跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
生物化学杂志。2014年2月21日；289(8): 5285–5295.
在线发布2014年1月6日。 数字对象标识：10.1074/jbc。M113.523639号
预防性维修识别码：项目经理3931084
PMID：24394417

锚蛋白B调节钙v（v）2.1和Cav（v）2.2通道表达和靶向*

水晶F.Kline,‡,1 约翰斯科特,‡ 杰里·柯伦,‡ 托马斯·亨德,§和彼得·莫勒‡‖
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

背景：钙通道控制膜兴奋性。钙的潜在机制v（v）2.1/Ca（加利福尼亚州）v（v）2.2目标定位尚不清楚。

结果：Ankyrin-B与Ca结合v（v）2.1/Ca（加利福尼亚州）v（v）2.2. 锚蛋白B的缺失导致Ca的表达减少v（v）2.1/Ca（加利福尼亚州）v（v）2.2在特定脑区。

结论：锚蛋白B在钙的表达中起作用v（v）2.1/Ca（加利福尼亚州）v（v）2.2.

意义：结果确定了钙通道膜靶向性和膜兴奋性调节的途径。

关键词：衔接蛋白、细胞骨架、离子通道、膜运输、蛋白质分选、蛋白质靶向

摘要

N型和P/Q型钙通道在调节突触功能中起作用；然而，其表达和细胞靶向性的机制尚不清楚。锚蛋白多肽对许多细胞类型（包括神经元、心肌细胞、上皮细胞、分泌细胞和红细胞）的正常整体膜蛋白表达至关重要。锚蛋白功能障碍与整体蛋白表达缺陷、细胞功能异常和疾病有关。在这里，我们证明锚蛋白B与钙结合v（v）2.1和Cav（v）皮层、小脑和脑干中2.2个。此外，使用在体外和体内技术，我们证明锚蛋白B通过其膜结合域与钙的DII/III环域中高度保守的基序相关v（v）2.1和Cav（v）2.2. 此外，我们证明该结构域对于钙的正确靶向是必要的v（v）2.1和Cav（v）2.2在异源系统中。最后，我们证明了Ca和Ca的锚蛋白结合基序中单个保守酪氨酸残基的突变v（v）2.1（Y797E）和Cav（v）2.2（Y788E）导致与锚蛋白B失去关联在体外和体内总的来说，我们的发现确定了锚蛋白-B和Ca之间的相互作用v（v）2.1和Cav（v）2.2的氨基酸水平，这是适当钙的必要条件v（v）2.1和Cav（v）2.2目标定位体内.

关键词：衔接蛋白、细胞骨架、离子通道、膜运输、蛋白质分选、蛋白质靶向

介绍

神经元是高度极化的细胞，神经元生理学中的结构、功能和分子差异是接收、处理和传输信息能力的基础。离子通道、受体和细胞骨架蛋白在特定神经元膜域中的特异表达谱在确定整个细胞的局部功能中起着主要作用。最近，对细胞骨架蛋白在可兴奋细胞局部膜结构域的发生和维持中的作用的研究揭示了这些蛋白在生理和疾病中的一个新的令人兴奋的研究途径(1,2).

钙离子是重要的第二信使，参与多个神经元细胞过程的调节，但主要是突触传递(三,–7). 钙2+通过电压依赖性钙通道（VDCC）进入质膜。2保持细胞内钙的紧密时空分布2+VDCC是调节多种功能所必需的，其生物物理特性、调节和亚细胞定位已经发生了变化(8). VDCC的生理重要性进一步体现在与神经和运动疾病相关的VDCC通道成分的各种突变上(9). 根据电生理和药理学特性，VDCC被分为五类，分别为T、L、N、P/Q和R(9,–12). N型和P/Q型电流主要在神经元中观察到，并与突触上停靠的小泡子集共同定位，在那里它们控制胞吐(13,–15)并启动突触神经传递(三,4,16). VDCC是由成孔α1亚基和相关辅助亚基Ca组成的异多聚体v（v）β和α2δ（审查见参考。4). 虽然辅助亚单位已被证明能增强α1B的表达(17,18)钙的潜在机制v（v）通道膜的表达和定位尚不明确。

锚蛋白是一类膜连接蛋白，对靶向和调节某些膜蛋白和细胞质蛋白是必要的(19). 在大脑中，锚蛋白G是Ranvier的初始节段和节点功能组织的必要组成部分。小脑锚蛋白G的靶向性破坏会导致严重的共济失调、失去激发动作电位的能力和钠的丢失v（v）初始段1.6(20,21). 此外，还有节点β的损失四、spectrin和KCNQ2/3通道与细胞粘附分子神经筋膜的不加区分定位(21,22). 浦肯野神经元起始段神经筋膜蛋白表达缺失导致连接小脑浦肯野神经细胞的神经元间突触断裂(23). 同样，锚蛋白B已被证明在大脑可兴奋区域的建立和维持中起着关键作用(24). 小鼠锚蛋白B的丢失会导致明显的神经系统缺陷，包括胼胝体和锥体束发育不良、侧脑室扩张和长轴索束退化(25). 值得注意的是，最近在脑外的研究确定了锚蛋白B在靶向选择性电压门控钙离子方面的新作用2+心脏窦房结起搏细胞的通道(26,27). 因此，我们测试了锚蛋白B在靶向大脑中特定钙通道方面的作用。

我们的发现通过证明适当钙所需的锚蛋白B依赖性相互作用，定义了锚蛋白B在神经细胞生物学中的作用v（v）2.1和Cav（v）2.2在大脑中的表达。我们观察到钙显著减少v（v）2.1和Cav（v）2.2在锚蛋白B缺乏小鼠的皮层、小脑和脑干组织中的表达。在定义这种相互作用的结构要求时，我们证明锚蛋白-B膜结合结构域与Ca直接相关v（v）2.1和Cav（v）2.2. 具体来说，这种相互作用发生在两个VDCC的DII/III环路区域。最后，Ca中Tyr-797残基的单一氨基酸突变v（v）2.1和Tyr-788（钙）v（v）2.2足以破坏锚蛋白B与钙的结合v（v）2.1或Cav（v）2.2. 总之，我们的数据证明了锚蛋白B在Ca表达中的必要作用v（v）2.1和Cav（v）大脑中2.2。

实验程序

动物

小鼠为年龄匹配的野生型锚蛋白B+/−和锚蛋白-G小脑特异性敲除的同卵双胞胎。动物回交至少20代（纯度99.8%）进入C57BL/6背景（Jackson Laboratories）。如前所述，产生锚蛋白-G小脑特异性敲除小鼠(25). 根据俄亥俄州立大学动物护理和使用委员会批准的协议和动物福利条例处理动物。所有老鼠的饲养和处理方式相同。

抗体

以下主要抗体用于免疫印迹和/或免疫染色：抗锚蛋白B（多克隆）、抗锚蛋白G（多克隆v（v）2.2（多克隆；Thermo Scientific和Alomone Labs），抗Cav（v）2.1（多克隆；Alomone实验室）；抗GAPDH（单克隆；菲茨杰拉德工业国际）；抗GFP（NeuroMabs）。用于免疫印迹的二级抗体是HRP偶联驴抗兔（Jackson Laboratories）和HRP偶联驴抗鼠（JacksonLaboratory）。用于免疫染色的二级抗体是Alexa Fluor 568山羊抗兔Ig（Invitrogen）。钙v（v）2.1和Cav（v）使用转染GFP-Ca的HEK293细胞的免疫印迹验证2.2抗体v（v）2.1或GFP-Cav（v）2.2. 钙v（v）2.1 Ig特异性识别GFP-Cav（v）2.1，但不是GFP-Cav（v）2.2. 相反，Cav（v）2.2 Ig特异性识别GFP-Cav（v）2.2，但不是GFP-Cav（v）2.1.

