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分子细胞。作者手稿；PMC 2014年3月9日提供。
以最终编辑形式发布为：
分子细胞。2007年8月3日；27(3): 380–392.
数字对象标识：2016年10月10日/j.molcel.2007.05.041
预防性维修识别码：项目经理3947890
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院126328
PMID：17679089

转录因子的层次网络控制雄激素受体依赖性前列腺癌的生长

王千本,1 魏丽,2 X.刘雪莉,2 杰森·卡罗尔,1 奥利·A·Jänne,三 埃里卡·克拉斯尼卡斯·基顿,1 Arul M.钦奈扬,4,6 肯尼思·皮恩塔,5,6和迈尔斯·布朗1,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

雄激素受体（AR）是一种配体依赖性转录因子，在前列腺癌中起关键作用。对AR的性质知之甚少顺式-人类基因组中的调控位点。我们通过结合染色质免疫沉淀（ChIP）和拼接寡核苷酸微阵列，在人类前列腺癌细胞的两条染色体上定位AR结合区域。我们发现大多数AR结合区域都含有非经典的AR反应元件（ARE）。重要的是，我们将非标准ARE标识为顺式-AR行动的监管目标TMPRSS2型，在大多数前列腺癌中与ETS转录因子融合的基因。此外，通过丰富的DNA-结合基序的存在，我们发现其他转录因子包括GATA2和Oct1在介导雄激素反应中起协同作用。这些协同因子与AR一起形成了一个调控层级，调控雄激素依赖性基因的表达和前列腺癌的生长，并为治疗干预提供了潜在的新机会。

简介

雄激素受体（AR）在正常前列腺的生长和维持以及前列腺癌的发病和进展中起着关键作用(Heinlein和Chang，2004年). AR是一种配体依赖性转录因子，属于核激素受体（NR）超家族(Mangelsdorf等人，1995年). NRs通过招募一些非DNA结合的协同调节因子（包括辅活化因子和辅抑制因子）来调节转录顺式-靶基因的调控区域。尽管NRs共享共同的协同调节复合物，但每个受体（如AR及其协同调节因子）与真正染色质靶标的时间、空间和功能结合模式是不同的。先前的染色质免疫沉淀（ChIP）研究主要关注AR对单个靶基因前列腺特异性抗原（PSA）的调节，PSA通常用于前列腺癌诊断和监测治疗反应(Balk等人，2003年). 在雄激素存在的情况下，AR及其辅激活物随着时间的推移逐渐与PSA调节区结合，主要作用于PSA增强子。在增强子占据后，AR辅激活子复合体通过染色体环和RNA聚合酶II（Pol II）追踪与PSA启动子通信(Jia等人，2004年;Louie等人，2003年;Wang等人，2005年). 相比之下，抗雄激素促进AR和辅升压因子主要向PSA启动子募集(Kang等人，2004年;Shang等人，2002年).

尽管PSA调节区上AR转录复合物负载的动力学特征良好，但很少有其他AR顺式-对基因组中的调控位点进行了详细分析。此外，虽然在描述AR协调剂在雄激素依赖性基因调节中的作用方面已经取得了相当大的进展，但对于其他可能与AR协同调节雄激素反应的DNA-结合转录因子的作用，人们知之甚少。解决这些问题对于阐明雄激素刺激前列腺癌生长的机制、理解所谓的“雄激素依赖性”前列腺癌以及确定新的治疗靶点至关重要。例如，雄激素调节基因TMPRSS2型最近有报道与致癌基因融合电子邮箱或ETV1型（或其他电动滑行系统转录因子）并介导80%前列腺肿瘤中ERG或ETV1的雄激素反应性过表达(Tomlins等人，2005年). 然而，AR和其他潜在合作因素如何调节TMPRSS2型或者TMPRSS2-ETS系统融合基因尚不清楚。

ChIP结合拼接DNA寡核苷酸微阵列分析（ChIP-on-ChIP）最近发展成为一种无偏见的技术，用于绘制基因组中转录因子的体内结合位点(Carroll等人，2005年,2006). 在这里，我们使用这种方法在前列腺癌细胞系的21号和22号染色体上绘制AR结合位点。我们在21号和22号染色体上鉴定了90个AR结合位点。有趣的是，大多数这些网站都包含非经典ARE。重要的是，我们确定了一个非经典ARE作为TMPRSS2编码区上游AR结合的未知位点，它作为雄激素刺激的增强子并调节TMPRSS2型和TMPRSS2-ETS系统融合基因。我们进一步发现三个转录因子DNA识别基序在AR结合区内显著富集。通过将ChIP-on-ChIP数据与前列腺癌基因表达谱相结合，我们发现三种特定转录因子，即FoxA1、GATA2和Oct1，识别ChIP-on-ChIP发现的基序。最后，我们证明GATA2和Oct1与AR一起形成一个调控层次，控制雄激素介导的转录和前列腺癌细胞生长。

