RNA聚合酶II和蛋白酶体的物理和功能关联

摘要

最近的研究表明26S蛋白酶体或其亚单位与RNA聚合酶II（pol II）转录之间存在一些联系。我们证明了19S调节颗粒中的几个蛋白质，而不是20S蛋白水解单元中的几个(1)26S蛋白酶体的(2)直接与酵母Gal4激活剂结合并被激活女孩发起人(三). 19S还被证明对RNA pol II在酵母和哺乳动物细胞中的有效延伸至关重要，并且这种活性不需要蛋白酶体的蛋白水解活性(4,5). 除了在伸长中的作用外，我们还发现这种蛋白酶体亚复合物，我们称之为APIS(三)，负调控Gal4-启动子相互作用体内（a.D.、F.G.、a.Ferdous、T.K.和S.a.J.，未发表的观察结果）。与蛋白酶体在转录中的非蛋白水解活性的证据相反，一些实验室注意到许多转录激活剂的效力与细胞中的蛋白质水平呈负相关(6——9)这表明转录激活过程和激活物通过泛素-蛋白酶体途径的转换之间存在密切的机制联系。最近发现蛋白酶体抑制剂强烈抑制雌激素受体介导的转录，并特异性阻断雌激素受体和其他转录因子在雌激素反应启动子上的循环，这进一步支持了这一观点(10). 这些结果表明20S和19S亚基可能直接参与转录过程。在这里，我们研究了这种可能性，并报告了转录和泛素-蛋白酶体途径之间的另一个交叉点。

在我们之前的研究中，APIS综合体招募到加仑1/10启动子，我们在染色质免疫沉淀（ChIP）分析中显示，启动子DNA与针对几种蛋白酶体ATP酶的抗体共沉淀，但是，通过使用针对蛋白酶体20S核心亚单位或盖子中蛋白质（19S调节颗粒的亚单位；参考文献。三). 此外，使用PCR引物支持扩增不同区域的加仑1基因提供的证据表明，诱导后不久，APIS复合物（但同样不是20S核心或盖复合物）沿着基因广泛分布，这与伸长的作用一致。我们在这里报道了一项更广泛的ChIP分析的结果，该分析旨在询问蛋白酶体是否可能在转录诱导后的某个时间与活性基因相关。事实上，我们发现26S蛋白酶体与诱导基因区域相关的证据，这些诱导基因区域与RNA pol II构建的位置相关，包括基因的3′端、紫外线损伤部位以及其他可能代表暂停部位的区域。此外，我们证明26S蛋白酶体抑制剂增加了转录终止位点的通读。最后，共免疫沉淀实验揭示了pol II和蛋白酶体之间的物理联系。因此，证据明确支持这两个复合物之间的物理和功能相互作用。因为我们分析的基因的启动子区域似乎是检测到pol II的唯一位点，而20S核心粒子却没有，所以我们假设26S蛋白酶体与停滞的延伸复合体相关，包括终止位点的延伸复合物，其活性可能对解决这些停滞的复合体很重要。

材料和方法

酵母菌株。之前描述了菌株SC691，以及Pre1-Flag和Cim5-Flag包含的菌株(三,11). Rpb3-Flag菌株由第一个转化酵母和血红蛋白I-线性化pRS306 RPB3质粒，包含≈500 bp的上游序列和与RPB3编码区融合的氨基末端标记序列。在鉴定出完整的克隆后，使用5-氟代甲酸选择来筛选第二个重组事件。这个加仑1::HIS3型通过克隆3′半的加仑1基因并插入2.6-kbSca公司我/Sma公司I片段从pRS 303进入Hin公司dII站点。

ChIP分析。图。​图11和​和55按照说明执行(三). 对含有Flag-epitope的蛋白质进行的ChIP分析基本相同；然而，在用20μl（50%浆料）的抗凝琼脂糖珠（Sigma）进行免疫沉淀之前，用染色质稀释缓冲液（1%Triton X-100/1.2 mM EDTA/16.7 mM Tris·HCl，pH 8.1/167 mM NaCl/0.5 mM PMSF）将染色质稀释1/100，与原始方案相比，免疫沉淀后的起始材料为1/10。

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图1。

通过ChIP分析揭示蛋白酶体和GAL1基因3′端的关联。(A类)地图加仑1显示通过PCR扩增的区域的基因。(B)加仑1ChIP分析的PCR产物。样本点以前在棉籽糖中女孩显示了添加半乳糖后30分钟（G.5）或添加半乳糖后2小时（G2）的基因诱导（R）。这些数字对应于特定DNA沉淀的数量，以输入DNA的百分比表示。总数为输入DNA的1%。