钙v（v）2.1和Cav（v）2.2结构

引物被设计用于克隆氨基酸708–1194（Cav（v）2.1 DII/DIII回路），788-1194和808-1194来自大鼠全长Cav（v）2.1基于GenBank获得的序列的cDNA(NM_012918.3). 促进亚克隆到pcDNA3.1中+，设计引物整合5′EcoRI和3′XhoI限制位点。为了便于在pEGFP-C3中进行亚克隆，设计了包含5′EcoRI和3′BamHI限制性位点的引物。全长Cav（v）2.1构造物由大鼠钙生成v（v）2.1. 为了便于亚克隆到pAcGFP1-N2中，设计了包含5′HindIII和3′SalI限制位点的引物。设计引物克隆氨基酸710–1139（Cav（v）2.2 DII/III环）、779–1139和799–1139(NM_001042528号). 促进亚克隆到pcDNA3.1中+（Invitrogen），设计引物整合5′EcoRI和3′XhoI限制位点。为了促进pEGFP-C3（Clontech）的亚克隆，设计了包含5′EcoRI和3′BamHI限制性位点的引物。全长Cav（v）2.2个构造物由大鼠钙生成v（v）2.2. 为了便于亚克隆到pAcGFP1-N2中，设计了包含5′SalI和3′KpnI限制位点的引物。所有序列都在实验前进行了验证。

定点突变

设计用于将Y788E突变插入Ca的引物v（v）2.2 pcDNA3.1中的DII/III回路+pEGFP-C3和全长Cav（v）2.2 in pAcGFP1-N2或Y797E in Cav（v）2.1 pcDNA3.1中的DII/III回路+以及pEGFPC3和全长Cav（v）pAcGFP1-N2中的2.1与Stratagene QuikChange定点突变试剂盒和制造商的说明一起使用。所有序列都在实验前进行了验证。

体外翻译/装订

钙v（v）2.1和Cav（v）2.2个构造在体外用兔网织红细胞裂解物翻译[35S] 蛋氨酸（20μCi Redivue我-[35S] 蛋氨酸；GE Healthcare）、T7聚合酶和0.63 ng质粒DNA（TNT偶联兔网织红细胞裂解物系统；Promega）。对于结合实验，将20μg纯化的GST、锚蛋白-B膜结合结构域（MBD）-GST、锚蛋白-B结合结构域（SBD）-GST或锚蛋白-B C-末端结构域（CTD）-GST在IV结合缓冲液（50 m米三氯化氢（pH 7.35），1 m米EDTA，1米米EGTA，150米米氯化钠，0.1%Triton X-100）。在静脉注射冲洗缓冲液（50 m）中进行大量冲洗后米三氯化氢（pH 7.35），1 m米EDTA，1米米EGTA，350米米NaCl，0.1%Triton X-100），结合珠与Ca孵育v（v）2.1或Cav（v）2.2在体外翻译后的产品在4°C的IV洗涤缓冲液中过夜。将珠子在IV洗涤缓冲液中洗涤五次，洗脱并用SDS-PAGE分离。凝胶在干燥之前用考马斯蓝染色以显示GST蛋白的存在（Bio-Rad实验室）。通过磷光成像或标准放射自显影术检测放射性标记蛋白。

组织制备和均质

对于免疫印迹和免疫共沉淀（co-IP）分析，将脑组织（皮层、小脑和脑干）在液氮中骤冷并磨成细粉。将粉末重新悬浮在2体积的冰镇均质缓冲液中（50 m米三氯化氢（pH 7.35），10 m米氯化钠，0.32米蔗糖，5米米乙二胺四乙酸二乙酯，2.5米米EGTA，1米米PMSF，1米米AEBSF、10μg/ml leupeptin和10μg/ml pepstatin），并使用手持式均质机均质(27,28). 匀浆以1000倍离心克在4°C下去除细胞核。将Triton X-100和脱氧胆酸盐添加到核后上清液中，最终浓度为0.75%Triton X-100%和1%脱氧胆汁酸盐。将裂解物在4°C下高速制粒15分钟。在分析之前，通过双钦酸分析对产生的上清液进行定量。

免疫印迹

抗锚蛋白B、抗Ca的免疫印迹v（v）2.1，抗钙v（v）通过密度测定法评估抗锚蛋白G印迹，并将其表达归一化为抗GAPDH印迹(29,30). 直方图将表达式表示为野生型表达式的百分比（野生型表达式标准化为100%）。

免疫染色组织制备

从野生型和锚蛋白B中新提取的组织+/−小鼠在4%多聚甲醛中固定12h，组织分别转移到10%、20%和30%蔗糖溶液中12h。将组织冷冻切片至10μm厚。在PBS中预先阻断3 mg/ml BSA之前，在PBS中将冷冻液重新水化。在含有0.1%Triton X-100的3 mg/ml BS a的PBS中的载体中制备一级抗体，并在4°C的切片上培养过夜。载玻片在车内清洗三次，并在4°C下与Alexa Fluor驴抗兔568二级抗体孵育3小时。在车内进行三次清洗后，将载玻片安装在VectaShield（Vector Laboratories）和1号盖玻片上。使用卡尔蔡司软件在蔡司510 Meta共焦显微镜上采集图像。

来自脑裂解物的Co-IP

蛋白A结合琼脂糖珠（AffiGel；Bio-Rad）与对照Ig或抗Ca孵育v（v）2.2 Ig，抗Cav（v）2.1 Ig或抗锚蛋白B Ig在co-IP结合缓冲液（含0.1%Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）的PBS）中于4°C下放置12 h。将珠子离心并在冰镇PBS中洗涤三次。将野生型皮层、小脑或脑干组织裂解物添加到洗涤的珠子中，以及蛋白酶抑制剂混合物和co-IP结合缓冲液，并在4°C下培养12 h。反应在冰镇co-IP缓冲液中洗涤三次。样品洗脱后，用SDS-PAGE分离蛋白质，然后用锚蛋白B、Ca进行免疫印迹v（v）2.1或Cav（v）2.2磅。实验进行了多次，结果相似。由于Ca的拷贝数低v（v）2.1和Cav（v）2.2在大脑区域，裂解物输入被放大。对于Ca的实验v（v）2.1或Cav（v）2.2将免疫球蛋白固定在小球上，使用1 mg皮质和小脑裂解物，而使用2 mg脑干裂解物。输入通道占使用的总裂解液的10%。在将锚蛋白B Ig固定在小球上的实验中，每个脑区使用1 mg裂解液。输入通道占大脑皮层和小脑总裂解液的5%，占脑干总裂解物的10%。

