摩尔理论。作者手稿；PMC 2014年2月24日提供。
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美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院177293
构建人工抗原提呈细胞表达多种共刺激分子
,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1和1
梅根·M·苏霍斯基
1美国宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所病理学和实验医学系
塔蒂亚娜·戈洛维纳
1美国宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所病理学和实验医学系
妮可·阿基
1美国宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所病理学和实验医学系
维多利亚C台
1美国宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所病理学和实验医学系
安吉尔·瓦雷拉·罗赫纳
1美国宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所病理学和实验医学系
迈克尔·C·米隆
1美国宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所病理学和实验医学系
理查德·卡罗尔
1美国宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所病理学和实验医学系
詹姆斯·莱利
1美国宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所病理学和实验医学系
卡尔·H·琼
1美国宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所病理学和实验医学系
1美国宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所病理学和实验医学系
- 补充资料
图S1。
GUID:A700E242-D347-41F4-8BED-4DAC75A2D270
补充方法。
GUID:147930A0-EFC3-40D7-BEAC-3EFDEE741238
表S1。
GUID:FC9E88C2-C574-441F-950C-0C37E33D06A8
摘要
为了促进抗原提呈细胞（APC）的治疗应用，我们开发了一种基于细胞的人工APC（aAPC）系统，用慢病毒工程K562细胞，以指导多种共刺激分子和细胞因子的稳定表达和分泌。在这里，我们报告了使用组合慢病毒基因转移方法在K562亲本细胞系中实现至少七个基因的长期稳定表达。在aAPC上表达各种基因组合可以精确地确定人类T细胞的激活需求，这样，aAPC可以定制为具有特定生长需求和不同功能的T细胞亚群的最佳繁殖。aAPC支持体外与使用天然APC相比，无需添加外源性细胞因子即可实现功能性人类CD8 T细胞的生长和长期扩增。可以用表达CD137L（4-1BBL）和/或CD80的aAPC扩增不同的T细胞群。最后，aAPC为扩增转基因T细胞和维持CD8 T细胞上CD28的表达提供了一个有效的平台。因此，基于K562的aAPC具有过继免疫治疗和疫苗接种的治疗潜力。
简介
专业抗原呈递细胞（APC），如树突状细胞（DC）和淋巴细胞，由具有特定效应器功能的不同亚群组成。DC有两种主要谱系：髓系，包括郎格罕细胞和间质DC，以及浆细胞样谱系。1根据目前的概念，DC经历逐步激活/成熟。2未成熟树突状细胞对于维持对自身抗原的外周耐受和发展主动免疫至关重要。三在组织中，DC被激活以响应微生物信号（类toll受体配体）和其他微环境信号，触发迁移和分化为成熟的抗原负载DC。从血液单核细胞或其他前体细胞生成树突状细胞的能力使研究能够测试人类携带抗原的树突状病毒的过继转移。注射成熟树突状细胞可以提高健康志愿者的T细胞免疫力，4注射未成熟DC可通过诱导调节性T细胞抑制T细胞反应。5因此，DC免疫对于癌症免疫治疗和自身免疫具有重要意义。然而，DC的生成既费力又昂贵。培养过程是资源密集型的，利用细胞因子的混合物，捐赠者之间存在差异。6此外，有报道称癌症患者的DC功能失调。7
