犬血清铁浓度测定的影响因素：昼间变异与高铁蛋白血症

摘要

兽医测量血清铁浓度以评估运输血液中的铁元素。铁是氧气输送到是参与DNA合成和能量代谢的几种酶的辅因子[6]. 它被小肠中的食物吸收，释放到血浆中并与铁的载体蛋白转铁蛋白结合[6]. 在正常血清中，大多数铁以转铁蛋白结合的形式存在铁（TBI）；因此，血清铁通常表示为TBI。

溶血性贫血动物的血清铁浓度通常升高[7]，红细胞生成障碍[15]，铁过载[14]和糖皮质激素管理[8]. 血清铁浓度为缺铁量普遍减少[12]和炎症[三]. 然而，影响同伴动物血清铁浓度的测量尚不清楚。在人类医学中，普遍的观点是，早晨的血清铁水平高于下午或晚上[2]. 因此，人们认为为了准确评估血清铁浓度，采样时间应为考虑过的。

另一方面，铁蛋白，一种铁存储蛋白，已知存在于血清中；它是人类和狗的各种疾病增加，如肿瘤和炎症疾病[4,20].铁蛋白结合铁是血清中非转铁蛋白结合铁（NTBI）的一种形式据报道，在使用国际血液学标准化委员会[10]. 瓦塔纳贝等。报告称铁/蛋白质比率犬血清铁蛋白的含量为0.112±0.017[18]、和沃伍德等。在四名铁超载患者中报告了这一比率血清铁蛋白为0.023–0.067[21]. 因此，犬科动物血清铁蛋白被认为比人类结合更多的铁，因此可以预期犬血清铁蛋白对血清铁浓度测定的干扰会比人类高。

本研究的目的是检测昼夜变化和血清铁蛋白的影响关于血清铁浓度的研究，以便为提高犬的可靠性提供数据血清铁测定。

2-6岁健康雄性（n=2）和雌性（n=3）比格犬（平均体重9.0 kg）本研究中使用了（Crea Japan，Inc.，Tokyo，Japan）。这些狗被养在一个温度和光线控制的环境，并给予标准的实验室食品CD-5M（Crea Japan，Inc.），每天一次（上午9:00），免费供水。血迹是用一次性免烫5米我从颈静脉注射注射器（日本东京天目）静脉。采集时间为当天上午8:00、中午12:00、下午4:00和晚上8:00。样品为在室温下放置30分钟，然后离心（1560×克, 5min）分离血清进行实验室分析。保存获得的血清样本使用前，温度为−20°C。

22只不同血清铁蛋白浓度值的客户狗的血清样本本研究采用非随机抽样方法进行评价。这些狗参观了北濑户大学2010年至2012年，兽医教学医院小动物医疗中心。所有的狗兽医在手术切除后通过组织病理学检查确诊，或尸检、直接Coombs试验、细针抽吸活检和/或其他临床病理学检查考试。用该方法采集并保存临床病例的血清样本如上所述。所有狗主人都提供了书面知情同意书研究。

这两项研究均获得北大小动物委员会的批准（批准编号：13-090和13-091）。

如前所述，通过ICSH上的方法测量血清铁浓度[9,10]. 这个ICSH法是人体血清铁测定的参考方法[10,17]. 简单地说，血清铁是从其结合蛋白和铁（Fe³⁺)被还原为亚铁铁（Fe²⁺)使用含有2 M HCl、0.6 M三氯乙酸的混合酸试剂和0.3 M巯基乙酸，并在室温下放置30分钟。然后，它被离心9300×克10分钟后，上清液中的游离亚铁与亚铁嗪反应（单钠3-2-吡啶-5,6-双-4-苯磺酸酸-1,2,4-三嗪），这是一种色原，产生一种粉红色的亚铁色原复合物可以使用U-5100分光光度计（日立日本东京高科技公司），波长为562nm[16]. 铁标准溶液（100.5 mg/我)用于原子吸收光谱法为化学分析级，从关东化学公司获得（日本东京）。夹心酶联法测定血清铁蛋白浓度纯化兔抗犬心脏铁蛋白多克隆免疫吸附试验抗体，如我们之前的报告所述[1]. TIBC公司由2-亚硝基-5-(N个-丙基-N个-磺丙胺基）-苯酚SRL Inc.（日本东京）的（亚硝基-PSAP）方法。

通过添加5微升（包含7个µ纯化兔抗犬心脏铁蛋白多克隆抗体g抗体，在ELISA中使用相同的抗体[1]，至300微升犬只血清。在4°C下培养过夜后，铁蛋白被吸收用9300×离心法收集血清上清液克用于10min，然后测定上清液作为血清。我们发现血清铁蛋白铁蛋白免疫沉淀后浓度小于7.8n个克/米l中，这是ELISA的最低检测限[1]. 我们在和之前测量了血清铁浓度免疫沉淀后计算两个值之间的下降率。