来自转染细胞的Co-IP

蛋白A结合的琼脂糖珠与对照IgG或亲和纯化的抗锚蛋白B Ig在4°C下孵育12 h。将珠离心并在冰镇PBS中洗涤三次。将100μg转染的HEK裂解物与蛋白酶抑制剂混合物和IP缓冲液一起添加到洗涤珠中，并在4°C下培养12 h。反应在冰镇IP缓冲液中清洗三次。在用抗GFP Ig进行免疫印迹之前，洗脱样品并通过SDS-PAGE分离蛋白质。对于使用全长钙通道转染细胞的co-IP，输入通道占总裂解物输入（400μg）的20%。对于GFP-Cav（v）通道环路转染，输入通道占总裂解物输入的10%（200μg）。

下拉菜单

将100微克野生型皮层、小脑或脑干裂解物添加到10μg GST、GST-ankyrin-B MBD、GST-an kyrin-B SBD或GST-anckyrin-BCTD-结合珠中，以及500μl结合缓冲液、蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）和PMSF。反应在4°C下培养12小时。将珠子离心并在结合缓冲液中洗涤三次。蛋白质被洗脱，用SDS-PAGE分离，并用抗Ca免疫印迹v（v）2.1 Ig和抗Cav（v）2.2免疫球蛋白。

HEK293细胞培养及Ca的转染v（v）2.1和Cav（v）2.2碎片

HEK293细胞保存在补充有10%胎牛血清（FBS；HyClone）和0.1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良基本培养基（Invitrogen）中。细胞在37°C和5%CO中培养2在转染前24小时分裂培养细胞，并在转染时将其电镀以获得30%的融合。使用效应剂（Qiagen）转染含有0.2μg Ca的细胞v（v）2.2 DII/III pEGFP-C3，钙v（v）2.2 DII/III Y788E pEGFP-C3或仅pEGFP-C3。在37°C下转染7小时，细胞隔夜恢复。48h后，用2%多聚甲醛固定细胞，用ToPro染色（区分核材料），并用共焦显微镜进行评估。同样，使用钙的转染v（v）2.1 DII/III pEGFP-C3，钙v（v）2.1 DII/III Y797E pEGFP-C3和pEGFP-C3也使用相同的方案单独进行。

共焦显微镜下HEK293细胞培养和转染

HEK293细胞保存在添加10%FBS和0.1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良基本培养基中。细胞在37°C和5%CO中培养2在转染前24小时将培养细胞分离，并将其置于MatTek板上，以在转染时获得90%的融合。使用脂质体（Invitrogen）转染细胞，转染细胞中含有1μg Cav（v）2.2-GFP，1μg钙v（v）2.2 Y788E-GFP，1μg钙v（v）2.1-GFP，1μg钙v（v）2.1 Y797E-GFP或pAcGFP1-N2单独使用。在37°C下转染5小时，细胞隔夜恢复。24小时后，用2%多聚甲醛固定细胞，用VectaShield（DAPI）固定，并用共焦显微镜进行评估。

HEK293细胞培养和共免疫沉淀转染

HEK293细胞保存在添加10%FBS和0.1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良基本培养基中。细胞在37°C和5%CO中培养2在转染前24小时分裂培养细胞，并将其镀于100 mm2平板在转染时获得90%的融合。使用脂质体（Invitrogen）转染细胞，转染细胞中含有1μg Cav（v）2.2-GFP，1μg钙v（v）2.2 Y788E-GFP，1μg钙v（v）2.1-GFP，1μg钙v（v）2.1 Y797E-GFP或pAcGFP1-N2单独使用。未转染细胞作为阴性对照。在37°C下转染5小时，细胞隔夜恢复。24小时后，将细胞在IP缓冲液（25 m米三氯化氢（pH 7.4），150 m米氯化钠，1米米EDTA、1%Nonide P-40、5%甘油、蛋白酶抑制剂混合物（Sigma））并离心去除细胞碎片，然后通过双辛酸分析（Pierce）定量蛋白质。

统计

数据以平均值±S.D.表示，并使用Student’St吨测试。无效假设被拒绝第页< 0.05.

结果

钙v（v）2.1和Cav（v）2.2锚蛋白B的表达减少+/−大脑

锚蛋白是靶向可兴奋细胞离子通道的关键分子。最近的工作确定了锚蛋白B在靶向选择性电压门控钙离子方面的新作用2+心脏窦房结起搏细胞的通道(26,27). 因此，我们测试了锚蛋白B在神经系统选择性钙通道靶向中的作用。具体来说，我们调查了钙v（v）2.1和Cav（v）2.2锚蛋白B的亚基表达+/−大脑皮层、小脑和脑干。正如预期的那样，锚蛋白B的表达在锚蛋白B中显著降低+/−皮层、小脑和脑干裂解物(图1A类; 分别下降了53、52和51%；n个= 4,第页<0.0001），而相关锚蛋白基因产物锚蛋白G的表达水平(图1B类)和GAPDH（装载控制；图1E类)保持不变。我们观察到钙降低v（v）2.1锚蛋白B在皮层（41%）、小脑（20%）和脑干（35%）中的表达+/−-衍生组织与野生型裂解物的比较(图1C类;n个= 4,第页< 0.05). 钙v（v）2.2在锚蛋白B中的表达也减少+/−皮质（49%）、小脑（40%）和脑干组织（50%），与野生型同窝伴侣的裂解物相比(图1D类;n个= 4,第页< 0.05).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zbc0121476430001.jpg

钙v（v）2.1和Cav（v）2.2锚蛋白B的表达水平降低+/−大脑溶解。Ankyrin-B，钙v（v）2.1和Cav（v）2.2锚蛋白B在皮质、小脑和脑干中的表达水平显著降低+/−小鼠与野生型小鼠的比较(A类,C类、和D类）。野生型和锚蛋白B的表达没有显著差异+/−锚蛋白G的裂解物(B类)或GAPDH(E类，加载控制）。对于每个面板,n个=每个基因型4个(第页< 0.05).

