCSF中。内皮素-3（美国肽，加利福尼亚州森尼维尔）从dH的库存中添加到aCSF中₂O.将四乙基铵（TEA；西格玛，密苏里州圣路易斯）溶解在脑脊液中。

视频显微镜。

使用配备红外差分干涉对比（IR-DIC）光学系统、浸水物镜（蔡司63x，数字孔径0.9）和EMCCD相机（iXon+885；Andor Technology，南温莎，康涅狄格州）。图像以每秒1帧的速度采集、可视化并使用IQ软件（Andor Tech）存储。用95%O气体的脑脊液（35±2°C）对切片进行灌注₂-5%一氧化碳₂在开始记录之前，让其平衡≥10分钟。到达记录室的灌流液中测得的氧活度为54.8±2%（35°C；n个= 3; ISO2氧气系统；佛罗里达州萨拉索塔的世界精密仪器公司）。每个切片只记录一个小动脉。

用含U-46619的aCSF灌流切片以诱导血管收缩，在达到稳定的预狭窄后，在恒定存在的情况下使用试验溶液。在使用药物阻滞剂的实验中，在实验之前，大脑切片在这种阻滞剂中预孵育至少30分钟。在整个实验过程中，还灌注HET-0016、sc-560和奥扎格雷（100 nM）以及MS-PPOH（10μM）。

在对照条件下或在药物抑制剂中预孵育后，暴露于U-46619（50–250 nM）后未收缩的血管比例如下：对照=22.8%(n个= 127); MAFP=20.8%(n个= 24); HET-0016=9.1%(n个= 22); MS-PPOH=10.5%(n个=19）；sc-560=14.3%(n个= 21); 奥扎格雷=20%(n个= 20). 这些数据表明，U-46619诱导的收缩不受这些药物治疗的影响。对U-46619没有反应的容器被丢弃进行分析。

钙成像。

钙²⁺使用上述成像系统和显微镜物镜，使用共焦旋转装置（横河CSU 10）进行成像。在含有10μM fluo 4-AM（Invitrogen，Eugene，OR）和pluronic acid（2.5μg/ml）的CSF中，在室温下培养皮层切片（～1 h），CSF位于一个定制的充满95%氧气的小室中₂-5%一氧化碳₂使用二极管泵浦固体激光器（加利福尼亚州卡尔斯巴德市梅勒斯·格里特）在488 nm处激发Fluo 4，并在>495 nm处收集荧光发射。以3-6帧/秒的速度采集图像。

增加细胞外钾⁺诱导张力依赖性血管舒张。

适度标高（单位：[K）⁺]_o个导致钙超极化和减少²⁺进入VSMC并在脑循环中构成强大的血管扩张刺激(32,35,38). 最近的工作证明K⁺星形胶质细胞的信号传导是NVC的关键机制(21). 作为解决静息血管张力对皮质小动脉对星形胶质细胞衍生信号反应的影响的第一步，适度升高[K⁺]_o个进行了研究。为此，我们测量了使用U-46619（50–250 nM）预狭窄到不同程度并暴露于10 mM K的微动脉的直径变化⁺，保持原有U-46619浓度不变。提升[K⁺]_o个具有净血管扩张作用。血管舒张的幅度与预狭窄的初始水平呈正相关：随着血管张力的增加，相应地会诱发更大的血管舒张反应(第页= 0.65). 观察到的变化的代表性轨迹如所示图2A类.英寸图2B类响应10mM K的直径变化⁺表示为小动脉初始（预限制）直径的函数(n个= 19). 暴露于10 mM K后，血管舒张开始出现0.9±0.1分钟⁺平均峰值扩张时间为4.5±0.5 min。检测升高[K的声调依赖性效应是有益的⁺]_o个当直径在低（控制）和高[K时⁺]_o个按初始预狭窄水平排列的单个小动脉的初始基线百分比绘制(图2C类). 低预狭窄水平（>60%基线；n个=9），K⁺-诱导扩张几乎将直径恢复到初始基线扩张状态，而对于更多预狭窄的小动脉，相对于基线，最终稳态直径更低，变化更大。

