生物化学杂志。2014年2月21日；289(8): 5240–5249.
一种新型β的表征-我-阿拉伯呋喃糖苷酶长双歧杆菌
DUF1680蛋白家族成员的功能性分离*
,1 , , ,和
藤田清彦
来自日本鹿儿岛890-0065，Korimoto，鹿儿岛大学农业学院
尤卡里·塔卡西
来自日本鹿儿岛890-0065，Korimoto，鹿儿岛大学农业学院
小渊惠子
来自日本鹿儿岛890-0065，Korimoto，鹿儿岛大学农业学院
Kanefumi Kitahara北原
来自日本鹿儿岛890-0065，Korimoto，鹿儿岛大学农业学院
铃木俊彦
来自日本鹿儿岛县栗本市鹿儿岛大学农业学院890-0065
来自日本鹿儿岛890-0065，Korimoto，鹿儿岛大学农业学院
2013年10月25日收到；2013年12月24日修订
- 补充资料
补充数据
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GUID:8B0F079C-1B4C-492B-A40E-A7C387BEC512
背景：β-我-许多植物生物聚合物中都存在阿糖呋喃糖键，但从未发现降解酶。
结果：一个新的β-我-阿拉伯呋喃糖苷酶发现于长双歧杆菌.
结论：β-我-阿糖呋喃苷酶在长双歧杆菌对于β-我-阿拉伯寡糖的用法。
意义：DUF1680家族成员可用于降解植物生物聚合物。
关键词：细菌、克隆、酶催化、酶动力学、糖苷酶、水解酶、羟脯氨酸、诱变、蛋白质表达
摘要
Pfam DUF1680（PF07944）是一个在许多细菌、放线菌、真菌和植物中保存的无特征蛋白家族。之前，我们克隆了hypBA2基因作为aβ-我-阿拉伯糖苷酶长双歧杆菌JCM 1217。在这项研究中，我们克隆了DUF1680家族成员hypBA1型基因，它与hypBA2型HypBA1是一种新型β-我-释放的阿拉伯呋喃糖苷酶我-阿拉伯糖我-阿拉伯呋喃糖（Ara（f）)-β1,2-阿拉伯（f）双糖。HypBA1还具有反糖基化1-烷醇，保留了异戊构型。突变和叠氮化物解救实验表明，Glu-338是催化活性的关键残基。本研究首次描述了DUF1680家族成员的特征，该家族定义了一个新的糖苷水解酶家族，即糖苷水解酶家族127。
关键词：细菌、克隆、酶催化、酶动力学、糖苷酶、水解酶、羟脯氨酸、诱变、蛋白质表达
介绍
β-我-在伸展蛋白和茄科凝集素的糖链中发现了阿糖呋喃糖基与1–4个阿糖呋糖苷的连接(1,2). 延伸蛋白和茄科凝集素是羟脯氨酸（Hyp）的成员2-广泛存在于植物细胞壁组分中的丰富糖蛋白。此外，末端β-我-timothy草花粉中的阿拉伯半乳糖蛋白中发现了阿拉伯呋喃糖残基(三)，鼠李糖乳聚糖-II(4,–6)，橄榄阿拉伯糖(7)，阿拉伯葡聚糖来自当归(8)和番茄阿拉伯木聚糖(9). 然而，尽管β-我-植物细胞中的阿拉伯呋喃糖基残基&降解酶β-我-阿拉伯呋喃糖苷酶（酶代码EC3.2.1.185）三从未发现。
最近，我们克隆了一个hypBA2编码新β的基因-我-阿拉伯糖苷酶长双歧杆菌JCM 1217基于BL0421序列长双歧杆菌NCC2705，属于糖苷水解酶（GH）家族121(10). 酶释放Ara如果-β1,2-Ara（f）二糖（β-Ara2)来自Ara如果-β1,2-Ara如果-β1,2-Ara（f）β-Hyp（Ara三-Hyp）。因为释放了β-Ara2应该被自身的酶水解以同化，我们预测长双歧杆菌有一个编码β的基因-我-阿拉伯呋喃糖苷酶。BL0422是BL0421和BL0420基因簇的一部分，在Pfam数据库（PF07944）中包含一个未知功能域（DUF）1680家族，这是一个被注释为推定的未知功能糖基水解酶的大家族。
在本研究中，我们克隆了BL0422同源基因长双歧杆菌JCM 1217并将重组蛋白表征为新β-我-阿拉伯呋喃糖苷酶。这是首次报道DUF1680家族成员的特征。
实验程序
材料
伸展蛋白，马铃薯凝集素，Hyp-linkedβ-我-阿拉伯寡糖，β-Ara2和Ara如果-β1,2-Ara（f）β-OMe（Ara2-Me）按照前面所述进行准备(10). Dansylated Hyp-linkedβ-我-阿拉伯寡糖的制备如格雷所述(11).第页-硝基苯(第页NP）底物来自Sigma。我-阿拉伯糖来自Wako Chemicals。底物的化学结构如所示如前所述表达并纯化HypBA2-CΔ486(10).