根据我们的免疫印迹结果，我们对Ca的定位进行了共焦分析v（v）2.1和Cav（v）野生型和锚蛋白B中为2.2+/−小鼠小脑。在小脑中，钙v（v）2.1和Cav（v）2.2在Purkinje神经元中表达并定位于细胞体(31,32). 锚蛋白B也表达于小脑浦肯野神经元细胞体以及整个分子层(33). 如所示图2，而锚蛋白B、钙v（v）2.1和Cav（v）2.2在野生型小脑浦肯野神经元中强烈表达，我们观察到两种Ca均显著降低v（v）2.1和Cav（v）2.2表达对锚蛋白B表达减少的反应(图2).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0121476430002.jpg

安克林-B+/−小鼠表现出锚蛋白B、钙的显著降低v（v）2.1和Cav（v）2.2在小脑浦肯野神经元中的表达。 A类和B类，锚蛋白B的表达在锚蛋白B中显著降低+/−浦肯野神经元。请注意，锚蛋白B在浦肯野细胞层和分子层都表达。C–F类，加利福尼亚州v（v）2.1 (C类和D类)和钙v（v）2.2 (E类和F类)锚蛋白-B在浦肯野神经元中的表达显著降低+/−老鼠。比例尺表示20μm。克和H（H），加利福尼亚州v（v）2.1和Cav（v）2.2抗体得到验证。未转染的HEK293细胞和转染全长GFP-Ca的HEK2903细胞v（v）2.1或GFP-Cav（v）通过联合免疫沉淀或免疫印迹分析2.2(IB公司). 在克，加利福尼亚州v（v）2.1 Ig识别GFP-Cav（v）2.1但不是GFP-Cav（v）2.2. 在H（H），加利福尼亚州v（v）2.2 Ig识别GFP-Cav（v）2.2，但不是GFP-Cav（v）2.1.

钙不需要Ankyrin-Gv（v）2.1或Cav（v）2.2表达式

尽管由不同的基因编码，但锚蛋白B和锚蛋白G显示出相似的结构域组织，并且在不同的可兴奋细胞类型中靶向离子通道和转运蛋白(2). 由于锚蛋白-B和锚蛋白-G在含有Ca的细胞类型中共同表达v（v）2.1和Cav（v）2.2，我们评估了钙是否需要锚蛋白Gv（v）2.1和Cav（v）2.2表达如锚蛋白B所示(图1和​和2）。2). 与锚蛋白B缺乏组织的发现相反，我们观察到Cav（v）2.1或Cav（v）2.2小脑锚蛋白G无突变纯合小鼠模型产生的小脑裂解物中的表达(图3和参考。20). 这些数据表明，调节钙需要锚蛋白B，而不是锚蛋白Gv（v）2.1和Cav（v）2.2在小脑中表达。此外，这些数据表明锚蛋白G和B在脑内钙通道靶向中发挥非冗余作用。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0121476430003.jpg

钙不需要Ankyrin-Gv（v）2.1或Cav（v）2.2表达式。尽管ankyrin-G小脑特异性敲除小鼠的ankylin-G表达显著降低(A类)，Ca的表达没有显著差异v（v）2.1或Cav（v）2.2野生型和锚蛋白-G小脑特异性敲除小脑裂解物之间(A类和B类,n个= 4;不适用。). 通过免疫印迹检测，在锚蛋白-G小脑特异性敲除小鼠中的锚蛋白-G水平显著降低，并且与背景相似。

Ankyrin-B与Ca相关v（v）2.1和Cav（v）大脑中的2.2

考虑到Cav（v）2.1和Cav（v）2.2锚蛋白B的表达水平显著降低+/−脑组织(图1和​和2），2)，我们评估了锚蛋白B与钙结合的能力v（v）2.1和Cav（v）2.2在大脑中。使用成年小鼠皮层、小脑和脑干的洗涤剂可溶性裂解物进行Co-IP分析，结果表明亲和力纯化的抗Cav（v）2.1来自皮层的免疫球蛋白共沉淀锚蛋白B(图4A类)，小脑(图4B类)和脑干(图4C类). 同样，抗Cav（v）2.2来自皮层、小脑和脑干裂解物的免疫球蛋白共沉淀锚蛋白B(图4,D–F型). 我们在任何组织裂解物中均未观察到锚蛋白B和对照Ig之间的相互作用(图4,A–F). 为了证实这种相互作用，我们利用亲和纯化的锚蛋白-B免疫球蛋白进行相互联合免疫沉淀。锚蛋白-B免疫球蛋白协同免疫沉淀钙v（v）2.1和Cav（v）2.2来自皮质、小脑和脑干的洗涤剂可溶性裂解物，而我们观察到与对照Ig没有相互作用(图4,G–L). 这些数据共同支持体内锚蛋白B与钙的相互作用v（v）2.1，以及体内锚蛋白B与钙的相互作用v（v）2.2，在小鼠皮层、小脑和脑干。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0121476430004.jpg

钙与锚蛋白-B共同免疫沉淀物v（v）2.1和Cav（v）2.2. A–F，加利福尼亚州v（v）2.1 Ig和Cav（v）2.2来自皮质洗涤剂可溶性裂解物的免疫球蛋白共沉淀锚蛋白B(A类和D类)，小脑(B类和E类)和脑干(C类和F类)分别为。未观察到与对照组的显著交互作用(Ctrl键)免疫球蛋白。G–L，锚蛋白-G-Ig协同免疫沉淀物Cav（v）2.1和Cav（v）2.2来自皮层的洗涤剂可溶性裂解物(克和J)，小脑(H（H）和K（K）)和脑干(我和L（左）)分别为。未观察到与对照Ig的显著交互作用。IB公司，免疫印迹。

我们进一步评估了神经元锚蛋白B/Cav（v）2.1和锚蛋白B/Cav（v）2.2使用小鼠洗涤剂可溶皮层、小脑和脑干裂解物的下拉实验进行相互作用。锚蛋白B由三个不同的结构域组成：MBD、SBD和CTD(图5A类). 值得注意的是，GST-ankyrin-B MBD，但GST-ankyrin-B SBD或GST-ankyrin-B CTD均未与Ca相互作用v（v）2.1和Cav（v）皮质2.2(图5B类)，小脑(图5C类)和脑干(图5D类; 融合蛋白显示在图5E类). 总的来说，这些数据表明钙之间的相互作用v（v）2.1和Cav（v）2.2和锚蛋白B位于大脑的多个区域。这些数据进一步确定了钙对锚蛋白B的结构要求v（v）通道绑定为澳大利亚国家银行膜结合域的重复。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0121476430005.jpg

Ankyrin-B与Ca结合v（v）2.1和Cav（v）2.2. A类，锚蛋白B包括膜结合域、光谱结合域和C末端调控域。B–D类，GST-ankyrin-B MBD与Cav（v）2.1和Cav（v）2.2来自皮层的洗涤剂可溶性裂解物(B类)，小脑(C类)和脑干(D类). 未观察到裂解产物与GST-ankyrin-B SBD、GST-ankin-B CTD或仅GST之间的相互作用。E类，GST融合蛋白用于下拉实验。从细菌中纯化融合蛋白并通过考马斯蓝染色进行分析。GST在29kDa迁移，GST-ankyrin-B MBD在94kDa移动。GST-ankyrin-B SBD在62kDa迁移，GST-anckyrin-BCTD在79kDa移动。