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图5。

蛋白酶体和3′端的结合镀锌10和热休克蛋白82基因。(A类)镀锌10ChIP分析的3′区PCR产物。引物位于镀锌10编码区域。样本点位于GAL基因诱导前（R）、添加半乳糖后15分钟（G.25）、30分钟（G.5）、1小时（G1）、2小时（G2）或4小时（G4）的棉子糖中。总数为输入DNA的10%(B)热休克蛋白82ChIP测定的PCR产物。样品点为热冲击前（Un）、热冲击15分钟后（HS）和热冲击解除20分钟后（R）。总数为输入DNA的10%。

半乳糖诱导条件。酵母细胞在30°C至中对数期生长，以2%棉籽糖为碳源。通过添加2%的半乳糖诱导细胞。对于ChIP实验，在指定的时间点添加甲醛。在交联之前取等分试样进行Northern分析。对于紫外线处理，将菌株放在培养皿中进行辐照，使细胞悬浮液的深度小于3 mm。每个菌株在杀菌灯照射40 J的紫外线，照射强度为1 J/s/m²不断搅拌。辐照后立即进行甲醛交联。

热冲击感应条件。酵母细胞在30°C至中期生长，通过添加等量预加热至53°C的培养基诱导热休克基因15分钟。通过在4°C下添加0.8体积的介质来逆转热冲击诱导。

免疫沉淀条件。将RPB3-flag菌株或未标记对照培养至中对数期，并将细胞制成颗粒。用水冲洗细胞，用5 mM ATP和ATP再生系统（15 mM磷酸肌酸和50μg/ml磷酸肌酸激酶）在MTB缓冲液（500 mM Hepes，pH值7.5/100 mM醋酸钾/5 mM醋酸镁/1 mM EGTA/0.1 mM DTT/10%甘油/蛋白酶抑制剂）中重新悬浮，并通过打球制备提取物。测量蛋白质浓度后，将等量的蛋白质与与提取缓冲液平衡的抗病毒琼脂糖珠混合。免疫沉淀物在4°C下进行4 h，珠粒化并用结合缓冲液广泛清洗。样品在SDS/10%PAGE上进行检测，并用标准方法进行蛋白质印迹。

β-半乳糖苷酶(β-gal）报告人分析。这个ise1号机组应变(12)用pHZ18Δ2或pL101转化，保存在Ura脱落培养基上供选择。细胞生长到中期，并用半乳糖诱导4小时（在存在或不存在100μM MG132的情况下）。细胞造粒并用dH清洗₂O.提取物通过在缓冲液A（25 mM Tris·HCl，pH 7.5/150 mM NaCl/5 mM MgCl）中搅拌制成₂/10%甘油/蛋白酶抑制剂）。蛋白质水平由Bradford测量并归一化，β-gal活性由氯酚红β-d日-用标准方法水解每微克提取物中的吡喃半乳糖苷。

结果

蛋白酶体与3′GAL1结束。ChIP分析用于确定完整的26S蛋白酶体是否与加仑1基因在诱导后的任何时刻。图1A类显示了一个信号，表示20S核心粒子与加仑1基因（参见图1B)在诱导转录后30min内观察到。通过使用扩增加仑1包括上游激活序列的promote。然而，Sug1蛋白是蛋白酶体ATP酶之一，也是APIS复合体的组成部分，在诱导30分钟后明显存在于该位点。首先，这表明上游启动子位点20S核心缺乏信号不是蛋白酶体与DNA交联不良或其他一些微不足道的原因造成的，并验证了我们之前的结论，即Gal4特异性地招募APIS(三)不是整个26S蛋白酶体(13)到激活的启动子。更重要的是，这一令人惊讶的结果表明，整个蛋白酶体最终被招募到加仑1基因。

ChIP分析中的20S特异性信号几乎完全依赖于女孩半乳糖的基因表达和强度随时间增加而增加，在诱导后2小时达到峰值(图1A类). 然而，即使在诱导后2小时，在基因的5′端也没有观察到20S特异性信号。如前所述，该基因的3′端也与抗Sug1抗体共免疫沉淀。然而，在这种情况下，在诱导30分钟后观察到一个强烈的信号，在诱导2小时后强度仅略有增加（如果有的话）(图1A类). Sug1和20S与DNA结合的不同动力学和空间分布与APIS复合体在转录过程早期是必需的这一观点一致，可能是为了驱动伸长，并且功能独立于蛋白酶体核心，如前所述(三,4). 他们还支持20S核心复合物，可能是在完整的26S蛋白酶体的背景下，被募集到基因的3′端，参与一些不同的过程。