结果

21号和22号染色体上90个AR结合位点的鉴定

我们对表达内源性AR蛋白的前列腺癌细胞系LNCaP进行了AR ChIP-on-ChIP分析(Horoszewicz等人，1980年). 因为雄激素暴露后PSA调节区AR的占有率逐渐增加，并在16小时达到峰值(Jia等人，2004年;Louie等人，2003年;Wang等人，2005年)，我们用生理雄激素5α-二氢睾酮（DHT）饱和水平处理LNCaP细胞一段短暂（1小时）或延长（16小时）的时间，并用抗AR抗体进行ChIP。扩增、标记富含ChIP的AR相关DNA，并将其与覆盖人类21号和22号染色体整个非重复区域的Affymetrix-tiled寡核苷酸微阵列杂交(Carroll等人，2005年). 通过使用广义Mann-Whitney U检验的分析来鉴定富集AR结合的基因组区域（参见补充数据中的补充实验程序在线阅读本文）。根据严格的阈值（p值<1E-05），我们在21号和22号染色体上鉴定了90个AR结合位点(图1). 然后我们进行定量抗AR ChIP，然后进行实时PCR，以验证这些位点的子集，包括随机选择的大多数位点。PSA增强子区域（第19号染色体）用作阳性对照(Wang等人，2005年)XBP-1启动子区（22号染色体）作为阴性对照(Carroll等人，2005年). 雄激素诱导AR结合在所有29个受试结合区显著增加（≥5倍）(图2A). 此外，实时PCR测定的折叠富集度与ChIP-on-ChIP p值高度相关（DHT 1 hr r=0.83，p值9.51E-08；DHT 16 hr r=0.77，p值2.92E-06），表明所鉴定的AR结合位点很少为假阳性。有趣的是，长时间雄激素暴露后，大多数AR结合位点上AR的占有率增加，这概括了我们为PSA公司基因(Wang等人，2005年).

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人类21号和22号染色体AR结合位点图谱

RefSeq基因以暗条显示，AR结合区以蓝色条显示。指出了进一步详细分析的十个结合区域。

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21号和22号染色体AR结合位点的特征

（A） 对各种潜在AR结合区域AR招募的标准ChIP分析。用100 nM DHT处理LNCaP细胞1或16小时。用抗AR抗体进行ChIP分析。使用引物通过实时PCR定量免疫沉淀DNA(表S1)跨越各种潜在AR结合区域。

（B和C）DHT浓度对AR与染色质结合和细胞增殖的影响。（B） 用1、10或100 nM DHT处理雄激素缺失的LNCaP细胞1小时。用抗AR抗体进行ChIP分析，并使用跨越PSA增强子和B39位点的引物用实时PCR测定DNA沉淀物。（C） LNCaP细胞在激素缺失培养基中培养3天，然后用0.1到1000 nM的载体或DHT再处理3天。使用WST-1分析测定细胞增殖。

（D） 不同潜在AR结合区域Pol II招募的标准ChIP分析。使用抗Pol II抗体进行ChIP分析。

（E） AR结合位点和21号染色体和22号染色体基因组背景中AR结合基序类型的分布。

（F） AR结合区起增强子的作用。将10个选择的AR结合区、带有缺失ARE的突变AR结合区（B21和B39）和FKBP5增强子亚克隆到pGL3-启动子载体中，并转染到雄激素缺失的LNCaP细胞中。使用空的pGL3启动子载体作为阴性对照。用100 nM DHT或载体刺激细胞24小时。数据表示为两到三个重复（A）-（D）和（F）的平均±SE。

为了确定AR募集的剂量反应，我们在一系列DHT浓度范围内对PSA增强子和新发现的B39位点进行了AR ChIP定向。我们发现AR招募在1到100 nM DHT（ChIP-on-ChIP使用的饱和水平）之间变化不大(图2B). 此外，与之前的报告一致(Lin等人，1998年)我们发现，虽然10 nM DHT是刺激LNCaP细胞增殖的最佳浓度，但高达1000 nM的浓度可诱导显著的细胞生长(图2C).

选定的AR结合位点发挥转录作用

我们和其他人以前发现，RNA Pol II与PSA增强子和启动子的AR结合区域相关，这对PSA转录至关重要(Louie等人，2003年;Shang等人，2002年;Wang等人，2005年). 为了解决Pol II是否被招募到21号和22号染色体上的AR结合位点，我们对几个AR结合位点进行了Pol II ChIP。有趣的是，Pol II以雄激素依赖的方式（≥3倍）被显著招募到50%的结合位点(图2D)支持大量结合位点发挥转录调控作用的断言。我们进一步对七种脊椎动物（黑猩猩、狗、小鼠、大鼠、鸡、河豚和斑马鱼）的基因组之间的90个AR结合位点进行了比较基因组分析。结果显示AR结合位点的中心具有很强的保守性(图S1)与选择存活下来的非编码序列在基因调控中发挥重要作用的概念一致(哈迪逊，2000).

