表皮生长因子受体信号转导通过mTOR和FOXM1促进大鼠胰腺β细胞增殖以应对营养过剩

动物输液和药物治疗

所有程序均由蒙特勒大学中心动物保护机构委员会批准。按照之前的描述进行输液(9). 雄性Wistar大鼠体重为250–300 g（～2个月大）和500–600 g（～6个月小）（查尔斯·里弗，圣康斯坦特，加拿大QC），在控制温度下饲养，光/暗循环12小时，不受限制地饮用水和标准实验室食物。将动物随机分为两组，分别接受0.9%生理盐水（SAL）（巴克斯特，米西索加，安大略省，加拿大）或70%葡萄糖（加拿大麦克森，蒙特雷尔，QC，加拿大）加20%脂肪酸（一种豆油乳剂，与肝素混合时产生约80%不饱和脂肪酸/20%饱和脂肪酸的混合物；Fresenius Kabi，Bad Homburg，德国）(10)使用20单位/mL肝素（Sandoz Canada，Boucherville，QC，Canada）（即GLU+IL）。使用哈佛仪器输液泵（33号泵）进行输液，同时独立操作两个注射器。在输液过程中，所有动物都可以不受限制地获得食物和水。对于给药，将AG1478或雷帕霉素溶于N，N-二甲基乙酰胺（Sigma-Aldrich）中至50mg/mL的浓度，然后在丙二醇中稀释以产生2mg/mL的储备溶液。每天，将储备溶液在1.2%吐温80/27%聚乙二醇400（Sigma-Aldrich）中稀释至工作浓度，并以0.5mg/kg/天的剂量静脉注射。对照组注射相同体积的溶媒。

细胞培养

如前所述，培养MIN6细胞（第25-30代）(11). 细胞接种在6孔板中，密度为500000个细胞/孔。第二天，在不含或含有抑制剂的情况下，将细胞在含HB-EGF浓度增加的完整培养基中培养24小时。为了进行细胞计数，用10%甲醛固定细胞，用Hoechst试剂（Sigma-Aldrich）对细胞核染色，每孔随机拍摄10张图像。使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）测定细胞数量。

大鼠胰岛增殖

如前所述，将分离的大鼠胰岛分散并镀在涂有HTB-9细胞外基质的96个板中(12). 分散的大鼠胰岛在完整胰岛培养基中无或存在100 ng/mL HB-EGF的情况下处理72 h。每24小时更换一次培养基。治疗结束时，对细胞进行固定并染色，以检测β细胞标记物胰腺十二指肠同源盒-1（PDX-1）和增殖标记物Ki67，如前所述(13). 增殖以双阳性Ki67的百分比计算⁺/PDX-1型⁺总PDX-1上的细胞⁺人口。

人类岛屿

蒙特勒大学医院中心伦理委员会批准使用人类胰岛。艾伯塔大学临床胰岛实验室和由国家糖尿病及消化和肾脏疾病研究所和国际青少年糖尿病研究基金会赞助的综合胰岛分布计划提供了来自非糖尿病人类尸体供体的分离胰岛。

转录组分析和定量RT-PCR验证

如前所述，通过胶原酶消化和右旋糖酐密度梯度离心分离大鼠胰岛(14). 使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）从150个胰岛提取总RNA，并使用RNeasy MinElute清理试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）按照制造商的方案进行纯化。使用基因芯片大鼠基因1.0 ST微阵列对总RNA进行微阵列分析（每组五个阵列；Affymetrix，Santa Clara，CA）。使用Ambion WT表达试剂盒（Invitrogen）处理100纳克总RNA。根据Affymetrix协议处理得到的片段化和标记的单链cDNA。数据分析使用Partek（密苏里州圣路易斯）基因组学套件。使用鲁棒多芯片平均算法对数据进行归一化，该算法使用背景调整、分位数归一化和摘要。使用错误发现率修正多重比较的统计显著性后(P（P）<0.01），使用Ingenuity Pathways Analysis（应用程序构建192063，内容构建14400082；Ingenuiity Systems，Redwood City，CA）对GLU+IL和对照组之间显著差异表达>20%的转录物进行基因集富集分析。如前所述，通过定量RT-PCR（qRT-PCR）验证所选基因(9). 所有qRT-PCR结果均标准化为亲环素A mRNA水平。引物序列描述见补充表1.