为了进一步测试这一结果，使用携带Flag表位标记的Pre1蛋白的酵母菌株重复检测(11)，20S组件。结果如所示图2A类 下部在这种情况下，少量启动子DNA与抗Flag抗体共同免疫沉淀。诱导后带的强度略有增加。应该注意的是，最高点的抗Flag可沉淀DNA水平分别比使用抗20S或抗Sug1抗体沉淀的DNA水平高约3到10倍（图。1A类和​和2B).2B). 因此，在这种更有效的免疫沉淀中观察到的微弱信号可能代表20S与启动子区域的低水平关联，而使用抗20S抗体无法检测到。或者，该信号可能是由于少量剪切DNA片段的长度足以包括上游激活序列区域和20S复合物清楚结合的起始位点的3′序列（见下文），这也无法与抗20S抗体检测到。无论如何，该信号比在基因3′端观察到的信号弱得多，在添加半乳糖30分钟后再次增加，并在诱导后1至2小时达到峰值(图2和数据未显示）。

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图2。

Rpb3和蛋白酶体蛋白与加仑1通过使用ChIP分析。(A类)加仑1ChIP分析的PCR产物。上游激活顺序是指镀锌1–10基因的启动子区和3′至3′区加仑1（请参见图1A类). 样本点以前在棉籽糖中女孩添加半乳糖后30分钟（G.5）和2小时（G2）进行基因诱导。总数为输入DNA的10%。(B)ChIP结果图。这些数字对应于特定DNA沉淀的数量，以输入DNA的百分比表示。(C)时间进程加仑1基因诱导。加仑1mRNA水平标准化为行动1通过Northern分析测量，并绘制为峰值水平随时间的百分比。

通过使用表达另一种蛋白酶体ATP酶标记的Cim5/Rpt1蛋白的菌株重复相同的实验(图2A类). 结果与使用抗Sug1抗体观察到的结果相似。发现标记的Cim5/Rpt1蛋白与启动子区和3′端加仑1基因。事实上，使用单克隆抗体结合表位标记蛋白进行的ChIP分析提供了与使用针对天然因子的抗体类似的结果，这有力地证明26S蛋白酶体确实与蛋白质的3′端有关加仑1基因，但启动子区域较弱或根本没有，并且在ChIP分析中观察到的条带不是抗体与其他一些蛋白质交叉反应的结果。

蛋白酶体与Pol II相关并参与终止吗？为什么蛋白酶体会出现在转录活性基因的3′端？一种可能性是一些蛋白酶体介导的事件可能参与转录的终止。从机械上来说，对终止没有很好的理解(14,15)没有证据支持或反对蛋白酶体在这一过程中的作用。如果蛋白酶体参与终止，人们可以预测蛋白酶体与加仑1该基因与该区域RNA pol II复合物的积累有关。为了验证这一理论，通过使用表达Flag标记的Rpb3蛋白的菌株进行了另一组ChIP测定。如所示图2A类（并用图表表示图2B)，与Rpb3关联的信号与的3′端加仑1添加半乳糖30min后强度增加，最终在诱导后2h达到峰值。pol II-启动子关联显示类似的动力学。

我们还研究了加仑1通过Northern印迹分析进行mRNA合成。这个加仑1mRNA水平标准化为行动1mRNA。如所示图2C，级别加仑1转录本在1h内稳定增加，在诱导后2h达到最大值，然后在诱导后4h（稍后的时间点未显示）以略微降低的稳定状态稳定下来。因此，26S蛋白酶体和pol II在加仑1基因之间以及与全长转录物的出现有很好的相关性。

如果蛋白酶体确实在终止过程中起作用，那么可以预测其活性的化学抑制剂将对这一过程的效率产生影响。为了测试这种可能性，我们使用了Hyman和Moore开发的β-半乳糖报告试验(16). 该试验使用由加仑1由核糖体蛋白51基因（5′外显子、内含子和部分3′外显基因）组成的上游激活序列在框架中融合到lacZ公司基因。在半乳糖诱导后的对照构建物（pHZ18Δ2）中，前mRNA被剪接并产生β-gal。测试构造（pL101）包含ADH2公司基因插入内含子，所以任何产生的β-gal都是通过聚合酶读取该位点的结果。