大多数AR结合位点远离雄激素调节基因的启动子

为了将AR结合与雄激素依赖性基因表达相关联，我们使用表达微阵列检测了LNCaP细胞对DHT的反应中的基因表达谱。LNCaP细胞被剥夺激素72小时，然后用载体或DHT处理4和16小时。提取总RNA，然后与Affymetrix U133+2.0表达阵列杂交。我们在21号和22号染色体上发现62个转录物，它们对雄激素的反应不同(表S2). 与以往研究一致(Nelson等人，2002年;Velasco等人，2004年)，我们发现只有少数转录物在21号和22号染色体上的表达受到雄激素的高度影响。为了避免对这少数高度差异表达的基因产生偏见，我们纳入了差异表达至少1.1倍的所有转录本。五个选定基因的实时RT-PCR验证和PSA公司作为阳性对照证实了表达阵列的结果(图S2). 有趣的是，在21号和22号染色体上，大多数AR结合位点远离雄激素调节基因的转录起始位点（>10kb）(表S3). 总的来说，在LNCaP细胞中，90个结合位点中只有34个（38%）位于雄激素调节的基因转录起始位点的500 kb范围内。

非规范AR反应元件介导AR依赖性转录

接下来，我们对90个AR结合区进行了DNA结合基序搜索。令人惊讶的是，我们发现，尽管78%的结合区域包含AR结合半位点基序TGTTCT，但当我们允许最多两个位置以3 nt间距与回文一致时，只有10%的结合区域具有典型的I NR类（AGAACannTGTTCT）结合基序（有关详细信息，请参阅补充实验程序) (Verrijdt等人，2003年) (图2E和表S4). 在90个结合位点中，68%有一个或多个非经典ARE，包括隔离的ARE半位点、头对头ARE（AGACA[0-8n]TGTTCT，n≠3）、尾对尾ARE（TGTTCT[0-8n]AGACA）和ARE直接重复序列（AGACA[0-8 n]AGAACA）(表S4和中的“序列分析”补充实验程序).

为了进一步研究含有非经典ARE的AR结合区是否可以作为增强子发挥作用，我们亚克隆了10个AR结合位点和最近表征的雄激素调节基因增强子FKBP5型(Magee等人，2006年)作为阳性对照，pGL3荧光素酶载体中SV40启动子上游。仅带有最小SV40启动子的pGL3荧光素酶载体作为阴性对照。将这些构建物转染到雄激素缺失的LNCaP细胞中，并在单独使用载体或存在饱和浓度DHT的情况下治疗24小时后测量荧光素酶活性。如所示图2F，所有测试的AR结合区都显示出增强子活性（≥2倍），具有不同程度的雄激素依赖性，与FKBP5增强子的活性相当。为了证实AR结合位点的增强子特征需要ARE，我们删除了B21中的经典ARE和B39增强子结构中的非经典ARE，并将这些突变载体转染到LNCaP细胞中。正如预期的那样，B21中单个典型ARE的删除完全取消了其增强子活性(图2F). 更重要的是，从B39中删除单个非经典（头对头，8 nt间距）ARE也完全消除了增强子活性，从而证明AR结合区内的非经典ARE是其增强子功能所必需的(图2F).

TMPRSS2调节区的特征

如上所述，大多数前列腺癌最近都被证明是TMPRSS2:ERG公司或TMPRSS2:ETV1型融合(Tomlins等人，2005年). 然而TMPRSS2型基因或TMPRSS2-ETS系统融合受AR调节尚不清楚。使用定量ChIP，我们确认AR与B39位点结合，B39位点位于TMPRSS2型mRNA起始位点均位于LNCaP细胞中，该细胞没有重排TMPRSS2型基因(图2A)以及包含TMPRSS2:ERG公司聚变(图3A). 为了测试这个AR结合位点是否起到AR依赖增强子的作用并与TMPRSS2启动子通信，我们进行了一个C类hIP公司c（c）与…结合c（c）染色体c（c）信息c（c）apture（5C）分析以检测体内的环状染色质结构(Wang等人，2005年). 用载体或雄激素刺激激素缺失细胞。固定染色质用EcoRI消化，然后进行抗AR ChIP和结扎。在逆转交联后，使用TMPRSS2增强子中的一个引物和启动子区域的一个引物对等量的洗脱DNA进行PCR扩增。如所示图3B，特异PCR产物仅在连接酶存在下形成，并通过雄激素刺激显著增强，而输入染色质水平的对照PCR在所有条件下都是等效的(图3B). 对383 bp PCR扩增带进行测序，以确认其确实代表TMPRSS2增强子和启动子正确连接的产物。这一结果表明TMPRSS2增强子与体内的启动子非常接近。作为阴性对照，通过5C测试PSA增强子与TMPRSS2启动子以及TMPRSS2增强子与PSA启动子的相互作用。在这两种情况下都没有形成特定的PCR产物（数据未显示），支持TMPRSS2增强子和启动子之间形成的5C产物的特异性。此外，TMPRSS2转录起始位点上游9 kb的控制区包含两个未发现与AR结合的推测AR反应元件（ARE）基序，该控制区未通过5C与TMPRSS1启动子接触(图S3). 有趣的是，TMPRSS2（B38）下游462 kb的AR结合位点也未能与TMPRS2启动子形成环(图3B). 该结果作为另一个负控制，与TMPRSS2-ETS融合中保留的TMPRSS2上游区域而非下游区域拥有重要功能元件的结论一致。这些数据表明，-13.5kb的AR结合位点与TMPRSS2启动子区特异性相互作用，支持在该上游增强子和近端启动子之间形成染色体环。该上游TMPRSS2增强子的鉴定也为TMPRSS2-ETS因子融合如何以雄激素依赖性方式驱动表达提供了分子解释。有趣的是，由TMPRSS2和ETS转录因子ETV4融合而产生的一个新发现的前列腺癌癌基因不包括任何TMPRSS1编码外显子，因为断点位于mRNA起始位点上游约8 kb，而该新发现的TMPRS2增强子下游约5.5 kb(Tomlins等人，2006年)，表明该增强子在这种情况下驱动ETV4表达。

