国际生理病理生理药理学杂志。2014; 6(1): 37–46.
2014年3月13日在线发布。
NOS1AP调节细胞内钙2+在心肌细胞中表达，在营养不良型心肌病中表达上调
1和2
阿德里亚娜·特洛伊尔
1智利塔尔卡塔尔卡大学自然回归研究所，Ciencias Mencion Investigacion y Desarrollo de Productos Bioactios博士项目
丹尼尔·冈萨雷斯
2智利塔尔卡塔尔卡大学萨卢德学院生物医学系
1智利塔尔卡塔尔卡大学自然回归研究所，Ciencias Mencion Investigacion y Desarrollo de Productos Bioactios博士项目
2智利塔尔卡塔尔卡大学萨卢德学院生物医学系
通信地址：丹尼尔·冈萨雷斯（Daniel R Gonzalez）博士，智利塔尔卡利卡大道塔尔卡大学萨卢德学院生物科学系。电话：+56-71-2-418856；电子邮件：lc.aclatu@zelaznogad 2013年11月18日收到；2014年1月15日接受。
摘要
NOS1AP基因（一氧化氮合酶1适配器蛋白）与心电图QT间期异常和心源性猝死密切相关。为了确定NOS1AP在心肌细胞生理学中的作用，我们使用siRNA评估了沉默NOS1AP对[Ca2+]我新生儿心肌细胞的瞬变。此外，我们检测了NOS1AP与心脏离子通道的共定位，最后评估了NOS1A1在营养不良性心肌病小鼠模型中的表达。使用siRNA，NOS1AP水平降低至对照水平的约30%（p<0.05）。心肌细胞中NOS1AP沉默显著降低了电诱发钙瞬变的振幅（p<0.05）和细胞的S-亚硝基化程度（p<0.05）。利用共焦显微镜，我们通过共定位分析评估了NOS1AP的亚细胞定位以及与其他蛋白质的相互作用。NOS1AP与L型钙离子通道和内向整流钾离子通道Kir3.1共定位程度高，与ryanodine受体（RyR2）和α-肉瘤肌动蛋白共定位程度低，与连接蛋白43无共定位，表明与调节动作电位持续时间的离子通道的功能相关的相互作用。最后，使用免疫荧光和Western blotting，我们观察到在患有营养不良性心肌病的小鼠中，NOS1AP显著上调（p<0.05）。这些结果表明，NOS1AP可能通过S-亚硝基化作用于L-型钙通道和钾通道，在心律失常中发挥作用。
关键词：Capon，S-亚硝基化，NOS，心脏，杜兴
介绍
心源性猝死（SCD）和心律失常仍然是一个令人生畏的公共卫生问题。据估计，美国每年发生250000至400000例SCD[1]. 心室复极改变反映在心电图QT间期异常上，是与SCD风险增加相关的表型。通过全基因组关联研究，独立组和不同人群已证明NOS1AP基因（一氧化氮合酶1适配器蛋白）的等位变异与心电图QT间期异常密切相关[2,三]心脏性猝死[4]. 这表明NOS1AP可能参与心脏动作电位和复极的调节。此外，NOS1AP的一个单一多态性增加了钙通道阻滞剂使用者的QT间期和死亡率[5,6]. 这些影响的机制尚不清楚。NOS1AP基因编码神经元一氧化氮合酶（NOS1）配体。由于两个NOS1[7]钙通道阻滞剂抑制钙内流，推测这可能是潜在的机制，尽管在心肌细胞中NOS1也调节全局和肌浆网[Ca]2+]我[8].
