强迫症的特征是侵入性的痛苦想法（强迫症）和/或重复的精神或行为行为（强迫），是导致疾病相关残疾的主要原因(1,2). 尽管强迫症的病理生理学基础尚不清楚，但多条证据表明皮质-纹状体-丘脑-皮质（CSTC）回路中存在调节障碍(三-6). 具体来说，功能成像研究表明眶额皮质（OFC）和腹内侧纹状体（VMS）的过度活动与强迫症病理学有关(5,7,8). 此外，成功的治疗与多动症的减少有关(9,10). 然而，目前尚不清楚OFC-VMS过度活动是否会直接导致强迫症症状，因为活动增加可能代表适应性、稳态或不相关的过程，以补偿其他原发性异常。因此，我们使用了一种光遗传学策略来直接测试过度刺激谷氨酸能OFC-VMS投射是否会导致小鼠出现OCD样行为。
携带编码通道视紫红质（ChR2）基因的Cre诱导腺病毒相关载体（AAV）融合到增强型黄色荧光蛋白（EYFP）[pAAV-Ef1a-DIO-ChR2（H134R）-EYFP；称为DIO-ChR2](11)立体定向注射到EMX-Cre转基因小鼠的OFC中，以确保皮层谷氨酸能神经元中特异性ChR2的表达() (12). 皮层Cre表达导致ChR2-EYFP持续表达(). 通过OFC中的慢性光纤植入物进行的473nm的单侧刺激产生了即刻早期基因c的侧向化增加的激活-福斯(P（P）< 0.009) ()这表明激光刺激在体内激活了细胞。注射后两周，在OFC细胞体和投射到VMS的轴突中可见EYFP染色()这表明OFC-VMS预测的目标。皮质类固醇切片的体外记录显示473-nm激光刺激纹状体OFC轴突终末后VMS场反应(). 为了验证体内对表达ChR2的OFC-VMS终端的充分刺激，我们将立体光电极（optrodes）植入VMS中，以允许组合光纤刺激和32通道同时记录多个单个单元(). 在清醒行为小鼠中，体内记录显示473-nm激光刺激纹状体OFC轴突终末后VMS场反应强烈()这表明激活特定皮质-VMS投射的可行性。
将ChR2-EYFP AAV注射到OFC中导致从OFC到VMS的投射中的功能性ChR2表达(A类)DIO-ChR2注入示意图。（左）参考矢状切面显示EMX-Cre小鼠腹内侧OFC（VO/MO）的注射位置（2.6 mm AP，1.7 mm DV，0.5 mm ML）。蓝色阴影：皮质和海马中Cre的表达。（右）OFC中的Cre-expressing谷氨酸能细胞不可逆地反转ChR2-EYFP开放阅读框，导致细胞类型特异性ChR2-E_YFP表达（绿色阴影）。EF-1α，伸长率1α；ITR，反向终端重复；WPRE，土拨鼠肝炎病毒翻译后调控元件；DLO，眶额皮质背外侧；LO，眶额外侧皮质；PrL，边缘前皮质。(B类)YFP-免疫抑制共聚焦图像显示在OFC注射部位单侧ChR2表达。比例尺，500μm。(C类)c-Fos免疫染色显示473-nm光通过慢性光纤植入物激活清醒行为小鼠的OFC。（插图）参考冠状切面。蓝色方形，受刺激；黑色，无刺激。(D类)刺激与非刺激OFC中c-Fos阳性细胞的定量(P（P）< 0.009) (n个=4个控制；4只ChR2小鼠；各五个部分）。(E类)光纤植入部位下的轴突YFP染色证明了OFC-VMS投射的靶向性（箭头所示）。比例尺，100μm。（插图）低放大倍数。比例尺，500μm。(F类)纹状体切片的细胞外场记录。随着激光功率的增加，群体峰值振幅增加。（插图）0.1ms光脉冲（3mW）后的个体种群峰值；校准条：垂直0.5 mV，水平1 ms。n个=三只动物各取4片。(G公司)VMS立体光电极植入示意图。（立体坐标：0.98 mm AP，3.5 mm DV，1.25 mm ML）。CPu，尾状壳核；AcbC，伏隔核；AcbSh，伏隔壳。(H（H）)清醒行为动物的体内记录显示了对VMS终端473-nm刺激的场反应。以0.5 Hz频率发出20次闪光的平均响应。校准棒：垂直0.5 mV，水平20 ms(我)10列原始响应以10 Hz闪烁。校准棒：垂直0.5 mV，水平100 ms。