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TMPRSS2调节区特征

（A） VCaP细胞中PSA和B39上AR占用率的ChIP分析。VCaP细胞（一种表达TMPRSS2:ERG公司融合基因）用100nM DHT处理1小时。用抗AR抗体进行ChIP测定。

（B） TMPRSS2增强子和启动子之间的空间通信。使用来自载体或DHT处理的LNCaP细胞的固定或EcoRI或BtgI消化染色质进行5C。底漆(表S1)在–13.5 kb或462 kb AR结合区和–700 bp启动子区的两侧，用PCR扩增连接后的DNA。在限制性内切酶消化之前，使用染色质进行对照PCR。

（C） TMPRSS2 14 kb上游监管区域示意图。显示了潜在的五个ARE簇和十四个1kb片段。

（D） 五个潜在ARE地区AR招募的ChIP分析。使用载体或100 nM DHT处理4或16小时的LNCaP细胞中的抗AR抗体进行ChIP分析。

（E） TMPRSS2 14 kb上游调控区内增强子元件的系统映射。将14个1 kb TMPRSS2上游序列亚克隆到pGL3-启动子载体并转染到LNCaP细胞。用载体或100 nM DHT处理细胞24小时。数据表示为两到三个重复（A）、（D）和（E）的平均±SE。

虽然我们发现–13.5 kb B39结合位点在TMPRSS2型基因是一种功能性雄激素调节增强子(图2F)并且在体内与TMPRSS2启动子非常接近(图3B)，我们研究了位于-13.5 kb和转录起始位点之间的其他重要功能AR结合位点可能被ChIP-on-ChIP分析遗漏的可能性。因此，我们在TMPRSS2型基因并发现五组潜在ARE(图3C). 尽管存在ARE，定量AR ChIP分析发现只有与ARE区域V的显著AR结合与ChIP-on-ChIP（-13.5 kb）识别的区域完全对应(图3D). 此外，为了进一步研究14kb上游序列中的其他区域是否可能发挥转录作用，我们系统地亚克隆了14个1kb区域(图3C)pGL3荧光素酶载体中SV40启动子的上游，并将其转染到雄激素缺失的LNCaP细胞中。如所示图3E与B39元素相对应的结构体A（-14至-13 kb）具有最显著的增强子活性。此外，含有TMPRSS2启动子的构建体N（-1 kb至+24bp）在该报告基因测定中也显示出弱的增强子活性。值得注意的是，定量AR ChIP表明AR仅弱招募到内源性TMPRSS2启动子区域。因此，B39结合位点是AR结合和功能增强活性的主要位点，位于TMPRSS2型基因。当然，我们不能排除其他顺式-14kb区域以外的调控区域(图S4)也可能在TMPRSS2的表达中发挥作用。

AR协同转录因子复合物的鉴定

我们假设其他转录因子可能在AR功能中发挥重要的协同作用。为了寻找这些AR伴侣，我们在TRANSFAC数据库中绘制了所有哺乳动物转录因子基序(Matys等人，2003年)与染色体21和22的基因组背景相比，90个AR结合区的基序显著丰富。虽然AR半位点仅适度富集（1.55倍，p值3.00E-3），但AR半位点基序与三个DNA基序（Forkhead、GATA和Oct）中的每一个基序同时出现，与基因组背景相比显著富集（AR半位点+Forkheat，5.33倍，p价值1.63E-08；AR半衰期+GATA，3.19倍，p值1.16E-04；AR半衰期+10月，2.03倍，p值3.09E-05）(图4A). 这些关联强烈表明AR和序列特异性DNA结合转录因子之间存在功能性相互作用，这些转录因子识别这些基序中的每一个。