我们和其他人已经证明用人工APC（aAPC）代替天然APC成功地扩增了人类淋巴细胞。8——12我们选择K562细胞系作为支架，因为这些细胞不表达主要的组织相容性复合物分子，因此阻止了异基因反应。这些细胞还含有增强T细胞与APC相互作用的粘附分子。在本研究中，我们创建了一个改进的aAPC系统，以表达多种共刺激和人类淋巴细胞抗原（HLA）分子。以前的研究表明，使用逆转录病毒转导方法，在aAPC中表达了多达三个感兴趣的基因。12,13在这里，我们使用慢病毒载体技术证明了K562细胞aAPC中至少七个基因的稳定表面表达。aAPC在驱动T细胞扩张方面的效率与自然DC相当；它们对激活人CD8 T细胞、维持CD28表面表达和扩增转基因T细胞特别有效。最后，aAPC上的共刺激配体能够在不使用当前细胞培养过程中使用的外源性细胞因子或饲养细胞的情况下有效增殖和扩增CD8 T细胞。
结果
带有CD32或CD64的K562 aAPC
亲本K562系首次用CD32中间亲和Fc受体或CD64高亲和Fc受体稳定转导。通过流式分选获得单细胞克隆，并通过流式细胞术评估分子的表面表达(). 与小鼠IgG1或小鼠IgG2a抗体孵育并洗涤后，只有CD64 aAPC保留小鼠IgG2a的表达，CD32 aAPC上没有检测到的抗体。这些结果与报告的人类CD32和CD64的特性一致。14为了测试抗CD3的相对结合，将小鼠IgG2a单克隆抗体、CD64和CD32 aAPCs与抗CD3（OKT3）孵育并清洗。我们发现只有CD64 aAPCs具有可检测到的抗CD3表面表达(). 在之前使用质粒转染K562细胞的研究中，我们发现表达CD32的aAPCs能够刺激T细胞增殖，但仅当抗CD3留在培养基中时，这与抗CD3与CD32的低水平结合一致。9当CD64 aAPC装载抗CD3抗体，清洗后放回培养基中时，定量流式细胞术证明抗体的结合和表面表达是稳定的，并在至少24小时内保持高水平()。
慢病毒介导的CD64和CD32在K562人工抗原提呈细胞（aAPC）中的表达(一)CD64和CD32在K562细胞中的表达。用表达CD64或CD32的慢病毒载体转导亲本K562细胞系，并按照材料和方法中的描述对细胞进行分类和培养。(b条)抗CD3与CD32-和CD64转导的K562细胞的相对结合。将CD32和CD64-aAPC洗涤到无血清的Roswell Park Memorial Institute 1640培养基中，并在37°C的5%CO中培养过夜2用0.5µg/ml的抗CD3抗体装载aAPC，并用二级抗体染色。开放直方图表示仅用二次检测抗体染色的细胞；阴影直方图表示预先加载了抗CD3抗体，然后用二次检测抗体染色的细胞。(c（c）)CD64转导的K562 aAPCs上Fc-结合抗体的长时间表面呈现。CD64 aAPC在无血清培养基中在37°C和5%CO中培养过夜2，然后每1×10加载1µg/ml6小鼠IgG1或小鼠IgG2a异硫氰酸荧光素（FITC）结合抗体在4°C下保持30分钟。使用FITC-共轭免疫荧光球（Beckman Coulter，Fullerton，CA）计算与CD64转导的aAPC结合的分子数量。
为了确定CD32和CD64 aAPC激活T细胞的效率，aAPC被加载不同浓度的抗CD3和抗CD28抗体（小鼠IgG2a同型）。对载抗体的aAPCs进行致命照射，并以aAPCs/T细胞的1:2比例添加到T细胞培养物中(). aAPC能有效诱导T细胞增殖，大多数T细胞在分析当天表现出三或四次细胞分裂。抗体装载水平的剂量反应表明，装载只需要纳克浓度的抗体，这与抗体与CD64的有效结合相一致。