因为强迫症患者OFC-纹状体回路过度活跃(三-6)，我们预测OFC-VMS活性的直接升高将导致OCD相关行为的增加，包括梳妆、焦虑和脉冲前抑制（PPI）缺陷(13). 我们将DIO-ChR2注射到EMX-Cre小鼠的左侧OFC中，并在左侧VMS中单侧植入光纤探针(). 在等待3至4周的手术恢复和稳定的病毒表达后，我们使小鼠习惯于开放场和光纤刺激设备。然后，我们通过连续五天（10毫秒，1至5毫瓦）以10Hz刺激5分钟，反复提高OFC-VMS预测的活性(14). 用数字视频记录打扮行为，并由盲人评分员在刺激前（Pre）、刺激中（Stim）和刺激后（Post）进行5分钟的评分(). 虽然急性OFC-VMS刺激并没有产生梳毛，但在连续几天的预刺激期间，注意到梳毛时间略有但显著的增加()[重复测量方差分析（ANOVA），主要影响：P（P）< 0.048;F类= 4.43; 费希尔保护最小显著性差异（PLSD）：第3天，P（P）< 0.03; 第5天，P（P）< 0.047]. 因为第2天到第5天的预刺激测量值作为前一天刺激效果的24小时时间戳，这表明重复刺激导致慢性回路改变，最终导致持续的、刺激无关的OCD样行为。虽然在预刺激期内，处理压力可能会导致梳理增加，但在数据收集前一周，通过每天习惯光纤系带，可将压力降至最低，而对照组和ChR2+小鼠的压力相同。为了解决梳理增加的时间过程，我们在刺激后一小时检查了一个新的队列（Groom1小时后) (). 我们观察到，使用这种方法，连续几天的梳妆次数显著增加（主要效果：P（P）< 0.02;F类= 7.32) (). 虽然总梳理时间增加了，但在刺激的第5天，ChR2+动物的定型句法梳理链没有显著增加(表S1). 在刺激的第1天，在对照组和ChR2+动物之间未观察到梳理时间的差异，这表明没有激光刺激的ChR2表达不会导致梳理时间的增加。值得注意的是，即使在2周后没有刺激的情况下，梳洗也会持续增加(P（P）< 0.03) ().
短暂重复过度刺激OFC-VMS投射导致梳理行为逐渐增加(A类)病毒注射和光纤植入的定位。ChR2（绿色）在腹内侧OFC中表达。将光纤植入VMS以刺激OFC投射的轴突末端的ChR2。(B类)OFC-VMS预测慢性刺激的时间线。习惯栓系程序7天后（T1至T7)，小鼠接受刺激方案。时间第页，共页=开放字段中的时间。(C类)连续五天的打扮行为。连续五天在刺激前（Pre）、刺激中（Stim）和刺激后（Post）评估5分钟的总梳理时间。数据分为第1天到第5天的Pre、Stim和Post类别，以便于检查随时间变化的行为。刺激（10 Hz）导致ChR2动物在刺激（Pre）前梳毛时间显著增加（主要影响：P（P）< 0.048,F类= 4.43; 事后测试：第3天*P（P）< 0.03; 第5天*P（P）< 0.047;n个=8只ChR2小鼠，7只对照组）。(D类)检查刺激的慢性影响的时间线。(E类)经过6天的刺激后，ChR2+级动物在“新郎”期间的梳毛次数显著增加1小时后（主要效果*P（P）< 0.02;F类= 7.32; n个计数：ChR2=6；控制=5）。(F类)重复刺激后两周（T28)，ChR2+以上的动物继续表现出明显增加的梳理（新郎慢性的*P（P）< 0.03; 单尾的t吨测试），尽管与刺激范式后立即的时间相比，绝对梳理时间有所减少（T12).