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协同转录因子被招募到AR结合区

（A） AR结合区域内AR半位点和转录因子基序关联的示意图。每个成对关联由不同颜色的圆圈指定。圆圈的面积与关联的频率成正比。

（B） 向AR结合区域招募合作因素。LNCaP细胞在激素缺失培养基中培养3天，然后用载体或DHT处理1和16小时。然后用指示的抗体或对照IgG进行ChIP分析。使用横跨PSA增强子和染色体21和22上九个AR结合区的引物，通过实时PCR检测DNA沉淀物。结果显示为两到三个重复±SE的平均值。还显示了are、Forkhead、GATA和Oct基序在每个区域的出现情况。

鉴于这三个显著富集的DNA基序，我们面临的问题是，在大量可能结合基序的转录因子中，哪一个实际上发挥了功能作用。为了对哪些因素可能起作用产生假说，我们从Oncomine数据库中的几个人类前列腺癌研究中搜索了基因表达谱(Rhodes等人，2004年)并发现三种转录因子FoxA1、GATA2和Oct1在前列腺癌中的高表达具有潜在的意义。已证明FoxA1和GATA2是雄激素诱导的PSA公司报告基因检测中的基因转录(Gao等人，2003年;Perez-Stable等人，2000年). 此外，已知FoxA1和Oct1与体内AR相互作用(Gao等人，2003年;冈萨雷斯和罗宾斯，2001年). 为了检查这三个协同转录因子是否真的被招募到21号和22号染色体上的AR结合区域，我们使用针对这三个因子或IgG（对照）的抗体进行了定量ChIP分析使用跨越10个经验证的AR结合区的引物和特征良好的PSA增强子作为对照。如所示图4B，三个协同因子被招募（≥2倍）到80%的AR结合位点。在没有雄激素的情况下，观察到三种因子中的每一种与AR结合区的显著结合，而雄激素确实增加了特定位点的特异性因子结合。这些结果表明，AR和三种潜在协同转录因子中每一种的各种组合被招募到基因组的特定区域。考虑到雄激素的复杂转录反应，毫不奇怪，在这些位点上，因子占用和雄激素依赖的程度有很大差异。

为了探索AR与三种转录因子的物理联系，我们首先在体内进行内源性蛋白的联合免疫沉淀。从DHT处理或未处理的LNCaP细胞中免疫沉淀三种转录因子，然后用抗AR抗体进行western blot检测。如所示图5A，AR以激素依赖的方式与GATA2和Oct1相互作用，但其与FoxA1的相互作用不受雄激素的影响。为了研究AR是否与所有三种转录因子形成单一复合物，我们从LNCaP细胞免疫沉淀GATA2，然后用抗Oct1抗体进行免疫印迹。结果表明，GATA2与Oct1没有相互作用（数据未显示），表明AR可能与每个协同因子形成独立的复合体。

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AR在体内与协同转录因子相互作用

（A） AR协同免疫受体及其协同因子在体内的表达。LNCaP细胞在DHT存在或不存在的情况下培养24小时。用指示抗体或对照IgG免疫沉淀（IP）全细胞裂解物。用所示抗体进行Western blot（WB）。

（B） 染色质上形成AR协同因子复合物。用或不用DHT处理LNCaP细胞16小时。用抗AR抗体进行ChIP分析。洗脱免疫沉淀的染色质，用指示的抗体或对照IgG再次免疫沉淀，并使用PSA和B38增强子区域两侧的引物通过PCR扩增。

（C和D）Colocalized顺式-活性元素是AR依赖性转录所必需的。将PSA增强子或启动子区域（C）或B39报告子野生型构建物和带有缺失GATA或Oct基序的野生型PSA报告子构建物以及带有GATA或O ct基序缺失的B39报告分子（D）转染到经载体或100 nM DHT处理24小时的LNCaP细胞中。测定了荧光素酶活性，结果显示为三次试验的平均值±SE。

为了证明AR和三种转录因子在染色质上形成复合物，我们进行了系列ChIP实验（re-ChIP）。首先用抗AR抗体免疫沉淀交联染色质，然后用控制性IgG或针对三种转录因子的抗体重新沉淀。在re-ChIP后，PSA增强子和B38区域以配体依赖的方式富集(图5B)证明AR可以与FoxA1、GATA2或Oct1一起作用于染色质。

虽然上述ChIP、共免疫沉淀和re-ChIP分析证明了AR和潜在协同转录因子之间的蛋白-蛋白质相互作用，但尚不清楚这些相互作用是否基于共定位的相互作用顺式-带有AR结合区的活性基序。为了解决这个问题，我们在荧光素酶基因上游全长6 kb PSA调节区内的PSA增强子中生成了GATA和Oct-基序缺失突变体。作为对照，我们还在PSA启动子区域生成了一个Oct-motify缺失突变。我们将这些突变结构和野生型PSA结构瞬时转染到激素缺失的LNCaP细胞中，并在24小时DHT刺激后测量荧光素酶。与之前的报告一致(Perez-Stable等人，2000年)，PSA增强子区域内GATA基序的缺失显著降低了雄激素刺激的转录活性(图5C). 有趣的是，PSA增强子而非启动子区域中Oct-基序的缺失也显著减弱雄激素诱导的转录活性(图5C). 这些数据表明同位化的顺式-PSA增强子区域内的活性元素。值得注意的是，TMPRSS2增强子的活性还需要Oct和GATA基序(图5D).