利用慢病毒转导的K562人工抗原提呈细胞（aAPC）高效激活和增殖T细胞(一)将CD64转导的K562 aAPC与指定浓度的抗CD3和抗CD28单克隆抗体（mAbs）孵育，然后清洗。对载抗体的aAPC进行致命照射，并将其与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的CD8 T细胞按aAPCs与T细胞的1:2比例进行培养。在培养的第4天通过流式细胞术评估T细胞增殖。(b条)不同刺激模式后CD8 T细胞激活和增殖的效率。用CFSE标记来自正常供体外周血的CD8 T细胞，并用可溶性抗CD3（10µg/ml）、植物血凝素（PHA）（3µg/ml）、抗CD3/CD28结合珠（珠与T细胞的比例为3:1）和辐照过的CD32转导或CD32和CD86转导的aAPC（T细胞与K562 aAPC的比例为2:1）刺激在存在指定量的抗CD3或抗CD3加上0.5µg/ml的抗CD28的情况下，或另有说明。在刺激的第一天，添加300 IU/ml重组白细胞介素-2（IL-2）。CD8（CD8）+在刺激第4天用流式细胞术评估T细胞增殖。直方图表示门控CD8的CFSE剖面+T细胞。(c（c）)“无活性”aAPC诱导的T细胞增殖。抗CD3负载、致死性辐照新鲜或冷冻保存的CD64-86转导的K562细胞介导CD4 T细胞的有效激活和生长。将表达CD64和CD86的K562细胞以1、10或50µg/ml的速度冷冻保存，包括或不包括预载抗CD3（OKT3）。将预载aAPC解冻后立即使用，并按照CFSE标记的CD4的指示添加新制备的OKT3-载aAPCs+T细胞（T细胞与K562 aAPC的比率为2:1）。还使用抗CD3/CD28珠刺激T细胞，并在培养第4天通过流式细胞术评估增殖情况。
K562 aAPCs与标准培养体系的效率比较
在上述实验中，aAPC被用作一个独立的T细胞培养系统，因为没有向培养基中添加外源性细胞因子。接下来，我们进行了实验，比较K562 aAPCs和传统CD8 T细胞刺激模式的相对效率。在培养第5天检查时，含有植物血凝素和白细胞介素-2（IL-2）或抗CD3和IL-2的CD8 T细胞培养物有显著的细胞分裂；然而，培养物中仍有大量T细胞未能分裂(). 同样，抗CD3/CD28结合珠在诱导CD8 T细胞增殖方面也很有效，但大量CD8 T淋巴细胞也未能分裂，这并不是由于缺乏IL-2。相反，抗CD3/CD28负载的CD64 aAPC招募更多的输入CD8 T细胞进入细胞分裂，这比抗CD3/CD28结合珠更有效。这并不是由于抗体涂层珠的次优激活，因为抗CD3/CD28结合珠是以先前确定的最佳比例添加的（每个T细胞3个珠）。最后，我们确定不需要抗CD28单克隆抗体，因为CD64–86 aAPC(即被工程化以表达CD64和CD28配体CD86的K562细胞）在诱导CD8 T细胞增殖方面也是高效的。
对于潜在的治疗应用，有一种可以简单地作为饲养细胞添加到T细胞培养物中的离体aAPC是有用的。因此，CD64–86 aAPCs被加载OKT3、辐照和低温保存。为了测试预先加载的aAPC的疗效，将细胞解冻并添加到羧基荧光素琥珀酰酯标记的T细胞中。这些预先加载的aAPC的效率与新制备的OKT3加载的CD64–86 aAPC相似()。
慢病毒载体稳定表达多个基因
从上述实验中，我们得出结论，CD32或CD64转导的aAPC可以有效激活原代T细胞培养。我们之前的工作使用质粒介导的CD32和CD137L在K562细胞中的表达来创建aAPC，并且需要选择抗生素来保持导入基因的表达。9在培养一个月后，慢病毒转导的CD32 aAPC保持一致阳性，而CD32在质粒转染细胞中的表达量较低，分布较广，尽管存在抗生素介导的选择压力(补充图S1)。