β的化学结构-我-本研究中使用的阿拉伯寡糖。这个箭头指示HypBA1的裂解位点。
重组HypBA1的表达与纯化
的基因组DNA长双歧杆菌使用FastPure DNA试剂盒（Takara）提取JCM 1217，然后用于BL0422同源基因的PCR扩增，hypBA1型分别从BL0422的核苷酸4–22和1959–1974设计正向（5′-AAGGATATATATAGAACGTTACAATCATCCC-3′）和反向（5′-TGCTCCGAGTGGCCGCGACGCTGGAAGACA-3′）引物长双歧杆菌NCC2705生成C端子His6-标记的重组蛋白。PCR扩增产物hypBA1型使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒（Clontech）将其克隆到pET-23b载体（Novagen）中。全长hypBA1型使用Big Dye Terminator 3.1循环测序试剂盒（Applied Biosystems）在ABI 3100 DNA测序仪上对该基因进行测序。将得到的pET23b-hypBA1质粒转化为大肠杆菌BL21（λDE3）细胞，然后使用过夜快速自动诱导系统（Novagen）在20°C下生长。随后，对细胞培养物进行离心，并将所得颗粒重新悬浮在BugBuster蛋白提取试剂（Novagen）中。His标记蛋白在TALON金属亲和树脂（Clontech）上纯化，通过纤维素膜（Wako）透析脱盐，并使用10-kDa超滤膜（Millipore）浓缩。
酶分析
HypBA1酶的水解活性用丹酰化法测定顺式-阿拉如果-β1,2-Ara（f）β-Hyp(顺式-阿拉2-Hyp-DNS）作为基底。40μl反应混合物含有50 m米醋酸钠缓冲液（pH 4.5），25μ米基底，5 m米三（2-羧乙基）膦（TCEP）和0.17毫升−1HypBA1酶。一个单位的酶活性被定义为产生1μmol顺式-Ara-Hyp-DNS每分钟。在37°C培养反应混合物后，通过添加10μl 5%三氯乙酸停止反应，然后通过HPLC进行分析。将样品应用于Cosmosil 5C18-AR-II（2.5×250 mm，Nacalai）色谱柱，温度为30°C，流动相为甲醇和20 m米磷酸钠（pH 2.5）（60:40，v/v）和恒定流速（1.0 ml·min−1). 用荧光检测器（FP-202，Jasco）监测洗脱，激发波长和发射波长分别为365 nm和530 nm。对于丹磺酰化底物的TLC分析，用1丁醇/乙酸/水的3:1:1混合物（v/v/v）显影板上的斑点，然后用紫外光进行可视化。
HypBA1的底物特异性
阿拉（f）β-Hyp（Ara-Hyp），Ara2-希普，阿拉三-希普，阿拉如果-α1,3-α如果-β1,2-Ara如果-β1,2-Ara（f）β-Hyp（Ara4-Hyp）、Ara2-Me，β-Ara2、和第页NP底物在37°C下用0.17毫升培养16小时−1HypBA1酶在100μl 50 m米醋酸钠缓冲液（pH 4.5）。通过煮沸3分钟停止反应。对于TLC分析，使用乙酸乙酯/乙酸/水的2:1:1溶剂混合物（v/v/v）在硅胶60铝板（Merck）上发现低聚糖。通过在平板上喷洒orcinol-sulfate试剂来观察糖(12). 对于带有脉冲安培检测（HPAEC-PAD）的高效阴离子交换色谱分析，低聚糖使用CarboPac PA-1柱进行分析。以1.0 ml·min的流速洗脱色谱柱−1使用以下梯度：0–5分钟，100%洗脱液A（0.1米氢氧化钠）；5–30分钟，0–100%洗脱液B（0.5米醋酸钠和0.1米氢氧化钠）；和30–35分钟，100%洗脱液B。