锚蛋白-B与钙的相互作用v（v）2.1和Cav（v）2.2 DII/III回路

接下来，我们评估了Ca的需求v（v）2.1和Cav（v）2.2用于神经元锚蛋白B结合。先前的研究表明，Ca的DII/III环区中的一个区域v（v）2.2包含假定在钙通道靶向中发挥作用的区域(34) (图6,A类和B类). 这个DII/III区域包含一个在物种间高度保守的20氨基酸基序(图6,C类和D类). 基于Ca的三种结构v（v）2.1和Cav（v）设计2.2个序列来评估该基序在锚蛋白B/Ca中的作用v（v）2.1和锚蛋白B/Cav（v）2.2关联(图6,E类和F类). 第一个结构包括整个DII/III回路（Cav（v）2.1氨基酸708–1194；钙v（v）2.2氨基酸710–1139）；第二个启动于假定的锚蛋白结合基序（ABM；Cav（v）2.1氨基酸788–1194；钙v（v）2.2氨基酸779–1139）；第三个开始在ABM的远端（Cav（v）2.1氨基酸808–1194；钙v（v）2.2氨基酸799–1139）。体外与固定化GST-锚蛋白-B MBD结合表明，全长Cav（v）2.1 DII/III回路和Cav（v）2.1含有788–1194残基的构建物显示了GST-锚蛋白-B MBD的结合活性(图6克). 相反，Cav（v）2.1缺失残基788–808的结构体（结构体808–1194）具有与GST类似的结合活性(图6克). 同样，全长Cav（v）2.2 DII/III回路和Cav（v）2.2含有残基779–799的结构体（结构体779–1139）显示了对GST-锚蛋白-B MBD的结合活性(图6H（H）). 加利福尼亚州v（v）2.2缺失残基779–799的结构体（结构体799–1139）具有与GST类似的结合活性(图6H（H）). 这些数据确定了Ca和Ca中的20个氨基酸基序v（v）2.1和Cav（v）2.2与锚蛋白B相互作用所必需的DII/III环。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0121476430006.jpg

钙v（v）2.1和Cav（v）2.2 DII/DIII基序与锚定蛋白B相关。 A类和B类，推定ABM在Ca的DII/DIII细胞质环中的位置v（v）2.1和Cav（v）如图2.2所示。C类和D类Ca中的假定ABMv（v）2.1和Cav（v）2.2在物种间保守，并含有一个中心保守的酪氨酸(粗体的).E类和F类，设计了三个结构体来评估该氨基酸序列在锚蛋白B结合中的作用。这些结构包括整个DII/III循环、在假定的ABM之前开始的循环的一部分，以及在推定的ABM之后开始的循环部分。克和H（H）,在体外结合分析表明，钙的全长DII/III环v（v）2.1和Cav（v）2.2和含有推定ABM的较小环部分能够与GST-ankyrin-B MBD结合，缺乏该结构域的较小环部分显示不与GST-ankyrin-B MBD结合。我和J考马斯蓝染色显示，在成像之前对GST结构进行了等量加载（表示为星号).

保守的酪氨酸残基调节与锚蛋白B的关联

虽然钙通道的抑制是电压依赖性的，但它是由G蛋白βγ亚基与通道的α1孔形成亚基直接相互作用介导的(35,36). 此外，酪氨酸激酶的磷酸化被证明可以抑制钙通道(37)G蛋白依赖性抑制钙电流，部分原因是通道开放概率降低，导致电流密度降低(38,–40). 我们之前在Ca的DII/III环中定义了一个20氨基酸基序v（v）2.1和Cav（v）与锚蛋白B相关的2.2(图6). 值得注意的是，该基序包含一个保守的酪氨酸残基。评估酪氨酸在钙调节中的作用v（v）2.1和Cav（v）2.2与锚蛋白B相关，我们将Y797E突变纳入Cav（v）2.1 DII/III回路并评估其对在体外绑定(图7A类). Tyr-797残基突变为谷氨酸导致与GST-锚蛋白B MBD失去关联在体外结合分析(图7B类). Ca中类似残基Tyr-788的突变v（v）2.2 DII/III转化为谷氨酸(图7D类)表现出类似的损失在体外与GST-ankyrin-B MBD结合(图7E类).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0121476430007.jpg

钙中一个保守的酪氨酸残基v（v）2.1和Cav（v）2.2锚蛋白-B相互作用需要DII/III回路在体外. A类和D类，加利福尼亚州v（v）2.1和Cav（v）2.2 DII/III环域包含一个保守的酪氨酸残基，该残基经实验突变为谷氨酸以评估锚蛋白B结合。B类，GST-ankyrin-B MBD能够与Ca结合v（v）2.1 DII/III环域。相反，与含有Y797E突变的结构域失去相互作用。仅与GST没有明显的约束力。E类，加利福尼亚州v（v）2.2显示了与GST-ankyrin-B MBD相关的DII/III环域。然而，GST-ankyrin-B MBD和Ca之间没有明显的相关性v（v）2.2 DII/III Y788E。仅与GST没有可检测的结合。C类和F类考马斯蓝染色显示，在成像之前进行了GST结构的等量加载。

DII/DIII酪氨酸残留物对钙至关重要v（v）2.1/Ca（加利福尼亚州）v（v）2.2目标

锚蛋白对于靶向包括神经元在内的多种细胞类型的离子通道和转运蛋白至关重要。事实上，在异源细胞和原代培养物中，仅离子通道或转运体锚蛋白结合基序就足以靶向GFP和其他标记物(41). 因此，我们测试了（i）Ca的DII/DIII回路v（v）2.1和Cav（v）2.2（含有锚蛋白结合基序）足以作为HEK293细胞中的主要靶信号，以及（ii）每个通道中的单个酪氨酸突变是否改变了这种运输模式。来自Ca的DII/DIII回路v（v）2.1和Cav（v）2.2亚克隆到pEGFP-C3表达载体中，并转染到HEK293细胞（表达内源性锚蛋白B）。共聚焦分析显示，与仅在HEK293细胞核中发现的GFP不同(图8,A类和D类)、GFP-Cav（v）2.1 DII/III回路和GFP-Cav（v）2.2 DII/III实际上是针对核外的(与GFP）并在整个细胞中呈弥漫型表达(图8,B类和E类). 与这些发现一致，GFP-Cav（v）2.1 DII/III回路和GFP-Cav（v）2.2转染细胞平行co-IP实验中DII/III环与锚蛋白B相互作用(图8,G–I). 相反，GFP-Cav（v）2.1 DII/III Y797E和GFP-Cav（v）2.2 DII/III Y788E缺乏锚蛋白-B结合活性(图8,G–I)局限于紧密一致的核周分布(图8,C类和F类). 这些数据表明Cav（v）2.1和Cav（v）2.2 DII/DIII环含有主要的靶向基序，使其偏离细胞核。此外，这些数据暗示了Ca中的Tyr-797v（v）2.1和Ca中的Tyr-788残留物v（v）2.2是调节钙通道靶向性的关键成分。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0121476430008.jpg