接下来，我们稳定地将多种共刺激分子转导到K562细胞中，以确定表达复合共刺激分子阵列的可行性。我们发现慢病毒转导后，多个基因可以在基于K562的aAPC中稳定表达。亲代K562细胞不表达共刺激分子或显示HLA I类和HLA II类表面表达。为了确定K562细胞在慢病毒转导后表达多个基因的能力，K562肿瘤细胞被转导并表达多种分子，包括CD32、CD64、CD40、CD40L、CD70、CD80、CD83、CD86、ICOSL、GITRL、CD137L（4-1BBL）、CD252（OX40L）、HLA-A201和HLA DR-0401(). 与以前的报告一致，15,16用肽脉冲表达HLA A2的aAPCs诱导CD8 T细胞的特异性CTL活性，表明功能性抗原呈递(). 因此，原则上，考虑到慢病毒载体转导技术的有效性，该方法有可能创建一种APC，该APC显示共刺激分子与Fc分子或HLA等位基因的组合阵列，以实现多克隆或抗原特异性刺激。
慢病毒介导的K562人工抗原呈递细胞中多基因表达和功能肽呈递(一)用含有人类淋巴细胞抗原（HLA）-A2、CD32、CD80、CD83、CD86、CD137L（4-1BBL）和CD252（OX40L）基因插入物的慢病毒载体转导K562细胞，并用MOFLO进行分选以分离单细胞克隆。克隆在不使用抗生素的情况下培养2个月，并用流式细胞仪检测其表达。直方图表示CD32-80-83-86-137L-252-A2细胞系（阴影）与亲代K562细胞（开放）相比的蛋白质表达。(b条)用慢病毒载体转导K562细胞CD32和HLA-A*0201，并根据表面表达进行分类。用肽对K562 aAPC靶点（T）进行过夜脉冲处理，并用51Cr如中所述补充材料和方法肽脉冲aAPC或载抗CD3的aAPC与特异性CD8培养+从HLA-A2分离的效应器克隆（E）+捐赠者。在4小时后采集培养物，并计算每个靶点的CTL活性（通过百分比特异性裂解测定）：氟肽脉冲（方形）、HTLV-1税控肽（钻石）和抗CD3负载（三角形）。
aAPC–T细胞簇形成
T细胞激活的第一个可见事件是APC和T细胞之间形成簇。17单独培养aAPCs或存在或不存在可溶性抗CD3的T细胞，仍然没有形成簇(). 此外，在没有抗CD3抗体的情况下，辐照的aAPC和CD8 T细胞的混合物仍然没有聚集(). 相反，当aAPC和T细胞在抗CD3抗体的存在下混合时，aAPC与T细胞形成大簇(). 簇的大小在48到72小时之间增长()在这一点上，培养物中几乎所有的T细胞都包含在大的簇中。大约在培养的第4天，经照射的aAPC开始分解（数据未显示），因此到第6天，培养物仅包含可容易分解为单个细胞的活T细胞。
用倒置相差显微镜观察人工抗原呈递细胞（aAPC）–T细胞簇的形成抗CD3抗体（OKT3，0.5µg/ml）存在和不存在时，aAPC对聚集T细胞的相对容量。用CD32、CD80、CD83、CD86和CD137L（4-1BBL）转导的K562细胞进行致命照射，并以1:2的比例与CD8 T细胞混合。(一)仅CD32-80-83-86-137L aAPC；(b条)仅CD8 T细胞；(c（c）)仅CD8 T细胞和aAPC；(d日)CD8 T细胞和抗CD3/CD28珠；(e（电子）)CD8 T细胞和抗CD3；(f–h)CD8 T细胞、aAPC和抗CD3。显微照片a–g和小时分别描述第2天和第3天的文化。
aAPC介导的CD28扩张−CD8 T细胞
我们早期的实验表明，基于K562的aAPCs在诱导CD8 T细胞增殖方面比抗CD3/CD28涂层珠和其他常规培养系统更有效(). 几个实验室先前的研究表明，CD28−T细胞亚群相对低增殖18并侵蚀了端粒，表明存在更广泛的复制历史。19,20为了验证CD28招募的假设−细胞分裂导致增殖增强，CD8 T细胞经流式细胞仪分选成CD28+和CD28−子集。然后用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记分类的T细胞亚群，并用表达CD32、CD80、CD83、CD86和CD137L的aAPC或传统的抗CD3/CD28珠刺激。此外，T细胞在只含有可溶性CD3抗体的培养基中培养。在培养的第8天，通过稀释CFSE评估增殖。与之前的报告相反，我们发现CD28−可以有效地刺激T细胞。当用aAPC刺激时，所有细胞都分裂了，而抗CD3/CD28珠刺激留下了大量未分裂的T细胞(). 相反，aAPCs和珠子培养物的刺激可以诱导所有CD28+T细胞分裂。