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图2。

细胞外钾升高⁺浓度（[K⁺])引起音调依赖性血管舒张。A类：暴露于升高的细胞外[K⁺]（[K⁺]_o个)（10mM）。B类：在暴露于10 mM[K⁺]_o个.C类：数据来自B类表示为接触10 mM[K前后的直径百分比（相对于基线）⁺]_o个每个小动脉。

mGluR激活引起皮质小动脉的张力依赖性收缩和扩张。

除K外⁺当星形胶质细胞[Ca增加时，可以产生和释放一些收缩和扩张信号²⁺]_我突触释放的谷氨酸激活mGluR后(19). 然而，目前尚不清楚这些血管活性物质的相反作用是如何整合到确定的血管反应中的。我们假设，脑小动脉对神经元和/或胶质细胞衍生信号的反应取决于所释放信号的性质和血管张力的程度。为了评估这一假设，我们将大脑皮层切片暴露于t-ACPD中，t-ACPD是一种选择性mGluR激动剂，已知可以诱导Ca²⁺星形胶质细胞增多(34,60)，并测量显示不同程度预狭窄的小动脉的直径变化。如所示图3A类暴露于t-ACPD（100μM；～10分钟持续时间）持续诱发小动脉收缩，小动脉有低至中度的预狭窄（高达基线的～70%），而血管扩张最初表现出更明显的张力(n个= 27; 参见补充视频2A和2B）。收缩开始时间为1.9±0.6 min，收缩峰值为3.9±0.7 min(n个= 11). t-ACPD应用后2.4±0.5分钟开始扩张反应，5.5±0.6分钟达到稳定(n个= 16). 收缩与扩张的发作时间和峰值时间的比较没有显示出显著差异。为了进一步分析这些响应图3A类重新填图以显示t-ACPD诱导的直径（表示为最大基线直径的百分比）作为初始直径的函数(图3B类). 有趣的是，该图显示，在t-ACPD暴露后，19条最初显示低（小于～30%）或高（大于～50%）预狭窄的血管中，有16条达到了均匀的直径（～36.9±2%收缩），这在血管反应反转极性的音调范围内。另外两个观察结果表明，这种音调范围（约为基线直径的50–70%）可能代表了一个确定血管反应极性和程度的设定点。首先，以绝对值（即接近基线直径的值）计算，在初始直径和静止直径位于该假定设定值范围内的小动脉中观察到最大的血管扩张(图3B类). 其次，在t-ACPD刺激下，一些初始直径远离设定值的血管瞬间到达设定值，然后出现扩张(图3,B类和C类).

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图3。

神经胶质的激活导致脑实质小动脉的张力依赖性收缩和扩张。A类：代谢型谷氨酸受体（mGluR）激动剂引起的血管直径变化图反式-1-氨基环戊烷-1,3-二羧酸（t-ACPD）（100μM）作为初始直径的函数（相对于基线）(n个= 27).B类：数据来自A类以显示t-ACPD暴露后的小动脉直径（•）作为其初始直径的函数。双相反应（○）表示最初因t-ACPD而收缩的血管中的二次扩张（用连接符号的虚线表示）。C类：描绘三个小动脉的直径变化的轨迹，如图1所示B类.D类：t-ACPD（100μM）对PGF预封闭的小动脉引起的反应的汇总数据_2α（5-35μM）。结果表示平均值±SE。

因为观察到的反应可能受到预狭窄治疗的限制，即血栓素A的特定作用₂受体激动剂U-46619对血管张力的影响，我们测试了mGluR激活对不同激动剂预狭窄的小动脉的影响，即PGF_2α。如所示图3D类暴露于t-ACPD（100μM；～10分钟持续时间）时，在PGF预狭窄的小动脉中也观察到张力依赖性收缩和扩张_2α（5-35μM）。在总共记录的9条小动脉中，有4条小动脉的初始直径≤基线的70%（即预狭窄≥30%）对t-ACPD有舒张作用。其余五条小动脉的静止直径大于基线的70%，显示为收缩。与U-46619一样，在后一组的五分之三的血管中也观察到双相反应（收缩后扩张）。由于在使用不同激动剂进行预狭窄时观察到类似的反应，这些结果表明，大脑皮层小动脉对mGluR激活的收缩和扩张强烈依赖于其静息张力。

AA代谢物在血管对mGluR激活的反应中起着不同的作用。

在星形胶质细胞中mGluR激活后，产生的[Ca²⁺]_我升高可以触发AA的产生，AA可以进一步代谢为几种血管收缩剂和血管舒张剂信号(33). 为了评估AA代谢物在mGluR激活诱导的血管收缩和舒张中的参与，以及血管张力对这些反应的影响，我们在AA生成或代谢的选择性阻断剂存在的情况下进行了与前一节所述类似的实验。在30分钟内灌注MAFP（100μM）、HET-0016（100 nM）、MS-PPOH（20μM）或sc-560（100nM）的对照实验中，基线直径（在对照aCSF的前10分钟内测量）未受到这些抑制剂的显著影响（变化范围=−2.6至3.5%；P（P）=0.106，ANOVA，然后进行Dunnett检验；n个=每个治疗4次）。在这些实验结束时，在试验药物的持续存在下，通过应用内皮素-3（100nM）来评估血管反应性。内皮素-3在所有血管和所有测试条件下均诱导显著的血管收缩（>50%），表明血管反应性得以保留（数据未显示）。