钙v（v）2.1/Ca（加利福尼亚州）v（v）ABM中2.2个酪氨酸残基对细胞靶向至关重要。转染pEGFP-C3的HEK293细胞显示出主要的核定位模式(A类和D类)而转染Ca的HEK293细胞v（v）2.1 DII/III-GFP(B类)或Cav（v）2.2 DII/III-GFP(E类)显示了细胞核特有的弥散细胞表达模式。C类和F类与WT构造不同，Ca和v（v）2.1 Y797E-GFP和Cav（v）2.2 Y788E-GFP呈紧密的核周型分布。比例尺表示8μm。G–I，Ca中保守的酪氨酸残基v（v）2.1和Cav（v）2.2锚蛋白-B相互作用需要DII/III回路在体外。克在对照实验中，锚蛋白B Ig与HEK293细胞中表达的GFP没有相互作用。H（H）和我，锚蛋白-B-Ig共同免疫沉淀GFP融合蛋白，该融合蛋白含有Cav（v）2.1或Cav（v）2.2转染HEK293细胞的DII/DII环。相比之下，锚蛋白B Ig不会协同免疫沉淀Ca的GFP融合蛋白v（v）2.1 DII/DIII Y797E或Cav（v）2.2平行实验中的DII/III Y788E。IB公司，免疫印迹。

我们在全长Ca的背景下证实了这些发现v（v）2.1和Cav（v）2.2. 我们观察到两种GFP-Cav（v）2.1和GFP-Cav（v）2.2在转染的HEK293细胞中扩散表达，而GFP-Cav（v）2.1 Y797E和全长GFP-Cav（v）2.2 Y788E显示异常靶向性，核周呈簇状分布(图9,A–E). 与这些发现一致，而GFP-Cav（v）2.1和GFP-Cav（v）2.2在co-IP实验中与锚蛋白B相关，锚蛋白B Ig不能与全长GFP-Ca共免疫沉淀v（v）2.1 Y797E或全长GFP-Cav（v）2.2来自HEK293细胞裂解物的Y788E(图9,F–H（飞行高度）). 这些结果进一步支持了锚蛋白B介导的钙的关键作用v（v）2.1和Cav（v）2.2表达和靶向。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0121476430009.jpg

钙v（v）2.1/钙v（v）ABM中2.2个酪氨酸残基对细胞靶向和锚蛋白相互作用至关重要。 A类，转染pEGFP-C3的HEK293细胞显示出主要的核定位模式。B类和D类相反，转染全长GFP-Ca的HEK293细胞v（v）2.1 (B类)或GFP-Cav（v）2.2 (D类)表现出细胞核或核周区域特有的弥漫性细胞表达模式。C类和E类不同于WT-Cav（v）2.1和Cav（v）2.2个构造，均为全长GFP-Cav（v）2.1 Y797E和全长GFP-Cav（v）2.2 Y788E-GFP以紧密的核周模式分布(白色箭头).比例尺表示8μm。F类对照实验表明，锚蛋白B Ig与GFP无关。克，锚蛋白B协同免疫沉淀物全长GFP-Cav（v）2.1，但不是全长GFP-Cav（v）2.1来自转染HEK293裂解物的Y797E。H（H），锚蛋白B协同免疫沉淀物全长GFP-Cav（v）2.2，但不是全长GFP-Cav（v）2.2来自转染HEK293裂解物的Y788E。

讨论

我们的发现证明了锚蛋白B对钙的作用v（v）2.1和Cav（v）2.2脑内通道表达和靶向。锚蛋白B的缺失导致Ca的表达减少v（v）2.1和Cav（v）皮层、小脑和脑干中2.2个。此外，Ca中单个残基的突变v（v）2.1和Cav（v）2.2 DII/III环导致与锚蛋白B失去关联和异常细胞靶向。锚蛋白B已被证明在建立和维持大脑中的可兴奋区域中发挥关键作用。小鼠锚蛋白B的丢失会导致明显的神经系统缺陷，包括胼胝体和锥体束发育不良、侧脑室扩张和长轴索束退化(25). 具体来说，这些表型与整个大脑中L1CAM蛋白的丢失有关。有趣的是，人类的突变L1CAM公司基因导致精神发育迟缓以及一系列神经症状，称为CRASH综合征（胼胝体发育不全、发育迟缓、失语症、痉挛性截瘫和脑积水）(42). 锚蛋白B−/−小鼠模型虽然在出生后第1天是致命的，但表现出轴突L1CAM丢失，并表现出许多碰撞症状，尽管严重程度更高(25). 没有人的锚蛋白B基因突变为零(ANK2银行)已确定；然而，考虑到杂合子个体在ANK2银行基因存在于人群中(43)在心律失常表型的患者中发现(26,44,–47)，罕见的纯合子或混合杂合子可能会出现碰撞症状。人类S1224L和Y1229H突变L1CAM公司基因与CRASH综合征相关(48). 此外，这些突变位于高度保守的锚蛋白结合位点内，并消除了L1与锚蛋白-B的结合(48).

钙v（v）2.1和Cav（v）2.2脑内的通道活动是正确启动突触传递所必需的。钙v（v）2.2−/−动物表现出正常的运动协调；然而，这些小鼠对疼痛刺激的反应减弱(49)和侵略升级(50). 钙v（v）2.1−/−动物在出生后第10-12天出现肌张力障碍，断奶后很少存活(51). 同样，Cav（v）2.1−/−小鼠对疼痛刺激的反应减弱(52). 如上所述，锚蛋白B−/−出生时死亡，因此我们目前缺乏有关体内成年小鼠锚蛋白B缺乏症的表型。在出生后的小鼠中使用可诱导锚蛋白B敲除策略的未来研究将对理解这种细胞骨架蛋白在突触功能中的作用非常重要。

最后，尽管我们的数据通过Ca的DII/DIII环将锚蛋白B与靶向调控联系起来v（v）2.1和Cav（v）2.2通过特定的酪氨酸残基，该环中的其他蛋白质相互作用也可能在离子通道处理和膜调节中发挥关键作用。例如，Cav（v）2.2 DII/DIII循环维持与Ca相连的SNARE结合或合成蛋白区域v（v）频道定位(34). 理解钙的潜在双重调节在未来的工作中非常重要v（v）通过锚蛋白和其他蛋白质进行通道靶向。

*这项工作得到了国立卫生研究院HL084583、HL083422和HL114383（致P.J.M.）以及HL096805和HL114893（致T.J.H.）的全部或部分支持。这项工作还得到了美国心脏协会（P.J.M.）、拯救微小心脏协会（P.J.M。