人工抗原提呈细胞介导CD8 T细胞亚群的非帮助性扩增使用抗CD3负载的CD32-80-83-86-137L aAPCs有效诱导CD8 T细胞亚群增殖。CD8 T细胞被分成CD28+和CD28−通过流排序的子集。T细胞亚群是羧氟辛琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的，并与培养基和可溶性抗CD3（OKT3，0.5µg/ml）、抗CD3/CD28珠（珠与T细胞的比例为3:1）或负载抗CD3的CD32-80-83-86-137L（T细胞与aAPC的比例为2:1）一起培养。没有将外源性细胞因子添加到培养物中。显示培养第8天CFSE直方图的重叠。插入点图表示CD28的表达(年-轴）和CD8(x个-轴）。单克隆抗体。
人CD8 T细胞亚群的非依赖性增殖
最近的报告表明，以前的战略体外T细胞的扩增通常导致细胞最终分化，增殖能力较差，过继性转移的T细胞维持CD28表达，端粒较长，与植入改善和抗肿瘤作用增强相关。21我们评估了使用K562 aAPC系统扩增的CD8 T细胞的细胞表面表型。与0天表型相比，扩大的人群保留了CD28、CD27和CD62L的表达(). CD8 T细胞经佛波肉豆蔻酸盐和离子霉素激活后也能产生细胞因子IL-2和干扰素-γ()这表明细胞保留了其复制能力和效应器功能。
K562人工抗原呈递细胞（aAPC）–扩增的CD8 T细胞保留细胞表面表型和产生细胞因子的能力如材料和方法中所述，用抗CD3/CD28珠或所指示的负载有抗CD3的aAPC扩增体CD8 T细胞两轮刺激。当细胞恢复到静息状态时，使用流式细胞仪分析其表型，并将其与第0天或冷冻保存的CD8 T细胞进行比较，以便将来进行表征。(一)在每种条件下测量CD28、CD27和CD62L的细胞表面表达。象限是基于阴性同型对照设计的，细胞在活性CD8上进行门控+细胞。(b条)诱导K562 aAPC扩增CD8 T细胞产生细胞因子。从第0天起，将冷冻保存的CD8 T细胞或用指示的K562 aAPC扩增的CD8细胞解冻，并在单独培养基（顶面板）或用佛波酯-肉豆蔻酸盐（PMA）和离子霉素（离子霉素）（底面板）培养5小时，并评估细胞内白细胞介素-2（IL-2）和干扰素-γ（IFN-γ）的产生。
对于某些形式的过继免疫治疗，例如使用肿瘤浸润淋巴细胞，22扩大所有CD8 T细胞将有助于保持效应器功能的平衡，并保留输入的T细胞受体库。为了确定哪些共同刺激分子会促进这一点，我们用表达CD137L（4-1BBL）的抗CD3负载的CD32 aAPCs培养CD8 T细胞，无论是否含有CD80。为了最大限度地检测独立的共刺激效应，在没有外源性细胞因子或辅助细胞的情况下进行培养。如材料和方法中所述，在培养的第8天和第12天之间重新刺激T细胞培养。在培养的第一周，使用抗CD3/CD28珠的T细胞的生长与使用K562 aAPC的相当(). 然而，在培养2周后，珠刺激培养物达到了一个稳定期，这与之前的报告一致，表明抗CD3/CD28珠对CD8 T细胞的持续增殖效率较低。9,23相比之下，K562 aAPCs刺激的T细胞培养持续3周以上呈指数级的CD8 T细胞扩增。同时表达CD80和CD137L的aAPC优于单独表达CD137的aAPCs：CD32-CD137L aAPCs允许约1000倍的扩张，而CD32-80-CD137L aAPC在一次再刺激后刺激约10000倍的扩张。细胞大小监测表明，CD32-80-137L aAPCs刺激的T细胞比其他培养物的细胞体积增长更长(). 然而，仅用含有CD80的aAPCs刺激的CD8 T细胞往往比那些用自身或CD80表达CD137L的aAPC刺激的细胞休息得更早，导致刺激结束时T细胞数量减少(). aAPC培养物的一个显著特征是不需要添加外源性细胞因子。CD8 T细胞的辅助性非依赖性生长可能是由于更强烈的共刺激，因为aAPC本身不分泌支持T细胞生长的细胞因子(补充表S1)。