AR协同转录因子调节AR介导的转录和前列腺癌细胞生长

为了解决这三种协同转录因子在介导AR依赖性转录中的功能作用，我们通过RNA干扰降低了这三种因子的表达水平(图6A). 然后我们研究了沉默这三个因子对两个先前报道的雄激素调节基因的雄激素刺激表达的影响PSA公司和TMPRSS2型我们将靶向三种因子中的每一种的siRNA瞬时转染到LNCaP细胞中。转染48小时后，用DHT（1或100 nM）处理细胞4或16小时。然后进行定量RT-PCR以测量雄激素调节的mRNA水平。如所示图6BGATA2或Oct1水平的降低在16小时显著降低PSA，在4小时显著降低TMPRSS2 mRNA的表达，而不改变对照GADPH的表达水平。有趣的是，TMPRSS2表达在16小时后恢复到控制水平，表明存在基因特异性旁路途径。相反，FoxA1沉默对这两个基因的表达没有影响(图6B). 虽然这一结果可能表明FoxA1在雄激素信号传导中不起关键作用，但也有可能FoxA1功能仅对AR靶点的子集是必需的，或者与另一个Forkhead家族成员是冗余的。

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协同转录因子在介导AR-依赖性转录中的功能分析PSA公司和TMPRSS2型基因

（A） RNAi抑制AR协同因子水平。用靶向每个因子的siRNA和对照siRNA转染LNCaP细胞。转染后48小时，用或不用100 nM DHT处理细胞16小时，并用所示抗体进行免疫印迹。

（B） siRNA对PSA公司,TMPRSS2型、和GADPH公司基因表达。siRNA转染48小时后，用或不用1或100 nM DHT处理细胞4和16小时。使用转录特异性引物通过实时RT-PCR分离和扩增总RNA(表S1). 在4小时时测量非阳性对照。

（C） 沉默GATA2和Oct1对AR、Pol II、Oct1和GATA2向PSA和TMPRSS2增强子募集的影响。在载体或4小时100 nM DHT处理siLuc、siGATA2或siOct1转染细胞后，进行AR、Pol II、Oct1和GATA2 ChIP。两到三个独立实验的平均值±SE的图形表示如（B）和（C）所示。

为了探讨GATA2和Oct1对PSA和TMPRSS2表达的作用机制，我们进行了ChIP分析，以研究GATA2及Oct1沉默对PSA及TMPRSS1增强子AR和Pol II募集的影响。用siGATA2、siOct1或对照siLuc瞬时转染LNCaP细胞；培养48小时；然后用100 nM DHT刺激4小时。如所示图6C与siLuc对照组相比，si-GATA2转染细胞中AR和Pol II向PSA和TMPRSS2增强子的募集显著减少，无论是在缺乏配体的情况下，还是在更大程度上，在存在激素的情况下。相反，Oct1的沉默不影响AR结合，但在缺乏或存在激素的情况下，大大降低了PSA和TMPRSS2增强子上Pol II的负载(图6C). 有趣的是，当GATA2沉默时，PSA和TMPRSS2增强子的Oct1招募也同样减弱，而与这些增强子结合的GATA2不受Oct1沉默的影响(图6C). Western blot分析表明，沉默GATA2和Oct1对AR或Pol II表达水平没有明显影响(图6A). 这表明GATA2和Oct1在AR和/或Pol II向染色质的基础招募以及雄激素刺激后的招募中都发挥了必要的作用。更有趣的是，这些数据表明，GATA2和Oct1在AR信号传递中起着不同的作用，而GATA2在Oct1招募的上游起作用。

为了将这些发现扩展到一个以前未知的雄激素调节基因，我们分析了GATA2、Oct1和FoxA1在PDE9A型基因。PDE9A型是环核苷酸磷酸二酯酶（PDE）家族的成员，在调节细胞内环核苷酸浓度方面起关键作用，在前列腺中高度表达(Fisher等人，1998年;Guipponi等人，1998年). 我们的ChIP-on-ChIP分析确定了两个内含子AR结合位点（B40和B41），分别位于PDE9A转录起始位点下游18.4kb和77.8kb(图7A). 此外，我们的基因表达研究确定PDE9A型在LNCaP细胞中雄激素显著上调的基因(表S2和图S2). 与我们的调查结果类似PSA公司和TMPRSS2型基因，我们发现GATA2和Oct1，而不是FoxA1，在AR介导中发挥必要的协作和等级作用PDE9A型基因表达(图7B和7C).