将构建物转化为对蛋白酶体抑制剂敏感的酵母菌株(12)并在适当的选择下生长。从每个转化中分离出三个单独的菌落，并在棉籽糖中生长到中对数期。诱导是通过添加半乳糖在26S蛋白酶体抑制剂MG132存在或不存在的情况下进行的。诱导4小时后从样品中提取提取物，并测试β-半乳糖活性。图3结果表明，与未处理的样品相比，向携带lacZ（pHZ18Δ2）前缺乏终止位点的质粒的菌株中添加蛋白酶体抑制剂导致β-gal活性降低至83.3±6.6%。相反，与未处理样品相比，将蛋白酶体抑制剂添加到携带lacZ（pL101）前含有终止位点质粒的菌株中，导致β-gal活性增加至271.3±28.7%。蛋白酶体抑制剂对终止位点通读频率的这种影响与26S在这一过程中起作用的观点一致。然而，应该注意的是，蛋白酶体抑制剂对终止效率的影响不大。然而，pL101的β-gal活性水平通常约为pHZ18Δ2的1%，在MG132的存在下，在抑制剂的存在下增加到约3%。这一结果并不奇怪，因为终止似乎是一个显著的可塑性过程，它对各种突变和药物具有众所周知的耐受性(14,17).

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图3。

26S蛋白酶体的抑制导致终止位点的通读增加。(A类)报告结构的示意图。(B)MG132对报告构建物β-gal活性的影响。在有或无100μM MG132的情况下，半乳糖诱导菌株4小时的三个独立实验的结果，获得了提取物。结果显示为未处理样品中的活性高于处理样品的活性。

改变转录终止位点会导致蛋白酶体结合位点的相应改变。上述数据表明，蛋白酶体在几个转录活性基因的3′端富集，并在终止中发挥功能作用。如果是这样，那么如果终止位点发生改变，人们就会预测蛋白酶体与基因的关联会发生相应的改变。为了验证这个假设加仑1::HIS3型通过将2.6kbp片段插入加仑1(图4A类). Northern分析表明，这种插入导致加仑1比野生型菌株中观察到的长约800个碱基对的转录本(图4B). 因此，终止发生在插入物内，聚合酶没有到达加仑1在插件的另一端。使用PCR引物对进行ChIP分析，该引物对扩增了加仑1基因和另一对扩增插入区域内的区域。突变体加仑1::HIS3型菌株在最初的3′末端没有Pre1的转录依赖性积累加仑1(图4C). 相反，在Northern分析表明转录发生的区域，在插入的DNA中观察到Pre1的转录依赖性积累(图4C). 这些数据清楚地表明，通过移动终止位点，26S蛋白酶体与DNA的结合位置也相应改变。

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图4。

改变终止位点会改变蛋白酶体与DNA的结合。(A类)显示插入位置的地图加仑1分析中使用的引物的编码区域和位置。(B)Northern印迹显示加仑1插入突变体中的转录本。样品点为棉子糖（R）和添加半乳糖（G2）后2 h。用这两种物质探测斑点行动1和加仑1碎片。(C)蛋白酶体蛋白与突变体的关联加仑1使用ChIP分析进行菌株筛选。放大区域如图所示。样本点以前在棉籽糖中女孩添加半乳糖后30分钟（G.5）和2小时（G2）进行基因诱导。总数为输入DNA的10%。

蛋白酶体在3′其他诱导基因终止。为了解决该观察结果的普遍性，使用PCR引物对其他诱导基因的3′端进行了ChIP分析。加仑1和镀锌10相邻定位，共享相同的启动子，但方向相反。在标记了Flag的Pre1菌株中进行ChIP分析，以评估26S蛋白酶体是否可以在镀锌10诱导后。PCR结果显示26S蛋白酶体在镀锌10与在加仑1(图5A类).