与对照组相比，急性OFC-VMS刺激立即导致运动大幅但短暂增加；刺激前后未观察到差异(图S1A). 为了确保梳洗的增加不仅仅是运动增加的结果，我们注射DIO-ChR2并在EMX-Cre小鼠的运动皮层（M2）植入光纤(图S1B). 上述5天的刺激模式导致运动增加(图S1C)但不是为了增加修饰(图S1D)这表明，梳洗的增加不仅仅是整体活动增加的副作用。为了确定OFC-VMS通路过度激活在诱导持续梳理中的特异性，我们将AAV-ChR2注射到边缘下和边缘前皮质（IL/PrL）(图S2A)并使用我们的5天刺激范式刺激IL/PrL–VMS预测。反复刺激IL/PrL–VMS预测并没有导致梳理行为的逐渐增加(图S2、B至D).
其他与强迫症相关的行为测量在完成5天刺激范式后进行测试。PPI无差异(13)或与刺激前测试相比的焦虑水平（旷野和高架迷宫）(图S3); 此外，在急性刺激期间，未观察到旷野焦虑的变化(图S4). 总之，这些结果表明，OFC-VMS投射的重复刺激会导致重复行为的特定诱导。
接下来，我们使用VMS立体视杆检查了与进行性梳理增加相关的电生理变化(和图S5). 在清醒行为的小鼠中，在15分钟的刺激方案和1小时的梳理后评估期间，获得了VMS中多个单一单元的记录(). 在重复刺激的5天内，在单个单位中观察到对10 Hz刺激（Stim）或0.1 Hz探针脉冲（用于测量刺激前、刺激后和刺激后1小时内的光诱发活动）的光诱发反应。细胞对光脉冲表现出一系列反应，包括激活()，抑制()，无影响(); 因此，我们使用每个细胞的刺激引起的放电率变化（表示为Z轴-得分；看见补充方法)评估对传入刺激的反应性。在刺激的5天内，刺激期间和刺激后1小时的平均反应均增加(;对=0.21和0.28；P（P）分别<0.002和<0.001）。Z轴-第5天的得分高于第1天，这表明诱发放电增加（在10 Hz时：P（P）< 0.02; 0.1 Hz时：P（P）< 0.004). 因此，重复的过度刺激导致光诱发放电的显著渐进性增加，与重复行为的增加平行。
每天重复刺激OFC-VMS投射导致诱发放电增加(A类)（左）立体光电极植入部位示意图。（右）通过植入浸泡在Hoecht染色剂中的立体光电管（1:1000）进行可视化放置。比例尺，500μm。(B类)用于体内记录的刺激协议。(C类到E类)在10 Hz刺激（左侧）和0.1 Hz探针脉冲（右侧刺激后1小时）期间记录的三个神经元的典型刺激周棘波直方图（5 ms时间段）。每个细胞的基线自发放电率显示为粉红色虚线。细胞表现出不同的刺激反应，包括诱发激活（C）、诱发抑制（D）和无反应（E）。(F类)光激发（通过周围刺激测量z（z）-10 Hz刺激（Stim）期间和刺激后1小时（1小时后）0.1 Hz探针脉冲期间5天的刺激得分(*P（P）<0.021和P（P）< 0.004). 否定Z轴-第1天和第2天0.1赫兹的分数表明在新郎打扮期间诱发放电率受到了净抑制1小时后在前两个10 Hz刺激时期之后。
最后，我们确定用于治疗强迫症的药物方案是否会逆转重复行为和诱发VMS活动的增加。经过7天的梳理诱导后，我们开始服用氟西汀（18mg/kg体重/天），同时继续每日刺激(). 之所以选择氟西汀，是因为5-羟色胺再摄取抑制剂（SRIs）是唯一经证实的强迫症单一疗法(15). 尽管氟西汀在1周后没有效果，但2周的治疗使梳理行为逆转至控制水平()（主要效果：P（P）< 0.009,F类= 9.53; Fisher's PLSD：基线与第2周，P（P）< 0.003). 这种延迟反应与强迫症患者有效SRI治疗的延迟开始相一致。我们还使用车辆控制组重复了这个实验(). 同样，2周的氟西汀可以逆转诱导的梳理(). 此外，在一个单独的立体光电极植入动物队列中，慢性氟西汀治疗后，重复10 Hz刺激引起的光诱发活动增加正常化().