结果与来自图3A类，并将反应分为三类，包括初始小动脉张力的离散范围：1)<基线的70%，在这一范围内，小动脉可能扩张超过静止水平；2)基线的70–50%，这一范围对应于受压的脑实质内血管形成的活跃色调，可能类似于普遍的生理肌源性色调(9,12)、和三)>50%的基线，这一范围可能表示收缩超过生理水平。首先，我们测试了磷脂酶A的选择性和不可逆抑制作用₂（解放军₂)，催化钙的酶²⁺-膜磷脂依赖性AA生成。在用MAFP（100μM）预孵育的血管中，对U-46619的敏感性明显降低。在这些实验中，大多数情况下必须使用最高剂量的U-46619（250 nM），以实现明确的预狭窄。

用MAFP（100μM）预孵育脑片可显著抑制t-ACPD诱导的收缩和扩张(n个=19）(图4). 这些结果与之前的观察结果一致，在之前的观察中，功能性PLA的缺失₂显著抑制体内星形胶质细胞诱导的血管舒张(56)，和体外血管收缩(42)，并有力支持AA或其某些代谢物是mGluR激活引起的血管反应的关键决定因素的观点。

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图4。

花生四烯酸代谢物在mGluR激活诱导的收缩和扩张中有不同程度的参与。显示t-ACPD（100μM）在脑片与AA通路的药物阻断剂孵育后诱导的皮质小动脉直径变化的总结数据。血管反应根据预狭窄的初始程度进行分组。结果表示平均值±SE*P（P）<0.05和**P（P）< 0.01. 邓内特的测试。

以前的报告表明，细胞色素的抑制作用P（P）-450（CYP）ω-羟化酶是一种调节AA-衍生代谢物20-HETE生成的酶，它强烈减弱了啮齿动物大脑皮层胶质细胞激活后的血管收缩(42)和视网膜(39). 为了评估20-HETE在mGluR激活引起的血管反应中的作用，用选择性CYPω-羟化酶抑制剂HET-0016（100 nM）预孵育脑片(40). HET-0016治疗后，所有收缩均逆转为扩张(n个= 9;P（P）<0.01），而静息张力较高的血管的扩张没有显著影响(图4). 因此，这些数据支持20-HETE作为mGluR激活后的主要血管收缩信号。

近十年前，人们提出星形胶质细胞衍生EET在功能性充血中的作用(26). 星形胶质细胞在体外和原位表达CYP环氧酶亚型(2,48)，其活性受谷氨酸刺激(1). 在实验上，抑制CYP环氧酶可减少体内大脑的充血反应(1,5,47,48)并废除脑片中AMPA受体激活诱导的晚期持续性血管舒张(36). 为了评估EET在t-ACPD诱导的血管反应中的作用，将脑切片与MS-PPOH（20μM）预孵育，MS-PPOH是一种选择性CYP环氧合酶底物抑制剂(57). 如所示图4MS-PPOH治疗显著减轻了血管扩张，且预狭窄明显（>50%）(n个= 6;P（P）<0.01），但不影响最初显示中等音调的血管的血管反应。此外，在最初显示最低预狭窄水平的血管组中，狭窄也显著减少(n个= 6;P（P）<0.05），表明EET以强烈依赖于特定小动脉张力的方式促进收缩和舒张反应。

体内研究强调了环氧合酶（COX）代谢产物在维持静息脑血流和作为神经血管反应介质中的重要作用(44,45,56)和体外试验(21,60)研究。因为COX-1的衰减，而不是COX-2的衰减，有效地降低了体内扩张器的反应(56)，我们评估了COX-1活性是否会影响微动脉对mGluR激活的反应。用sc-560（100 nM）预孵育切片可选择性抑制COX-1。如所示图4，COX-1抑制显著降低t-ACPD诱导的收缩和扩张。然而，在中度预狭窄水平（基线水平的70-50%）的血管组中观察到最显著的效果，其中血管扩张逆转为血管收缩(n个= 4;P（P）< 0.01).

为了评估在COX-1阻断期间观察到的血管收缩减弱是否代表血栓素合成减少，将t-ACPD应用于使用血栓素合酶抑制剂奥扎格雷（100 nM）治疗的血管(30). 如所示图4，低预狭窄血管的血管收缩程度显著降低(n个= 9;P（P）< 0.05).