要将此分析扩展到女孩基因，我们检测了热休克蛋白82，一种热休克基因。的转录热休克蛋白82可以通过添加预热介质快速诱导，然后通过添加冷却介质使其沉默(18). 表达Flag-tagged Cim5/Rpt1或Pre1的细胞生长到中对数期，并在热休克（未诱导）前、将温度升高到39°C（诱导）后15分钟或通过将温度恢复到30°C（反向）来逆转热休克后20分钟用甲醛处理。如所示图5B，3′端DNA很少或没有热休克蛋白82在没有诱导的情况下或当细胞受到热休克时，由抗Flag抗体在任一菌株中沉淀，然后在交联之前恢复到正常温度。然而，当在高温下进行交联时，观察到强烈的信号。在上未观察到信号加仑1/10在这些条件下，在加热培养基同时添加甲醛时，也没有观察到信号（数据未显示）。从镀锌10和热休克蛋白82基因认为，26S蛋白酶体和基因3′端的转录依赖性关联并不局限于加仑1.

Pol II和蛋白酶体在终止区域外位点的染色。上述数据揭示了蛋白酶体与几个转录活性基因的3′端的关联，并认为复合物在终止中起着功能作用。然而，蛋白酶体-基因关联是否完全局限于活性基因的3′端？在进行ChIP实验的过程中图4，我们检测到标记的Pre1蛋白与改变的加仑1与替代终止位点分离良好的基因（数据未显示）。这一结果，再加上众所周知的事实，即转录延长是时断时续发生的，并且在任何给定的基因中都有许多暂停位点(19)，让我们考虑了一个更一般的想法。这个假设是，蛋白酶体与几个位置的基因相关，这些位置对应于pol II构建的位点，其中终止位点只是一个特例(20,21). 如果是真的，那么当一个新的RNA pol II暂停位点插入到一个基因位点时，人们应该观察到20S核心粒子与该位点的关联性增强。

为了验证这一观点，我们研究了紫外线照射对20S核心粒子与中间区域结合的影响加仑1基因(图6A类). 众所周知，紫外光诱导的损伤会严重阻碍转录延长(22,23). 当细胞在棉子糖（非诱导条件）中生长时，只有背景信号水平（另请参阅图1)在ChIP分析中观察到(图6A类，第一道）使用抗20S抗体。当未诱导细胞在交联（第三通道）前接受紫外线照射时，也得到了相同的结果。诱导加仑1交联前的转录导致未辐照细胞（第二通道）背景上有轻微信号。该信号显然是真实的，通过使用更有效的抗FLAG抗体和FLAG-Pre1菌株（未显示）的类似实验确定，这表明20S与该区域的低水平关联加仑1在正常条件下。然而，当在交联之前对诱导的细胞进行紫外线照射时，观察到共免疫沉淀的DNA显著增加(图6A类，最后一条车道）。当未诱导细胞受到辐照时，情况并非如此。因此，蛋白酶体的补充依赖于DNA损伤和活性转录，这与26S复合体与基因的结合是对聚合酶停滞的反应这一模型一致。紫外线诱导蛋白酶体募集的观察结果与之前的一些观察结果一致，因为已经证明，通过在模板中造成损伤或添加α-阿曼肽来阻止伸长，会导致RNA pol II的多泛素化和随后的26S蛋白酶体依赖性降解(23). 然而，中显示的数据图6A类指出这些事件可能是在停滞复合体的位置开始的，并提出一个具体的模型，即蛋白酶体作用从模板中清除阻塞的复合体。

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图6。

蛋白酶体与RNA pol II相互作用并与转录活性相关加仑1紫外线照射后。(A类)加仑1通过使用抗20S抗体来自ChIP测定的代表基因中间区域的PCR产物。样本点位于棉子糖（R）、紫外线处理后的棉子糖、半乳糖诱导后的30分钟或半乳糖和紫外线处理后30分钟。总数为输入DNA的1%。地图加仑1基因显示PCR扩增的区域。(B)免疫沉淀Rpb3样本的Western分析。从含有标记Rpb3（T）或未标记对照（C）的菌株中提取的提取物用抗标记抗体进行免疫沉淀，并检测26S亚基，如图所示。输入量占添加总蛋白质的1%。

26S蛋白酶体和RNA Pol II物理结合。上述所有数据均通过ChIP分析获得，该分析报告了蛋白质与DNA的直接和间接相互作用。因此，更直接地测试pol II–蛋白酶体的关联性是有意义的，因此进行了联合免疫沉淀实验。通过使用Rpb3-标记菌株或未标记菌株作为阴性对照，我们用抗标记抗体免疫沉淀RNA pol II复合物。使用抗20S抗体的Western blot表明，通过使用Rpb3-Flag菌株的提取物，20S复合物在免疫沉淀材料中高度富集，但不是从未标记菌株中富集。这些数据与26S和RNA pol II的某些部分在细胞中物理相关的观点一致。