NOS1AP（也称为CAPON）最初在大脑中被确定为神经元一氧化氮合酶（NOS1）的结合伙伴[9]. 后来的研究表明，NOS1AP至少有两种交替表达形式[10]. 所有10个NOS1AP外显子的转录产生一个cDNA，该cDNA可以翻译成一种蛋白质，命名为NOS1AP long（NOS1AP-L）。当只有最后两个外显子被转录时，会产生一种约30kDa的蛋白质，命名为NOS1AP-short（NOS1AP-S）。NOS1AP-S具有独特的N端氨基酸，其次是与NOS1AP-L的C端共享的113个氨基酸。NOS1AP_L包含两个可区分的结构域，即负责与NOS1相互作用的C端PDZ结合域和负责Dexras-1 S-亚硝化的磷酸酪氨酸结合域[11]. 这些剪接变异体的调控尚不清楚。
与NOS1AP的变化会改变心脏电生理特性的观点一致，最近的报告明确指出，参与心脏动作电位和复极（Na+，K+和钙2+通道）受S-亚硝基化调节[12]，一种翻译后修饰，涉及将NO添加到半胱氨酸的巯基部分[13]. 这就增加了一种可能性，即在某些病理条件下，控制这些通道S-亚硝基化水平的系统发生故障会导致心脏电不稳定。
关于NOS1AP在心脏中的生理作用的信息很少。NOS1AP过度表达缩短豚鼠心肌细胞动作电位持续时间[14]而斑马鱼中NOS1AP的吗啉类沉默也会导致动作电位持续时间缩短[15]. 其机制尚不清楚，但就豚鼠而言，显然涉及钙内流和钾电流的改变。
本研究的目的是评估NOS1AP对心肌细胞钙处理的影响，评估可能与其相互作用的离子通道，并评估营养不良性心肌病中NOS1AP的表达。
材料和方法
试剂
NOS1AP siRNA、siRNA转染试剂、siRNA转化培养基、siRNA稀释缓冲液、对照siRNA、NOS1AP抗体、内向整流钾通道（Kir）、连接蛋白43（Cx43）和一氧化氮合酶1（NOS1）抗体从圣克鲁斯（加州圣克鲁斯生物技术）获得。其余抗体从以下供应商处获得：Pierce的RyR2（Pierce Biotech-nology，IL）、LTCa2+来自Abcam（马萨诸塞州Abcam Inc.）、来自Sigma（密苏里州Sigma-Aldrich）的亚硝基半胱氨酸和α-肌聚肌动蛋白以及小鼠单克隆抗GAPDH抗体（新泽西州佛兰德斯Research Diagnostic Inc.）。
新生儿心肌细胞培养
根据《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物编号85-23，1996），对从1-3天龄Sprague-Dawley大鼠分离的培养NRVM进行实验[16]. 简单地说，10-15个心脏在含有55 mmol/L葡萄糖、740单位胶原酶II、370单位胰蛋白酶I和2880单位DNAse I的磷酸盐缓冲液（PBS）中消化（均来自新泽西州沃廷顿）。细胞通过100μm网格过滤，以2000 rpm旋转5分钟，然后通过Percoll梯度（Amersham Bioscience，NJ）将心肌细胞与其他细胞类型分离。用F-10培养基洗涤心肌细胞，并在含5%CO的加湿空气中孵育24小时237°C时，在含有10%胎牛血清（FBS）、10%马血清、10μmol/L胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷、100单位/mL青霉素和10μg/mL链霉素（均来自纽约Invitrogen Life Technologies）的F-10培养基中培养。第二天，用1x NRVM培养基代替细胞培养基：DMEM（Gibco Life Technologies，NY），含有1%FBS、20nmol/L硒、10μg/mL胰岛素、10μg/mL转铁蛋白、2mg/mL牛血清白蛋白、10μmol/L胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷和20μg/mL抗坏血酸。在此之后，用无血清DMEM替换培养基，并在进行实验之前再培养心肌细胞24小时。NRVM的电镀密度为105/厘米2.