酶活性的pH依赖性通过使用以下缓冲液在pH 3.5和8.0之间测定：50 m米醋酸钠（pH 3.5–6.0），50 m米MES（pH 5.5–7.0）和50 m米磷酸钠（pH 6.5–8.0）。温度对酶活性的影响使用50 m米15–50°C下的醋酸钠缓冲液（pH 4.5）。
动力学分析
使用0–750μ米β-Ara2,顺式-阿拉2-Hyp DNS，以及顺式-Ara-Hyp-DNS作为底物。在β-Ara的情况下2，40μl反应混合物在37°C下培养10分钟，然后通过添加10μl 500 m米氢氧化钠。释放的量我-如上所述，阿拉伯糖通过HPAEC-PAD定量，使用我-阿拉伯糖标准。在以下情况下顺式-Ara-Hyp-DNS，解放顺式-Hyp-DNS的分析过程与顺式-阿拉2-Hyp-DNS。
阿糖基转移2-海普
使用Ara进行转糖基化反应2-Hyp作为供体，1-烷醇作为受体。30纳米Ara2-Hyp在37°C下用340毫升孵育3小时−1100μl 50 m HypBA1米5 m醋酸钠缓冲液（pH 4.5）米TCEP和20%甲醇、乙醇或正丙醇作为受体。随后，用乙酸乙酯/乙酸/水（v/v/v）的2:1:1溶剂混合物通过TLC分析反应产物。通过在平板上喷洒orcinol-sulfate试剂来观察糖(12). 为了进行结构分析，在30°C的Cosmosil Sugar-D（4.6×250 mm，Nacalai）色谱柱上，以乙腈和水（75:25，v/v）为流动相，在恒定流速（1.0 ml·min）下，通过HPLC纯化20%甲醇中反应的转糖基化产物−1). 通过折光指数检测器（RI-8022，TOSOH）监测洗脱，并收集含有转糖基化产物的部分。1H和13使用JMM-ECA600KS光谱仪（JEOL）测量C NMR光谱。
定点突变和化学救援
使用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene），通过使用如通过DNA测序确认所需突变后，按照与野生型酶相同的程序表达和纯化这些突变酶。通过添加0–400 m来研究E338A突变体的外部亲核作用米叠氮化钠在40μl 50 m中的含量米乙酸钠缓冲液（pH 4.5），7.5μg E338A突变，25μg米
顺式-阿拉2-Hyp-DNS作为基底。在37°C下孵育1 h后，通过添加10μl 5%三氯乙酸停止反应，然后如上所述通过HPLC进行分析。
表1
| 姓名 | 寡核苷酸引物序列 |
|---|
| E322A_前进_底漆 | 5′-ACCCAGTGCGCG公司C类GTCGTTCACCTACG-3′ |
| E322A_反转_底漆 | 5′-CGTAGGTGACGAC公司克中广核CACGTGTGT-3′ |
| E338A_前进_底漆 | 5′-CACGATGTACGGTG公司C类GACCTGTGCTTCCG公司-3′ |
| E338A_反转_底漆 | 5′-GAAGCAGAGTC公司克CACCGTACATCGTGTCG公司-3′ |
| E366A_向前_底漆 | 5′-CCGACGTGCTGG公司C类GAAGGAACTGTTCACG公司-3′ |
| E366A_反转_底漆 | 5′-CGTTGAACAGTTCCTTC公司克CCAGCACGT公司-3′ |
菌种和培养条件
这个双歧杆菌在岐阜厌氧培养基（GAM）肉汤（Nissui）中生长的菌株如下：长双歧杆菌JCM 1217和JCM 7054；长双歧杆菌第（b）小节。婴儿JCM 1222；假长双歧杆菌JCM 1205；链状双歧杆菌JCM 1275；短双歧杆菌JCM 1192，以及双歧杆菌JCM 1254。这个在体外β-Ara的发酵能力2使用进行了测试长双歧杆菌JCM 1217和链状双歧杆菌JCM 1275在胃蛋白酶-酵母提取物-填充物（PYF）培养基中(13)含0.25%β-Ara2、葡萄糖或我-阿拉伯糖。细菌在37°C厌氧条件下培养3天。根据培养液pH值的降低判断细菌的生长(14).