CD80和CD137L（4-1BBL）在人CD8 T细胞与人工抗原呈递细胞（aAPC）的非重叠性扩增中的作用CD8 T细胞（1×106)用0.5×10刺激6辐照aAPC，预先加载表达CD32-CD137L（开放方块）或CD32-80-137L（三角形）的抗CD3抗体，或用3×10刺激6抗CD3/28珠（圆圈），或培养基加抗CD3（虚线）。如箭头或箭头所示，当细胞在培养第8-12天恢复到静止体积（250 fl–300 fl）时，在重新添加aAPC或珠的情况下，对CD8 T细胞进行重新刺激。T细胞培养物中未添加任何外源性细胞因子。这些数字代表了使用多个正常供体CD8 T细胞的至少三个独立实验。(一)培养中CD8 T细胞的总数。(b条)T细胞体积（fl）由电子细胞大小决定。(c（c）)CD8 T细胞的T细胞体积（fl）用CD32 aAPCs扩增，CD32 aAP单独表达CD80（阴影方框）或单独表达CD137L（开放方框）或CD80和CD137L。如箭头所示，当培养物恢复到静止体积时，对其进行重新模拟。在培养的第9天，用抗CD3负载的CD32–137L aAPCs刺激的细胞再次受到刺激（灰色箭头）。
aAPC介导慢病毒工程CD8 T细胞的扩增
基因工程T细胞过继转移是另一种正在测试的免疫治疗策略。在初步实验中，我们确定转导和扩增CD8 T细胞的最佳策略是连续的抗CD3/CD28珠粒和APC培养方法(). K562 aAPCs能够维持均匀明亮的CD28表达，而珠培养中的T细胞下调了其CD28表达。这可能很重要，因为其他研究表明，维持CD28表达与提高植入和抗肿瘤疗效相关。21此外，CD28表达的维持可能是先前观察到CD8 T细胞在aAPC培养物中长时间独立生长的原因，而不是在珠培养物中(). 即使在缺乏外源性细胞因子的情况下，用K562 aAPCs重新刺激也能有效地扩增绿色荧光蛋白表达的CD8 T细胞()。
K562人工抗原提呈细胞（aAPC）支持慢病毒转导的CD8 T细胞的扩增(一)实验方案示意图。(b条)通过流式细胞术在培养第17天评估细胞表型。顶部面板中的直方图表示绿色荧光蛋白（GFP）的表达。底部面板显示GFP象限(x个-轴）和CD28(年-轴）与最右侧的同型控制进行比较。(c（c）)细胞计数和生长曲线(d日)平均细胞体积图表示第一次刺激（珠子和24小时转导），然后用箭头指示的带有抗CD3/CD28珠子（三角形）或装有抗CD3的CD32–137L aAPC（方形）或不带再刺激（圆形）的再刺激。
讨论
慢病毒载体技术已被用于工程化K562细胞，以创建更接近DC特征的APC。在这项工作中，我们已经表明，至少七个感兴趣的基因可以在基于K562的aAPC中稳定表达。使用这种方法，可以在用于免疫治疗的aAPC支架中表达多种共刺激分子和细胞因子的组合。我们已经证明，表达CD28和CD137配体（4-1BB）的K562-aAPC对于CD8 T细胞的长期增殖是优越的，并且添加其他共刺激分子如CD83可以支持CD28的扩增−T细胞亚群。我们还表明，K562 aAPCs可有效扩增转基因T细胞，并促进培养T细胞表面CD28的维持。我们在这项工作中证明了K562 aAPC系统在抗CD3介导的多克隆刺激中的效力；此外，aAPCs也可以被设计用于表达HLA分子，无论是Ⅰ类还是Ⅱ类，用于抗原特异性富集和激活CD8和CD4 T细胞。
结果表明，与传统的T细胞培养方法相比，基于K562的aAPCs更有效地诱导所有CD8 T细胞分裂。CD83刺激可能会进一步增加CD28和4-1BB刺激的效果。12扩增后的细胞在再次刺激后可以产生IL-2和干扰素-γ，表明它们不是最终分化的效应细胞。