通过重复测量分析血清铁、铁蛋白和TIBC浓度方差（ANOVA），当这显示出显著差异时，我们使用Bonferroni的修正。采用Pearson相关检验分析血清术后铁蛋白浓度和血清铁浓度下降率铁蛋白免疫沉淀。当第页-数值小于0.05。所有数据均采用统计学方法进行分析Excel软件（ystat 2008；Igaku Tosho Shuppan，日本东京）。

为了评估5只正常狗血清铁、TIBC和铁蛋白水平的日变化，我们在同一天上午8:00、12:00、4:00和8:00测量这些水平(图1). 所有狗的最高平均血清浓度（212.2µ克/天我)早上8:00发现，而下午4:00发现最低（139.2µ克/天我); 这些值非常显著不同(P（P）<0.05). 血清铁蛋白浓度和TIBC没有一天中的变化。这些结果表明，与人类相似，正常的狗也表现出早晨血清铁水平的日变化高于下午[2]. 排除多重因素的影响抽血事件中，我们在8:00测量了同一比格犬的血清铁浓度第二天上午和下午4:00，结果与本研究相似（未显示数据）。这意味着多次抽血没有标记对结果的影响。然而，血清铁日变化的详细机制浓度未知，但评估了骨髓中的增殖活性通过DNA合成和有丝分裂指数，以及血清促红细胞生成素，它在红细胞质量的维持也显示出日变化[11,19]. 在此外，据报道，hepcidin是一种铁调节激素，能调节细胞外铁浓度的动态平衡显示，在中午和晚上与早上相比[5]. 因此，由于红细胞生成可用铁的数量发生了变化白天可以观察到昼夜变化。在本研究中，我们没有对其进行评估。

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图1。

5只正常犬血清铁、TIBC和铁蛋白水平的日变化。个人显示了每个采样时间的平均值（开圆）*P（P）<0.05.

据报道，犬血清铁浓度的参考范围为33.0–147.0µ克/天我，但此报告未包含有关采样时间[6]. 人们认为它是需要考虑采样时间才能准确解释血清铁浓度在狗身上。据作者所知，这是第一份描述昼夜变化的报告狗的血清铁含量。在这项研究中，因为我们使用了正常的狗，所以我们没有评估铁代谢异常犬血清铁浓度的日变化（即缺铁、慢性病引起的贫血和铁超载）。进一步研究包括在这方面是必要的。

为了检测血清铁蛋白的影响，我们还测量了血清铁浓度不同血清值血清铁蛋白免疫沉淀前后临床病例中的铁蛋白浓度。从22只狗（11只雄性和11只雌性犬；平均体重±标准偏差为20.8±13.6 kg）。中的诊断这些狗包括血管肉瘤、自身免疫性溶血性贫血、组织细胞肉瘤、，淋巴瘤、血管瘤、肥大细胞瘤、肺腺癌、免疫介导的多关节炎和急性肺炎。这些狗的血清铁蛋白范围为754–12962n个克/米我(表1). 我们之前已经证实，术后血清TIBC值没有变化免疫沉淀处理（数据未显示）。两者之间存在正相关免疫沉淀后血清铁蛋白水平和血清铁浓度下降率铁蛋白（r=0.48，P（P）=0.024,图。2).

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图2。

血清铁蛋白浓度与血清铁下降率的相关性铁蛋白免疫沉淀后的浓度。相关系数和P（P）值如图所示。血清铁蛋白浓度为与血清铁浓度下降的速度成反比。

我们在本研究中使用的ICSH方法是测量血清的参考方法人体血液中的铁[9,10]. 该方法灵敏度高，适用于血清铁的测定；然而，它是据报道，人类患者受到高铁蛋白水平的干扰[13,22,23]. 这种影响被认为是由于通过脱蛋白步骤从铁蛋白中提取铁[23].在人类中，ICSH方法显示减少了5%以上，尤其是在患有铁蛋白浓度超过2000n个克/米我[23]. 在这项研究中，即使是血清正常的病例铁蛋白浓度（约500–1000n个克/米我)免疫沉淀后血清铁浓度下降约10%铁蛋白。因此，狗的血清铁测量可能比狗更容易受到铁蛋白的影响人类。这被认为是因为狗血清铁蛋白中的铁含量较高比人类[18,21]. 因此，我们建议有必要考虑血清铁蛋白水平当使用ICSH方法测量犬血清铁浓度时。据报道高铁血症不会影响血清铁的直接测定不需要脱蛋白[23]. 然而，蛋白质沉淀在从血清样本基质中的干扰（如血红蛋白和胆红素）[17]. 因此，有必要进行进一步调查建立犬血清铁测定的参考方法。

我们得出结论，昼夜变化和血清铁蛋白的干扰是影响当使用ICSH比色测定法时狗血清铁浓度的测量。它可能有必要通过以下方法重新检查狗血清铁浓度的参考范围标准化采样时间和分析。

参考文献