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协同转录因子在介导PDE9A型基因转录与前列腺癌细胞增殖

（A） AR结合位点相对于PDE9A型基因。黑色方块代表AR结合位点。这个PDE9A型基因显示为5′-3′方向，蓝色箭头表示基因的方向（6月5日，加州大学圣克鲁斯分校[UCSC]，已知基因）。

（B） FoxA1、GATA2和Oct1沉默对PDE9A mRNA表达的影响。进行siRNA RTPCR分析，如图6B.

（C） 沉默GATA2和Oct1对PDE9A增强子AR、Pol II、Oct1和GATA2募集的影响。siRNA-ChIP分析按照图6C.

（D） AR和辅因子沉默对雄激素刺激的细胞周期进入的影响。siRNA转染48小时后，用或不用1或10 nM DHT处理细胞24小时。然后固定细胞，用碘化丙啶染色，并用流式细胞术进行分析。数值表示两到三个独立实验（B）到（D）的平均值±SE。

因为AR对前列腺癌细胞的生长至关重要(Heinlein和Chang，2004年)先前的研究表明AR沉默抑制前列腺癌细胞增殖(Wright等人，2003年;Zegarra-Moro等人，2002年)接下来，我们测试了单独或联合沉默协同转录因子对细胞周期进程的影响。siRNA转染48小时后，用或不用1或10 nM DHT处理LNCaP细胞24小时。然后用碘化丙啶对细胞进行DNA含量染色。单独或联合沉默GATA2和Oct1可显著降低雄激素诱导的细胞周期进程，其程度与沉默AR本身相同(图7D). 为了控制潜在的非靶向效应，用一组独立的siRNAs沉默GATA2和Oct1也抑制雄激素依赖性细胞周期进展(图S5). 此外，对GATA2和Oct1沉默的反应是特异性的，因为它们的沉默对HeLa细胞的细胞周期进程没有影响(图S6). 有趣的是，与它在雄激素刺激基因表达中的非本质作用相一致，FoxA1（一种染色质“先驱”因子）的沉默(Cirillo等人，2002年)，不影响雄激素刺激的细胞周期进展(图S7). 因此，GATA2和Oct-1（而非FoxA1）在前列腺癌细胞雄激素刺激的细胞周期进展中发挥着重要作用。

讨论

而以前的ChIP研究提供了与AR转录复合物组装有关的有用信息(Jia等人，2004年;Louie等人，2003年;Kang等人，2004年;Shang等人，2002年;Wang等人，2005年)，数据主要限于PSA公司基因。在这项研究中，我们使用芯片上的ChIP绘制了21号和22号染色体上90个以前未知的AR结合位点。由于21号和22号染色体约占整个非复制人类基因组的2%，这些结果预测了整个人类基因组约4500个AR结合位点。

有趣的是，在21号和22号染色体上发现的大多数结合位点远离雄激素调节基因。我们之前已经发现，大多数雌激素受体（ER）结合位点也远离雌激素调节基因，这与其作为增强子而非启动子的功能一致(Carroll等人，2005年,2006). 距离依赖性结合是否是NR作用的一般规律有待于其他NR的类似研究。虽然这些位点中的许多可能作为邻近基因的转录增强子，但也可能存在其他功能。此外，如前所述，在测试的特定实验条件下，LNCaP中可能只有一部分结合位点具有功能，并且可能在不同细胞类型和/或不同条件下发挥功能(van Steensel，2005年). 也有可能一些AR结合位点确实不起作用。最后，虽然一定比例的雄激素调节基因具有与该基因相关的AR结合位点，但在某些情况下，雄激素刺激的转录可能独立于AR与染色质的结合。

有趣的是，我们发现，21号和22号染色体上的大多数AR结合位点都含有非经典are，其中很大一部分被检测的AR结合位点可以作为AR依赖性增强子发挥作用，而非经典AREs是这种活性所必需的。尽管体外DNA-结合试验表明AR与典型ARE结合的亲和力最高(Kallio等人，1994年)，之前曾报道过少量非经典ARE，如ARE直接重复(Verrijdt等人，2003年). 在真正的染色质环境中，协作因子可能有助于AR与非规范ARE结合。我们对AR结合非典型模式优势的发现表明，在ChIP时代之前定义的转录因子结合基序需要重新修饰，因为使用ChIP-on-ChIP可以找到大量额外的结合位点。