在某些免疫病理状态下（通常以持久性抗原为特征），人类T细胞可能下调其表面CD28的表达。18,19CD28的丢失通常与端粒降解、端粒酶诱导受损、IL-2生成减少和复制衰老有关。20然而，CD28−T细胞积聚体内导致了他们能够分裂的概念。我们使用基于K562的aAPC的结果显示，几乎所有CD28−T细胞有可能至少经历几轮增殖在体外。
生成表达高亲和力Fc受体CD64的aAPC可以从aAPC中去除可溶性抗CD3抗体，洗涤后使用载抗CD3的CD64 aAPC进行淋巴细胞扩增，与在存在可溶性抗体的情况下装载并共同培养的CD32 aAPC相当。此外，可以添加精确数量的抗体来产生不同的T细胞受体信号强度，以传播可能具有不同激活阈值的T细胞亚群。24最后，通过将CD64 aAPC预加载抗CD3，然后冷冻保存小份细胞以备将来使用，我们生成了一种“非现成”试剂，可以方便地用于培养人类T细胞亚群以用于研究或临床应用。
材料和方法
CD8 T细胞的多克隆刺激和长期培养
新鲜外周血淋巴细胞通过白细胞减少和淘洗获得，CD8 T细胞通过阴性选择使用OKT4抗体（弗吉尼亚州马纳萨斯美国型培养集）纯化，如其他地方所述，27使用阴性选择的Rosette CD8 T细胞纯化试剂盒（加拿大温哥华干细胞技术公司）或MAC CD8 T淋巴细胞分离试剂盒II（加利福尼亚州奥本Miltenyi Biotec公司）。立即使用淋巴细胞或将其冷冻保存在含有90%人AB血清和10%二甲基亚砜的培养基中以备将来使用（西格玛阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）。CD8 T细胞在指定的R-5培养基中培养，该培养基含有罗斯韦尔公园纪念研究所-1640培养基（Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA）以及5%的人AB血清（弗吉尼亚州温彻斯特的Valley Biomedical）、100 U/ml青霉素G钠和100µG/ml硫酸链霉素（Gibco/Invitro gen，Callsbad），并在37°C的5%CO中培养2.1×10刺激前6CD8 T细胞，0.5×106CD32转导的aAPC用100 Gy致死性照射，清洗，并在1×10的条件下再次悬浮6细胞/ml注入R-5培养基。然后将aAPC添加到24孔板中，并在室温下以0.5µg/ml的浓度装载抗CD3（OKT3；Orthoclone，Bridgewater，NJ）单克隆抗体10分钟。CD8 T细胞在2×10时再次悬浮6细胞/ml，并将0.5 ml细胞滴加到载抗体的aAPC中。在使用CD64转导的aAPC之前，对细胞进行清洗，并在无血清培养基中重新悬浮24小时，以释放Fc受体，以实现最佳抗体负载刺激。在装载抗CD3抗体后，在与T细胞共培养之前，通过至少两次洗涤aAPC并在R-5中重新悬浮来去除多余的抗体。初始T细胞浓度为1×106细胞/ml总体积。如其他地方所述，以三粒/一粒T细胞的比例进行抗CD3/28粒刺激。28每2-3天监测T细胞刺激培养物的细胞体积，并在Coulter Multisizer 3（加州Fullerton Beckman Coulter）上计数。每隔8-11天对细胞进行一次重新刺激，当扩增速度趋于平稳和/或平均淋巴细胞体积降至250 fl时。
另请参见补充材料和方法。
致谢
我们要感谢William DeMuth III（阿布拉姆森家族癌症研究所）为MOFLO提供的技术援助，以及Coral Haas（阿布拉姆逊家族癌症研究院）提供的行政援助。这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）CA105216和AI060477奖以及正常和新生淋巴细胞免疫生物学培训拨款T32 CA 09140的部分支持。作者已宣布存在潜在的利益冲突。
脚注
补充材料
图S1。与基于转染的方法相比，慢病毒介导的表达导致表达和稳定性增加。
表S1。用CD32转导的K562 aAPC分泌构成性细胞因子。
材料和方法。
参考文献
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