分析测量

使用Wako Chemical（日本大阪）的试剂盒测量血糖和游离脂肪酸（FFA）水平。通过ELISA（Alpco、Windham、NH）测定胰岛素和胰高血糖素。

胰腺切片的免疫染色

将胰腺切下脂肪，称重，在4%多聚甲醛中固定3-4小时，并在30%蔗糖中冷冻过夜。然后将胰腺埋入OCT（TissueTek）中，通过冷冻切片（Leica）获得8-µm切片。使用柠檬酸钠缓冲液进行抗原回收。初级抗体和稀释液列于补充表2二级抗体来自Jackson ImmunoResearch（宾夕法尼亚州West Grove）。使用荧光显微镜（Zeiss，Thornwood，NY）拍摄图像。如前所述测定β-细胞质量和大小(9,15). 评估β细胞增殖、胰岛素⁺和双阳性胰岛素⁺/基辅67⁺人工计数每只动物至少2000个β细胞。

免疫印迹法

如前所述，从细胞或胰岛中提取20微克蛋白质并通过SDS-PAGE进行解析(11). 初级抗体列于补充表2。在柯达BioMax XAR胶片（柯达，罗切斯特，纽约）上使用辣根过氧化物酶标记的IgG（加利福尼亚州里士满，Bio-Rad）和增强化学发光（加拿大，伍德布里奇，加拿大，PerkinElmer）检测信号。通过密度测定和ImageJ软件（美国国立卫生研究院）对条带进行量化。

GLU+IL-注入6个月龄大鼠胰岛的转录谱确定与细胞周期进展相关的转录网络

为了深入了解调节胰岛β细胞增殖以应对营养素诱导的胰岛素抵抗的分子机制，我们对6个月大鼠的胰岛进行了基于微阵列的转录组学分析。给6个月大的Wistar大鼠输注SAL或GLU+IL 72小时，并在输注结束时从每组五只与体重匹配的动物中分离出胰岛。如所示图2A类，错误发现率<0.01，GLU+IL输注显著调节了～3000个基因。总的来说，一半的基因上调，一半下调。当SAL组和GLU+IL组的截止值设置为两倍差异时，300个基因显著上调，而GLU+IL-输注仅下调30个基因。在300个上调基因中，SAL组中一组低水平表达的基因在GLU+IL组中强烈上调(图2A类，图的左下角）。使用Ingenuity Pathway analysis软件进行的基因集富集分析显示，这些基因在很大程度上与细胞周期进展和有丝分裂有关(图2B类). 一项更详细的分析显示，在该组中，叉头转录因子FOXM1（G2/M细胞周期转换的关键调节因子）的大多数直接下游靶点都被GLU+IL输注上调(图2C类). 有趣的是，FOXM1抑制剂叉头转录因子FOXO3a的表达(16,17)，GLU+IL输注后降低(图2C类). 此外，编码HB-EGF的基因的表达是一种潜在的自分泌/旁分泌生长因子，可诱导β细胞增殖(18) (图2C类)GLU+IL组也上调。通过qRT-PCR分析验证了这些表达变化。首先，我们验证了GLU+IL组中增殖标记物Ki67的表达增强程度与图1（未显示数据）。其次，我们证实了GLU+IL输注抑制了FOXO3a的表达(图3A类)而HB-EGF、FOXM1以及FOXM1 Aurora激酶B（AURKB）和Polo-like激酶1（PLK1）的直接靶点明显被诱导(图3B类–E类). GLU+IL组的FOXM1蛋白水平也显著增加(图3F类). 根据HB-EGF作为营养因子的作用，其在单个样本中的表达与Ki67、FOXM1、AURKB和PLK1的表达呈正相关；与FOXO3a呈负相关（数据未显示）。注射GLU+IL后，2月龄大鼠胰岛中所有这些基因的表达保持不变(图3A类–E类). 为了证实这种转录网络在更慢性的营养过剩模型中被激活，我们测量了喂食高脂肪饮食8周的C57BL/6小鼠胰岛中这些基因的表达，并根据体重增加将其分为以下两组：低饮食反应组和高饮食反应组(19). 高剂量应答小鼠胰岛中FOXM1、AURKB和PLK1的表达显著增加，尽管程度低于注射大鼠(补充图1).