2使用的缩写如下：

虚拟数据中心
电压依赖性钙通道
反导
锚蛋白结合基序
CTD公司
C端域
IP（IP）
免疫沉淀
MBD公司
膜结合域
SBD公司
光谱结合域。

参考文献

1Cheever T.R.、Ervasti J.M.（2013）神经元发育和功能中的肌动蛋白亚型.细胞分子生物学内部收益.301, 157–213 [公共医学][谷歌学者]
2Bennett V.、Healy J.（2008）组织液膜双层：与spectrin和ankyrin相关的疾病.摩尔医学趋势.14, 28–36 [公共医学][谷歌学者]
三。Dunlap K.、Luebke J.I.、Turner T.J.（1995）胞外钙2+哺乳动物中枢神经元的通道.神经科学趋势.18, 89–98 [公共医学][谷歌学者]
4卡特尔·W·A（2000）电压门控钙的结构与调节2+通道.每年。Rev.细胞发育生物学.16, 521–555 [公共医学][谷歌学者]
5Clapham D.E.（1995）钙信号.单元格 80, 259–268 [公共医学][谷歌学者]
6Snutch T.P.、Reiner P.B.（1992年）钙2+渠道：形式和功能的多样性.货币。操作。神经生物学.2, 247–253 [公共医学][谷歌学者]
7Tedford H.W.，Zamponi G.W.（2006）钙的直接G蛋白调节v（v）2个钙通道.药理学。利润.58, 837–862 [公共医学][谷歌学者]
8Tsien R.W.、Lipscombe D.、Madison D.V.、Bley K.R.、Fox A.P.（1988）多种类型的神经元钙通道及其选择性调节.神经科学趋势.11, 431–438 [公共医学][谷歌学者]
9Miller R.J.（1997）钙通道被证明是一个真正的头痛.神经科学趋势.20, 189–192 [公共医学][谷歌学者]
10Ellinor P.T.、Zhang J.F.、Randall A.D.、Zhou M.、Schwarz T.L.、Tsien R.W.、Horne W.A.（1993）快速失活神经元钙通道的功能表达.自然 363, 455–458 [公共医学][谷歌学者]
11.Fox A.P.、Nowycky M.C.、Tsien R.W.（1987）区分鸡感觉神经元三种钙电流的动力学和药理学特性.生理学杂志.394, 149–172[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Usowicz M.M.、Sugimori M.、Cherksey B.、Llinás R.（1992）成年小脑浦肯野细胞胞体和树突中的P型钙通道.神经元 9, 1185–1199 [公共医学][谷歌学者]
13惠勒·D·B、兰德尔·A、钱瑞伟（1994）N型和Q型钙的作用2+支持海马突触传递的通道.科学类 264, 107–111 [公共医学][谷歌学者]
14Takahashi T.、Momiyama A.（1993）不同类型的钙通道介导中枢突触传递.自然 366, 156–158 [公共医学][谷歌学者]
15Nooney J.M.，Lodge D.（1996年）利用无脊椎动物肽毒素建立钙2+大鼠海马脑片CA3-CA1神经递质的通道特性.欧洲药理学杂志.306, 41–50 [公共医学][谷歌学者]
16Olivera B.M.、Miljanich G.P.、Ramachandran J.、Adams M.E.（1994）钙通道多样性与神经递质释放：ω-芋螺毒素和ω-琼脂毒素.每年。生物化学评论.63, 823–867 [公共医学][谷歌学者]
17.Leroy J.、Richards M.S.、Butcher A.J.、Nieto-Rostro M.、Pratt W.S.、Davies A.、Dolphin A.C.（2005）β1需要通过N型钙通道I-II连接子中的关键色氨酸进行相互作用，而棕榈酰化β2则不需要，这意味着在调节通道电压依赖性特性时需要额外的结合位点.神经科学杂志.25, 6984–6996[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Davies A.、Hendrich J.、Van Minh A.T.、Wratten J.、Douglas L.、Dolphin A.C.（2007）α的功能生物学2电压门控钙通道的δ亚基.趋势药理学。科学.28, 220–228 [公共医学][谷歌学者]
19Bennett V.、Baines A.J.（2001）基于镜蛋白和锚蛋白的途径：后生动物将细胞整合到组织中的发明.生理学。利润.81, 1353–1392 [公共医学][谷歌学者]
20Zhou D.、Lambert S.、Malen P.L.、Carpenter S.、Boland L.M.、Bennett V.（1998）Ankyrin-G是轴突起始段电压门控钠通道聚集和正常动作电位放电所必需的.细胞生物学杂志.143, 1295–1304[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21Jenkins S.M.、Bennett V.（2001）Ankyrin-G在Purkinje神经元起始段协调基于光谱的膜骨架、电压门控钠通道和L1 CAM的组装.细胞生物学杂志.155, 739–746[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Pan Z.、Kao T.、Horvath Z.、Lemos J.、Sul J.Y.、Cranstoun S.D.、Bennett V.、Scherer S.S.、Cooper E.C.（2006）一种常见的基于锚蛋白G的机制保留KCNQ和NaV（V）轴突电活动区的通道.神经科学杂志.26, 2599–2613[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Ango F.、di Cristo G.、Higashiyama H.、Bennett V.、Wu P.、Huang Z.J.（2004）神经筋膜蛋白（一种免疫球蛋白家族蛋白）基于锚蛋白的亚细胞梯度在浦肯野轴突起始段指导GABA能神经支配.单元格 119, 257–272 [公共医学][谷歌学者]
24Galiano M.R.、Jha S.、Ho T.S.、Zhang C.、Ogawa Y.、Chang K.J.、Stankewich M.C.、Mohler P.J.、Rasband M.N.（2012）远端轴突细胞骨架形成控制轴突初始节段组装的轴突内边界.单元格 149, 1125–1139[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Scotland P.、Zhou D.、Benveniste H.、Bennett V.（1998）锚蛋白B的神经系统缺陷−/−小鼠提示前髓鞘轴突中细胞粘附分子L1和440-kD锚蛋白B之间存在功能重叠.细胞生物学杂志.143, 1305–1315[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
26Le Scowarnec S.、Bhasin N.、Vieyres C.、Hund T.J.、Cunha S.R.、Koval O.、Marionneau C.、Chen B.、Wu Y.、Demolombe S.、Song L.S.、Le Marec H.、Probst V.、Schott J.、Anderson M.E.、Mohler P.J.（2008）锚蛋白B依赖性离子通道和转运体靶向功能异常导致人类窦房结疾病.程序。国家。阿卡德。科学。美国.105, 15617–15622[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
27Cunha S.R.、Hund T.J.、Hashemi S.、Voigt N.、Li N.、Wright P.、Koval O.、Li J.，Gudmundsson H.、Gumina R.J.和Karck M.、Schott J.、Probst V.、Le Marec H.、Anderson M.E.、Dobrev D.、Wehrens X.H.、Mohler P.J.（2011）心房颤动的锚蛋白膜蛋白靶向通路缺陷.循环 124, 1212–1222[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
28Abdi K.M.、Mohler P.J.、Davis J.Q.、Bennett V.（2006）锚蛋白B的同构特异性：分子内结合需要发散C末端结构域中的一个位点.生物学杂志。化学.281, 5741–5749 [公共医学][谷歌学者]