讨论

为什么蛋白酶体被招募到停滞的聚合酶复合物中？上述数据表明，蛋白酶体被募集到基因中与RNA pol II复合物构建区域相对应的位点，包括终止位点附近的3′区、紫外线损伤位点，以及可能代表延长暂停位点的某些其他序列。我们认为，这些观察反映了26S蛋白酶体与转录机制的关联，以响应模板中导致明显停滞的序列或结构。这些观察结果进一步表明，DNA损伤前停滞复合体发生的事件可能与终止区伸长停滞时发生的事件在机制上类似。有证据表明，参与在损伤部位分解RNA pol II的相同蛋白质也参与转录延伸。这个酿酒酵母蛋白质Def1与Rad26（酵母中的CSB同源物）形成复合物，并参与紫外线照射后RNA pol II的泛素化(24).定义1缺失菌株也对转录延伸抑制剂6-氮杂嘧啶敏感(24). 此外，与欧洲安全标准1，编码RNA pol II终止所需的脯氨酸异构酶和E3泛素连接酶基因RSP5（RSP5）(25). 这种相互作用似乎通过Rpb1发生(25).

转录延伸的阴阳。蛋白酶体作用于停滞的聚合酶复合物的机制尚不清楚，无论是在DNA损伤部位还是在终止区。显然，一种可能性是聚合酶和/或一些相关蛋白被降解，导致封闭复合物的释放。我们的实验室之前已经证明，蛋白酶体的19S亚单位对于RNA pol II以独立于20S和蛋白水解的方式进行有效延伸至关重要(4,5). 这里，我们表明抑制26S蛋白酶体会导致转录终止位点的通读增加。换句话说，对19S的抑制会降低延伸率，而对20S的抑制则会降低终止。这一结果表明，这两种活性的平衡对于有效转录很重要。一个可能的模型是，19S的伴侣样活性将重塑停滞的聚合酶复合体，导致延长，而作为终停聚合酶，则需要整个26S蛋白酶体发挥更剧烈的功能，并可能发生降解。在正常的转录过程中，这种降解途径只占暂停事件的一小部分。然而，诸如DNA损伤之类的事件会增加末端停滞聚合酶的数量，随后会导致通过该途径解决的停滞复合物的增加。

与pol II和20S核心粒子在基因研究的3′端和某些内部区域的重合形成鲜明对比的是，在基因启动子上几乎没有观察到20S加仑1这与完整的蛋白酶体与伸长的聚合酶复合物相关联的观点一致，无论是组成性的还是特异性的在强暂停位点，但它不是起始前复合物的一部分。蛋白酶体ATP酶，如Sug1、Sug2和Cim5，明显存在于启动子处，然而，我们提出这是Gal4介导的APIS复合物募集的反映(三). 莫里斯最近的一份报告等。(13)显示26S蛋白酶体的成分在CDC20型启动子。在他们手中，还可以发现血凝素标记的Pre1与加仑1与我们的结果相反（图。​（图11和​和2）。2). 然而，我们确实在活性转录基因的编码区观察到了26S蛋白酶体。这种差异的一个可能解释是染色质制备过程中剪切的程度不同。在我们手中，经过超声处理后，DNA片段的平均大小约为400–500个碱基对。鉴于加仑1（以及与启动子外的基因相关联的高水平Pre1），不完全剪切可以解释这些作者观察到的结果（即使用5′-定向引物扩增长DNA的一个次要成分）。与该观察结果一致的是，在Morris的工作中，启动子区域没有显示Pre1关联等。(CLB2、CLN1、和CLN2型)不靠近任何基因的3′端。考虑到这一点，重要的是要注意，只有19S突变株糖1–25而不是20S双突变株前1-1前4-1显示出任何缺陷CDC20型转录激活，提示蛋白酶体在这一过程中具有非蛋白水解作用(13).

结论

总之，我们已经证明26S蛋白酶体与DNA损伤部位和活性基因3′端的转录活性基因相关。此外，我们还表明26S蛋白酶体和RNA pol II可以在物理和功能上相互作用。这些结果表明，蛋白酶体在转录终止和清除DNA损伤阻断的死亡复合物中起着重要作用，并表明这些过程可能与机制有关。这些观察揭示了蛋白酶体和RNA pol II转录之间的另一种密切联系，应该会刺激这一领域的其他研究途径。

致谢

注意事项

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：ChIP，染色质免疫沉淀；polⅡ，聚合酶Ⅱ；β-半乳糖苷酶。

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