siRNA基因沉默
NOS1AP基因沉默是使用制造商（圣克鲁斯生物技术公司）的改良方案进行的。简而言之，1.5x106用1x NRVM培养基将NRVM细胞置于60 mm培养皿中，并在37°C的CO中培养24 h2培养箱培养至60-80%的汇流处。加入含有双链NOS1AP siRNA或干扰（scr）RNA的转染混合物，并在37°C和5%CO中培养细胞6小时2接下来，添加含有2倍每种化合物的正常生长培养基（2X NRVM培养基），而不去除转染混合物，细胞再培养24小时。最后，用新鲜的1X NRVM介质替换培养基，再培养24个小时，然后用于实验。
成年心肌细胞的分离
使用戊巴比妥钠（100 mg/kg i.p.，4000 U/kg肝素）麻醉MDX小鼠（C57BL/10ScSn-DMDmdx/J）及其相应的对照小鼠（C57 BL/10SnJ）。脊髓反射抑制后，通过中线开胸术暴露心脏，并将其取出。为了分离心肌细胞，对心脏进行插管，并通过主动脉灌注钙2+-含有（mmol/L）120 NaCl、5.4 KCl、1.2 MgSO的游离碳酸氢盐缓冲液4，1.2 NaH2人事军官4，5.6葡萄糖，20 NaHCO三、10 2,3-丁二酮一肟和5牛磺酸，用95%的O充气2-5%一氧化碳2然后用胶原酶II（1 mg/ml；新泽西州沃辛顿）和蛋白酶XIV进行酶消化。通过机械破坏消化的心脏、过滤、离心和在Tyrode溶液中重新悬浮获得心室肌细胞。
蛋白质印迹
使用Micro-BCA蛋白质分析（皮尔斯生物技术公司，伊利诺伊州罗克福德）对NRVM总蛋白进行定量。使用NuPAGE凝胶上的60μg蛋白质进行SDS-PAGE（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA）。将蛋白质转移到PVDF膜（Bio-Rad，Hercules，CA）上，然后用5%脱脂奶粉在含有0.1%吐温20（TBS）的Tris缓冲盐水中培养过夜。用TBS清洗后，用兔抗NOSA1P（加州圣克鲁斯）或单克隆抗GAPDH抗体培养印迹，作为负荷控制。
细胞内[Ca的测定2+]我水平
用NOS1AP siRNA或scrRNA处理的NRVM生长在胶原涂层的盖玻片上。用fura-2 AM（Invitrogen）加载NRVM 20分钟，然后用无染料溶液洗涤3次，再培养20分钟，以允许染料脱酯。在倒置显微镜（Eclipse-TiS-Ni-kon）台上，将装载fura-2的心肌细胞转移到Lucite室。对肌细胞进行现场模拟（0.5 Hz）和[Ca2+]我使用IonOptix iCCD相机和专用数据采集软件（IonWizard采集系统，IonOptex，Inc）实时监测360/380 nm的荧光率。细胞被含有1.8 mM Ca的Tyrode连续地覆盖2+.
免疫染色和共焦显微镜
如上所述制备NRMV，在2%多聚甲醛中固定，并在4°C下与NOS1AP、Kir1.3、Cx43、LTCa抗体孵育过夜2+α-肌动蛋白和亚硝基半胱氨酸。使用抗小鼠或抗兔TRITC和抗兔或抗小鼠FITC（Jackson Immunoresearch，West Grove PA）在37°C下进行二次抗体孵育1小时。细胞核用Dapi（Invitrogen）染色，样品用Prolong Gold（Invit罗gen）镶嵌。使用蔡司LSM-700共焦显微镜获得数字图像。
共刻度分析
图像去卷积后，使用Huygens Essential软件（荷兰Hilversum的Scientific Volume Imaging）计算Pearson相关系数，进行定量共定位分析[17,18].
统计分析
数据以平均值±扫描电镜表示。为了比较两组，使用了Student t检验。A类P（P）小于0.05的值被认为是显著的。
结果
新生儿和成年心肌细胞NOS1AP的表达及丰度
NOS1AP的表达在我们的模型中得到了验证。为此，我们处理了NRVM进行蛋白质印迹分析(). NRVM表达NOS1AP的长（约50KDa）和短（约25KDa）亚型，与观察到的小鼠脑裂解物（阳性对照）相似。在脑裂解物中，观察到其他条带，这可能是由于NOS1AP翻译后修饰（即磷酸化）所致[10]. 我们使用免疫荧光和共焦显微镜证实了NRVMS中的这种表达(). 在这些细胞中，NOS1AP呈现一种间断模式和核定位，特别是在核膜上。成年小鼠心肌细胞中NOS1AP的免疫荧光也呈阳性()的分布模式与T小管的相关性更大。