29Cunha S.R.、Bhasin N.、Mohler P.J.（2007）心肌细胞中Na/Ca交换器1的靶向性和稳定性需要与膜适配器锚蛋白B直接相互作用.生物学杂志。化学.282, 4875–4883 [公共医学][谷歌学者]
30Cunha S.R.、Mohler P.J.（2008）昏迷素靶向心脏M线的锚蛋白B和蛋白磷酸酶2A.生物学杂志。化学.283, 31968–31980[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Westenbroek R.E.、Sakurai T.、Elliott E.M.、Hell J.W.、Starr T.V.、Snutch T.P.、Catterall W.A.（1995）α的免疫化学鉴定和亚细胞分布1安培脑钙通道亚单位.神经科学杂志.15, 6403–6418[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
32Indriati D.W.、Kamasawa N.、Matsui K.、Meredith A.L.、Watanabe M.、Shigemoto R.（2013）钙的定量定位v（v）2.1（P/Q型）Purkinje细胞中电压依赖性钙通道：体细胞密度梯度和与钙激活钾通道的明显体细胞共聚集.神经科学杂志.33, 3668–3678[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Kordeli E.、Davis J.、Trapp B.、Bennett V.（1990）锚蛋白的一种亚型定位于中枢和外周神经有髓轴突的Ranvier节点.细胞生物学杂志.110, 1341–1352[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
34Mochida S.、Westenbroek R.E.、Yokoyama C.T.、Zhong H.、Myers S.J.、Scheuer T.、Itoh K.、Catterall W.A.（2003）P/Q型钙通道重建突触传递对突触蛋白相互作用位点的需求.程序。国家。阿卡德。科学。美国.100, 2819–2824[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35池田S.R.（1996）G蛋白βγ亚基对N型钙通道的电压依赖性调节.自然 380, 255–258 [公共医学][谷歌学者]
36Herlitze S.、Garcia D.E.、Mackie K.、Hille B.、Scheuer T.、Catterall W.A.（1996）钙的调制2+G蛋白βγ亚基通道.自然 380, 258–262 [公共医学][谷歌学者]
37海豚A.C.（2003）电压门控钙通道的G蛋白调节.药理学。利润.55, 607–627 [公共医学][谷歌学者]
38Yue D.T.、Backx P.H.、Imredy J.P.（1990）钙敏感性失活在单钙通道门控中的作用.科学类 250, 1735–1738 [公共医学][谷歌学者]
39Delcour A.H.，Tsien R.W.（1993）N型钙通道神经递质抑制中门控模式的改变.科学类 259, 980–984 [公共医学][谷歌学者]
40Patil P.G.、de Leon M.、Reed R.R.、Dubel S.、Snutch T.P.、Yue D.T.（1996）电压依赖性G蛋白抑制N型钙通道的基本事件.生物物理学。J.71, 2509–2521[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
41Garrido J.J.、Giraud P.、Carlier E.、Fernandes F.、Moussif A.、Fache M.P.，Debanne D.、Dargent B.（2003）轴突起始段钠通道聚集的靶向基序.科学类 300, 2091–2094 [公共医学][谷歌学者]
42Fransen E.、Van Camp G.、Vits L.、Willems P.J.（1997）L1相关疾病：临床遗传学家分裂，分子遗传学家联合.嗯，摩尔基因.6, 1625–1632 [公共医学][谷歌学者]
43Mohler P.J.、Healy J.A.、Xue H.、Puca A.A.、Kline C.F.、Allingham R.R.、Kranias E.G.、Rockman H.A.、Bennett V.（2007）Ankyrin-B综合征：心脏功能增强与心脏死亡和过早衰老风险相平衡.公共科学图书馆 2，e1051。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
44.Mohler P.J.、Le Scourantec S.、Denjoy I.、Lowe J.S.、Guicheney P.、Caron L.、Driskell I.M.、Schott J.、Norris K.、Leenhardt A.、Kim R.B.、Escande D.、Roden D.M.（2007）定义“ankyrin-B综合征”变体的细胞表型：与临床表型相关的人类ANK2变体显示心肌细胞的活性谱.循环 115, 432–441 [公共医学][谷歌学者]
45Mohler P.J.、Schott J.J.，Gramolini A.O.、Dilly K.W.、Guatimosim S.、duBell W.H.、Song L.S.、HaurognéK.、Kyndt F.、Ali M.E.、Rogers T.B.、Lederer W.J.、Escande D.、Le Marec H.、Bennett V.（2003）Ankyrin-B突变导致4型长QT心律失常和心源性猝死.自然 421, 634–639 [公共医学][谷歌学者]
46.Mohler P.J.，特拉福德A.W.（2011）问题在于细节：方法审查，一项新的JMCC倡议.分子细胞杂志。心脏病.50, 939. [公共医学][谷歌学者]
47.Sedlacek K.、Stark K.，Cunha S.R.、Pfeufer A.、Weber S.、Berger I.、Perz S.、Kaäb S.、Wichmann H.E.、Mohler P.J.、Hengstenberg C.、Jeron A.（2008）ANK2常见基因变异调节QT间期：KORA研究结果.循环。心血管疾病。基因.1, 93–99 [公共医学][谷歌学者]
48Needham L.K.、Thelen K.和Maness P.F.（2001）L1细胞黏附分子的细胞质域突变减少L1-联吡啶相互作用.神经科学杂志.21, 1490–1500[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
49Kim C.、Jun K.、Lee T.、Kim S.S.、McEnery M.W.、Chin H.、Kin H.L.、Park J.M.、Kid D.K.、Jung S.J.、Kik J.、Shin H.S.（2001）α缺陷小鼠的伤害性反应改变1B年电压依赖性钙通道亚单位.分子细胞。神经科学.18, 235–245 [公共医学][谷歌学者]
50Kim C.、Jeon D.、Kim Y.H.、Lee C.J.、Kim H.、Shin H.S.（2009）N型钙的缺失2+通道Cav（v）2.2小鼠过度攻击行为的结果.生物学杂志。化学.284, 2738–2745 [公共医学][谷歌学者]
51Jun K.、Piedras-Rentera E.S.、Smith S.M.、Wheeler D.B.、Lee S.B.、Lee T.G.、Chin H.、Adams M.E.、Scheller R.H.、Tsien R.W.、Shin H.S.（1999）P/Q型钙的烧蚀2+缺乏α的小鼠的通道电流、突触传递改变和进行性共济失调1安培-亚单位.程序。国家。阿卡德。科学。美国.96, 15245–15250[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
52Luvisetto S.、Marinelli S.、Panasiti M.S.、D’Amato F.R.、Fletcher C.F.、Pavone F.、Pietrobon D.（2006）缺钙小鼠的痛觉敏感性v（v）2.1 P/Q型Ca的α1亚基2+通道.神经科学 142, 823–832 [公共医学][谷歌学者]
来自的文章生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会