通过慢性而非急性氟西汀治疗可以解决持续梳理和诱发放电率升高的问题(A类)氟西汀洗出实验的实验时间线。(B类)两周的氟西汀治疗将梳妆减少至对照水平。主要效果：P（P）< 0.009;F类= 9.53; Fisher's PLSD：基线与第2周***P（P）< 0.003. 经过一周的氟西汀清洗后，重新恢复了梳妆的效果。主要效果：P（P）< 0.09;F类= 3.58.n个值：ChR2+小鼠=8只；控制=7。(C类)氟西汀与载药实验的实验时间线。(D类)两周的氟西汀治疗将毛发梳理减少到了车辆处理动物的水平。主要效果：P（P）< 0.14;F类= 2.59; Fisher's PLSD：基线与第2周*P（P）< 0.04. 氟西汀：n个= 7; 车辆：n个= 6. (E类)（左）立体光电极-植入动物，周围刺激Z轴-氟西汀治疗2周后10Hz刺激评分标准化(P（P）< 0.028); 经过2周的清洗，Z轴-得分恢复到预处理水平。（右）周围刺激Z轴-氟西汀治疗后，0.1Hz探针脉冲的得分无显著下降，洗脱后恢复到预处理水平。
OFC-VMS投射的反复过度激活导致梳理的进行性增加，在时间上与VMS光诱发放电的累积增加有关。OFC-VMS通路的急性刺激不足以产生OCD相关的过度梳理(三,16-18). 行为改变持续存在，在6天内变得与刺激无关。虽然经典理论表明，包括强迫症症状在内的异常重复行为直接源于CSTC回路的过度活动(19-21)因果关系很难证明。虽然去甲肾上腺素和多巴胺的遗传和药理学操作可以导致重复行为的短暂增加(22)，干预并不局限于特定的电路，在多个脑区观察到相关的电生理变化。我们的视觉遗传系统允许激活特定的皮质-纹状体回路，并将激活的细胞类型定义为皮质谷氨酸能投射神经元。
我们的体内电生理数据表明，建立重复行为的机制是基于电路的。重复的过度刺激导致光诱发放电的显著渐进性增加，与梳理的增加平行，这表明OFC-VMS突触在连续几天内形成的可塑性。我们推测，短暂的光诱导活动会导致OFC-VMS突触的长期变化，从而在随后的刺激中降低激活阈值。反过来，OFC-VMS突触活动增加可能通过CSTC电路传递信息(23-25)并导致多个下游事件，最终加强重复行为，包括（i）丘脑和前额叶皮层等下游结构的可塑性(26)（ii）腹侧被盖区介导的动机显著性增强(22). 这种机制与观察到的氟西汀效应一致，因为选择性SRI已被证明可以减少初级奖赏处理(27,28).
强迫症是一种异质性疾病。因此，我们的研究可能与特定强迫症亚型有更大的相关性。例如，强迫症的维度模型已经被提出，其中不同类型的强迫症和强迫与不同的回路相关联(29,30). 由于我们的研究结果表明，OFC-VMS投射的重复刺激会导致重复梳理的特异性诱导，因此我们的模型可能对有主要污染问题的强迫症患者特别重要。
我们的发现为精神病理学的发展提供了新的见解。每天仅5分钟的刺激就足以导致持续的显著行为效应。这增加了包括强迫症强迫在内的病理变化可能是由微小但反复发作的异常神经元活动引起的，也为以重复行为为特征的疾病的新治疗方法或现有治疗方法的改进提供了建议。例如，我们的数据与最近的临床研究一致，这些研究证明了腹囊-腹侧纹状体深部脑刺激对强迫症的疗效(31,32)这被认为是通过抑制OFC多动而起作用的。光化学方法可用于剖析深部脑刺激和其他治疗的电路机制，目的是确定新的治疗靶点。