新生儿和成人心肌细胞中NOS1AP的表达和丰度。A.来自新生大鼠心肌细胞（NRVMS）裂解物和大鼠脑裂解物（脑）的NOS1AP长和短亚型的代表性Western blot作为阳性对照。NOS1AP-L对应NOS1AP长亚型（~50 KDa），NOS1AP-S对应NOS1AP短亚型（~30 KDa）。B.NRVMS中NOS1AP（红色）的代表性免疫染色。细胞核显示为蓝色。C.成年小鼠心肌细胞中NOS1AP的代表性免疫染色。条形图显示20μm。
新生儿心肌细胞NOS1AP共定位
接下来，我们分析了NOS1AP可能的相互作用，以确定亚细胞位置和生理相关的相互作用。为此，我们分析了共同本地化的程度就地NOS1AP与L型钙通道、内向整流钾通道Kir3.1、ryanodine受体（RyR2）、α-肌动蛋白和连接蛋白43(). 分析()NOS1AP与Kir3.1钾通道（Pearson系数0.7±0.03）和L型钙通道（0.68±0.018）高度共定位。与RyR2、肌浆网蛋白（0.4±0.011）和α-端粒酶肌动蛋白、肌丝蛋白（0.35±0.032）的共定位程度低得多，而与连接蛋白43（Cx43）、椎间盘蛋白（0.15±0.01）共定位程度最低。这些结果表明，可能与影响心脏动作电位的离子通道发生功能性相互作用，而与肌浆网、肌节和闰盘的相互作用不太相关。
新生儿心肌细胞NOS1AP共定位。（A-D）新生大鼠心肌细胞NOS1AP免疫染色的典型共焦显微镜图像（绿色，左侧面板），及其与钾通道Kir1.3（Kir）、L型钙通道（LTCa）的共同定位2+)，ryanodine受体（RyR2），α-肌节肌动蛋白（肌动蛋白9，红色）（中间面板），以及（E）NOS1AP（红色）和连接蛋白43（Cx43，绿色）和合并图像（右侧面板）。细胞核显示为蓝色。条形图显示为20μm。（F） 对图像进行去卷积，并分析共定位的程度。方框和胡须图描述了共同定位的皮尔逊系数，每组n=7个细胞。
NOS1AP基因沉默对[Ca的影响2+]我瞬变和S-亚硝基化
由于NOS1AP与L型钙通道共定位，我们研究了该蛋白对NRVM钙转运的影响。为此，我们使用小干扰RNA沉默NOS1AP的表达。这样，NOS1AP水平降至控制水平的约30%(和). 这些处理既没有改变细胞的活力也没有改变细胞形态(，左侧面板）。在这些条件下，我们评估了[Ca2+]我0.5 Hz电刺激心肌细胞的瞬态(). 与干扰RNA处理的细胞相比，NOS1AP小干扰RNA处理细胞的[Ca2+]我瞬态（360/380 nm下的荧光(F类
360/380)：0.15±0.02 scrRNA vs.0.94±0.01 NOS1AP siRNA，p=0.008），同时[Ca降低2+]我上升速度(F类
360/380/s 5.3±0.84 scrRNA vs.2.9±0.46 NOS1AP siRNA，p=0.007）。
NOS1AP基因沉默对[Ca的影响2+]我瞬变和S-亚硝基化。A.左面板，转染后NRVM的代表性图像。中间面板，来自对照NRVM的细胞裂解产物的代表性Western blots，NRVM转染了干扰RNA（scrRNA）或NOS1AP siRNA（siRNA），用抗NOS1AP抗体进行探测，显示NOS1AP-L和S亚型的表达。GAPDH被用作负载控制。该图描述了密度分析（n=4）。B.[Ca的评估2+]我瞬态。代表[Ca2+]我转染scrRNA（黑线）或NOS1AP siRNA（红线）的心肌细胞的瞬态。该图显示了振幅和偏离速度的分析(F类
360/380/s） 电诱发[Ca2+]我NOS1AP siRNA（n=15，红色条）和scrRNA处理细胞（n=9，黑色条）的瞬态。C.用scrRNA或NOS1AP siRNA转染后心肌细胞中NOS1AP和S-亚硝基半胱氨酸（Cys-NO）的代表性免疫染色。条显示20μm。这些图表描述了NOS1AP和CySNO的免疫荧光强度，以及每次治疗中NOS1AP/Cys-NO=8细胞的共定位程度。星号表示P（P）<0.05 siRNA与干扰RNA。
由于NOS1和一氧化氮在心脏中的作用在一定程度上是由S-亚硝基化介导的[12]，我们评估了转染细胞中S-亚硝基化的程度。为此，我们使用了抗S-亚硝基半胱氨酸抗体，如前所述[19]，检测亚硝化蛋白质(). 在NOS1AP siRNA处理的细胞中，CysNO的强度（75.8±5.2 scrRNA vs.56.2±4.8 siRNA，p=0.0145）以及NOS1AP和CysNO共同定位的程度显著降低（0.73±0.02 scrRNA对0.66±0.02 siRNA（p<0.05））。这表明NOS1AP对[Ca的影响2+]我瞬态可能是由于离子通道上的氧化还原修饰所致。