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图2

GLU+IL注入6个月大鼠分离胰岛的转录组分析。A类：散点图中表示的差异表达基因。B类：由Ingenuity Pathway Analysis软件注释的顶级生物功能和标准路径（Fisher精确测试P（P）值）。C类：参与细胞周期进展的代表性基因网络，显示HB-EGF、FOXM1和FOXO3a的中心作用。上调基因以红色显示，下调基因以绿色显示。数据来自每组五只动物。

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图3

在注射GLU+IL的6月龄大鼠的胰岛中诱导FOXM1及其靶点的表达。A–E：qRT-PCR测量各年龄组中与亲环素A和SAL融合动物相关的mRNA表达。数据表示为每组5-11只动物的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.F类：每个输液组中四只6个月大鼠FOXM1的代表性Western blot。

HB-EGF通过EGF受体和雷帕霉素的哺乳动物靶点促进β细胞增殖

为了确定HB-EGF在β细胞中的有丝分裂潜能，我们评估了其刺激MIN6细胞和分散的大鼠胰岛增殖的能力。24小时治疗后外源性HB-EGF剂量依赖性增加MIN6细胞增殖(图4A类)在分散的大鼠胰岛中也观察到这种作用(图4B类). 这与两个MIN6细胞中S6核糖体激酶（S6R）的时间依赖性磷酸化有关，S6R是哺乳动物雷帕霉素（mTOR）靶点的下游靶点(图4C类)和人类胰岛(图4天). 在磷脂酰肌醇3（PI3）激酶抑制剂LY294002的存在下，人类胰岛中HB-EGF对S6R的磷酸化被消除(图4E类和F类). HB-EGF促进MIN6细胞增殖的能力与betacellulin相似，Betacelullin是一种EGF受体（EGFR）配体，据报道可在体内外促进β细胞复制(20,21) (图4G公司). 在EGFR抑制剂AG1478或mTOR抑制剂雷帕霉素的存在下，对HB-EGF反应的MIN6细胞增殖的诱导被完全阻断(图4G公司和补充图2)以及在CRM197的存在下，一种白喉毒素突变体结合并中和HB-EGF(图4H（H）).

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图4

HB-EGF以EGFR/mTOR依赖的方式促进β细胞增殖。A类,G公司、和H（H）：用HB-EGF加或不加AG1478（300 nmol/L）或雷帕霉素（10 nmol/L.）和HB-EGF-拮抗剂CRM197（10µg/mL）处理24小时后，通过计数细胞核来测量MIN6细胞增殖。数据表示为三到六个实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001.B类：在没有或存在HB-EGF（100 ng/mL）的情况下，将分散的大鼠胰岛处理72 h，固定细胞并对其进行Ki67和PDX-1染色。β-细胞增殖以双阳性Ki67的百分比计算⁺/PDX-1型⁺总PDX-1上的细胞⁺人口。数据表示为四个重复实验的平均值±SEM**P（P）< 0.01. HB-EGF处理MIN6细胞后磷酸化S6R（p-S6R）的典型Western blot和密度定量(C类)和人类胰岛(天). 数据表示为三个重复实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.E类和F类：在缺乏（−）或存在（+）PI3激酶抑制剂LY294002（10μmol/L）的情况下，HB-EGF治疗后p-S6R的典型Western blot和密度定量。数据表示为三个重复实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05.

致谢。作者感谢G.Fergusson和M.Ethier（蒙特利尔大学医院研究中心）提供的宝贵技术援助。作者感谢阿尔伯塔大学的James Shapiro和Tatsuya Kin博士，以及由国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所和国际青少年糖尿病研究基金会赞助的综合胰岛分布计划，他们提供了分离的人类胰岛。

基金。B.Z.由礼来公司的博士后奖学金资助。M.P.担任加拿大糖尿病和代谢研究主席。本研究得到了美国国立卫生研究院（向V.P.授予R01-DK-58096）和加拿大卫生研究所（向V.P授予MOP 77686）的支持。副总裁担任加拿大糖尿病和胰腺β细胞功能研究主席。

利益的双重性。没有报告与本文相关的潜在利益冲突。

作者贡献。B.Z.进行了研究，研究了数据，分析了结果，并撰写了手稿。I.B.、G.F.、M.-L.P.和O.S.进行了研究，研究了数据，分析了结果，并审阅了手稿。M.P.审阅了手稿。V.P.构思了这项研究，分析了结果，并撰写了手稿。V.P.是这项工作的担保人，因此，他可以完全访问研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。

之前的演示。2012年6月8日至12日在宾夕法尼亚州费城举行的美国糖尿病协会第72届科学会议上以摘要形式介绍了本研究的部分内容；以及2013年10月17日至19日在加拿大魁北克省蒙特利尔举行的第16届加拿大糖尿病协会/加拿大内分泌与代谢学会/血管学会2013年度会议。