与生化方法鉴定的NR协同调节因子相反(麦肯纳和奥马利，2002年;佩里西和罗森菲尔德，2005年)，我们使用了一种系统方法，将不同的数据类型结合起来，结合染色体尺度的ChIP-on-ChIP分析和基因表达谱分析，以识别AR协同转录因子网络。我们的数据表明AR和这些转录因子之间存在物理相互作用，并且合作伙伴在雄激素依赖性基因转录和细胞增殖中具有不同的功能作用。有趣的是，我们发现GATA2和Oct1分级调节雄激素依赖性转录。先前的研究发现，其他GATA家族成员可以通过保守的锌指基序打开致密染色质(Boyes等人，1998年;Cirillo等人，2002年). 鉴于我们的发现，GATA2是AR结合所必需的，在这种情况下，它可能作为改变染色质以允许AR结合的先驱因子发挥类似的作用。相反，AR不需要Oct1来结合PSA、TMPRSS2和PDE9A增强子，这表明它在GATA2作用后的一个步骤中发挥作用，并与AR结合。与GATA2和Oct1在雄激素靶基因表达中的作用一致，沉默这两种协同转录因子显著降低雄激素诱导的细胞周期进程。据报道，在其他系统中，GATA2和Oct1通过包括p53依赖性途径在内的机制促进细胞增殖(蔡和奥金，1997年)和组蛋白H2B转录在Oct1中的激活(尤恩，2000年).

有大量证据表明AR在早期激素依赖性前列腺癌和所谓的晚期雄激素依赖性前列腺癌中都起着关键作用(Debes和Tindall，2004年)其中AR可以放大。真实AR的说明顺式-调节元件允许理解关键的雄激素刺激靶点如TMPRSS2-ETS融合是如何被调节的。最后，关键AR协同转录因子的鉴定为治疗干预提供了潜在的新靶点。

实验程序

芯片芯片分析

如前所述，使用抗AR抗体（N20，Santa Cruz Biotechnology，CA）进行ChIP(Wang等人，2005年)但用100μg/ml酵母tRNA代替2μg鲑鱼精子DNA作为阻断剂。如前所述进行连接介导PCR和标记(Carroll等人，2005年). 使用的微阵列为Affymetrix基因芯片染色体21/22拼接组P/N 900545。进行生物三联试验。芯片上的ChIP原始数据可访问http://chip.dfci.harvard.edu/~wli/雄激素。受体。ChIP2公司/。有关ChIP-on-ChIP数据和序列分析的详细信息，请参阅补充实验程序.

ChIP和Re-ChIP

如前所述执行ChIP和re-ChIP(Shang等人，2000年;Wang等人，2005年). 有关详细信息，请参阅补充实验程序.

细胞增殖试验

使用WST-1试剂盒（印第安纳波利斯罗氏）测量细胞增殖。

表达式数组实验

在没有或存在100 nM DHT的情况下培养激素缺失的LNCaP细胞4小时和16小时。使用RNeasy试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）分离总RNA。来自三个生物复制品的总RNA在Dana-Farber癌症研究所微阵列核心设施与人类U133+2.0表达阵列杂交。使用dChip微阵列软件对数据进行分析(Li和Wong，2001年).

ChIP联合染色体构象捕获分析

如前所述执行5C(Wang等人，2005年). 使用的引物列于表S1PCR扩增带经序列验证。

质粒的构建

从LNCaP基因组DNA中扩增AR结合位点。从BAC RP11-814F13中扩增出14个1 kb TMPRSS2上游序列。将这些PCR产物亚克隆到pGL3-启动子载体（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。ARE、GATA和Oct-基序缺失突变体经过序列验证。PCR引物列于表S1.

报告基因检测试剂盒

使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA）转染激素缺失的LNCaP细胞。有关详细信息，请参阅补充实验程序.

免疫共沉淀和Western印迹

如前所述进行免疫共沉淀和免疫印迹(Wang等人，2002年)进行了一些修改。有关详细信息，请参阅补充实验程序.

小干扰RNA

使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将小干扰RNA（siRNA）双工体转染到LNCaP细胞。siRNA转染48小时后，用DHT或载体处理细胞，然后收获。siRNA序列列于表S1.

实时RT-PCR

如前所述进行实时RT-PCR(Wang等人，2005年). RT-PCR底漆列于表S1.

流式细胞术

用DHT处理siRNA-转染的LNCaP细胞24小时。收集细胞并用碘化丙啶染色。DNA含量由Dana-Farber癌症研究所细胞测定核心设施进行分析。

补充材料

补充数据

单击此处查看。（520K，pdf格式）

致谢

这项工作得到了Claudia Adams Barr创新基础癌症研究项目（M.B.）、前列腺癌SPORE赠款P50 CA90381（M.B.和P50 CA69568（K.J.P.）、国防部奖W81XWH-05-01-0023（Q.W.）和欧盟合同LSHM-CT-2005-018652（O.A.J.）的支持。K.J.P.是美国癌症学会临床研究教授。作者还感谢Jéróme Eeckhoute博士和Kirsten Fertuck博士的有益讨论。

脚注

补充数据

补充数据包括补充实验程序、七张图和四张表，可在以下网站上找到http://www.molecule.org/cgi/content/full/27/3/380/DC1/.

接入号码

本研究中的微阵列数据保存在NCBI的基因表达总览（GEO，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)并可通过GEO系列登录号访问GSE7868标准.

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