NOS1AP在营养不良型心肌病中的表达
最后，我们分析了mdx小鼠心脏中NOS1AP的表达，mdx小鼠是一种表现心律失常的营养不良型心肌病模型[20]. 使用Western印迹法()我们发现，与对照组小鼠相比，mdx心脏中NOS1AP的表达增加了近一倍（被认为是长和短亚型）（p<0.05）。在分离的心肌细胞中使用免疫荧光也观察到了这一点()与对照组相比，mdx心肌细胞中NOS1AP荧光显著增强（mdx细胞为97.0±10.1，对照细胞为70±11，p<0.05）。此外，NOS1和NOS1AP在mdx细胞中的共定位程度增加（Pearson系数0.8±0.02，对照组0.85±0.008 mdx，p<0.05）。这些结果表明NOS1AP上调可能在营养不良性心肌病中起作用。
营养不良型心肌病中NOS1AP的表达。A.左，NOS1AP、长（L）和短（S）亚型在对照（从左到右的第一和第二通道）和营养不良（mdx）小鼠（从左至右的第三和第四通道）心脏匀浆中的代表性Western blot。GAPDH被用作负荷控制。右图为NOS1AP表达分析图，归一化为GAPDH表达，n=3个菌株的心脏。B.NOS1（红色）的代表性免疫荧光及其与NOS1AP（绿色，短和长亚型）在对照和mdx心肌细胞中的共同定位。图中显示了NOS1AP免疫荧光定量（强度/像素）和与NOS1的共同定位（皮尔逊系数）。N=6个来自每个菌株的细胞用于共定位分析，N=18个用于荧光强度分析。星号表示P（P）<0.05对照组与mdx组。
讨论
多项研究表明，NOS1AP基因的遗传变异与QT延长/缩短密切相关[2,21,22]和心脏性猝死[三,4,23]尽管机制尚不清楚。NOS1AP是大脑中神经元型一氧化氮合酶（NOS1）的伴侣[9]也在心里[14,24]NOS1调节细胞内钙处理[7,8]. 张等豚鼠心室肌细胞中NOS1AP（CAPON）过度表达，通过抑制L型钙通道和增强延迟整流钾电流的快速激活成分，导致动作电位缩短(我
氪). 相反，在米兰斑马鱼中使用吗啉醇击倒NOS1AP等发现动作电位缩短。由于斑马鱼中没有NOS1的存在，NOS1AP可能独立于与NOS1结合而发挥作用。
我们发现NOS1AP沉默会减弱[Ca2+]我瞬变，这可能与NOS1AP基因变异的影响有关。研究表明，这些变异与使用钙通道阻滞剂的患者QT延长和死亡率增加有关[5,6]. 与此一致，我们发现在新生儿心室肌细胞中，NOS1AP与L型钙通道共存。
NOS1AP与Kir3.1的共同定位是令人感兴趣的。Kir3.1是乙酰胆碱激活的钾通道（KAch公司) [25]. 它在心房颤动中起作用[26,27]是抗心律失常药物的靶点[28,29]. 有趣的是，使用起搏器和除颤器的患者NOS1AP mRNA水平降低，呈现出rs10494366和rs10918594 NOS1AP多态性[30].
NOS1AP对离子通道的作用机制可能包括S-亚硝基化。事实上，我们观察到用NOS1AP siRNA处理的心肌细胞S-亚硝基化减少。电压门控钠+和钙2+通道[12,31]和ryanodine受体RyR2[8,19]由S-亚硝基化调节。
此外，我们观察到mdx小鼠心脏中NOS1AP的表达增加，这是一种营养不良性心肌病小鼠模型，与这些小鼠骨骼肌中NOS1A1的上调一致[32]. 这种上调的影响尚待确定，但可能在钙处理、NOS1亚细胞定位和该模型中出现的心律失常中发挥作用[33,34].
NOS1AP短亚型和长亚型在心脏中的差异作用尚不清楚。在脑细胞中，研究表明NOS1AP-L而非NOS1AP-S与羧肽酶E相互作用，促进树突生长[35].
总之，在新生儿心肌细胞中，NOS1AP沉默可减少钙瞬变和S-亚硝基化。NOS1AP与L型钙通道和钾通道Kir3.1共定位，在营养不良心脏中上调。需要进一步研究来阐明NOS1AP在心脏中的复杂作用及其在心律失常中的病理生理作用。
致谢
这项工作由智利国家科学技术发展基金Proyecto Fondecyt 1120595资助。
工具书类
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