细菌酶活性测定
细胞培养物在17000×克持续20分钟，用50 m冲洗所得颗粒米Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）。随后，他们在50米处再次悬浮米Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）并用Sonifer 250（Branson）进行超声处理。细胞裂解物与25μ米
顺式-阿拉2-Hyp-DNS在37°C下持续16小时，然后通过HPLC进行分析。
结果
HypBA1的表达与纯化
HypBA1由658个氨基酸残基组成，与BL0422的同源性为98.9%，与BLLJ_0211的同源性一致长双歧杆菌JCM 1217，其完整基因组序列可用(15). 重组HypBA1蛋白在20℃下表达为可溶性蛋白。SDS-PAGE显示纯化的重组HypBA1蛋白作为一条表观分子量为74kDa的单一条带迁移()与计算的74329Da分子量相符。纯化酶的最终产量为140 mg/L培养物。
重组HypBA1的SDS-PAGE分析。将纯化的HypBA1在10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并用考马斯亮蓝R-250染色。2号车道，纯化HypBA1；车道1和三分子大小标记。这个箭头表示与HypBA1对应的频带。
HypBA1的底物特异性和一般性质
丹酰化酶的活性顺式-阿拉三-在β-巯基乙醇、二硫苏糖醇或TCEP存在的情况下检测到Hyp-DNS，但在缺乏还原剂的情况下未检测到Hyp-DNS(). 几个β-我-阿拉伯糖和合成糖第页NP底物用于在TCEP存在下鉴定HypBA1的底物特异性。释放的酶我-来自Ara-Hyp、Ara的阿拉伯糖2-希普，阿拉三-Hyp和Ara2-我，但它没有起作用第页NP-α-我-阿拉伯吡喃糖苷，第页NP-α-我-阿拉伯呋喃糖苷，第页NP-β-我-阿拉伯吡喃糖苷或Ara4-海普(). HypBA1也发布了我-β-Ara中的阿拉伯糖2(B类). 适用的温度和pH值顺式-阿拉2-Hyp-DNS分别在35–40°C和4.5°C下测定(). 纯化酶的比活力为2.1单位·mg−1蛋白质。β-Ara的动力学参数2,顺式-阿拉2-Hyp-DNS和顺式-Ara-Hyp-DNS总结于. TheK（K）米和k个猫β-Ara的值2和顺式-阿拉2-Hyp-DNS在相同范围内，但k个猫的值顺式-Ara-Hyp-DNS比顺式-阿拉2-Hyp-DNS。因此k个猫/K（K）米比率顺式-Ara-Hyp-DNS比顺式-阿拉2-Hyp-DNS。HPAEC-PAD分析表明我-阿拉伯糖是从阿拉释放出来的2-Hyp，然后释放的Ara-Hyp逐渐水解为我-阿拉伯糖和Hyp(A类). 同样，两者都是顺式-和反式-阿拉伯2-Hyp-DNS也水解为Ara-Hyp-DNS，然后水解为Hyp-DSS(). 在Ara三-Hyp可被HypBA2和HypBA1降解(A类,车道4)，检测糖蛋白的反应性。HypBA2检测到胡萝卜伸展蛋白和马铃薯凝集素中的游离糖，但HypBA1未检测到(). 此外，HypBA1没有作用于第页NP-半乳糖、葡萄糖和木聚吡喃糖苷。底物特异性总结如下这些结果表明HypBA1与释放的β-我-阿拉伯寡糖。因此，我们将该酶归类为外作用β-我-阿拉伯呋喃糖苷酶。HypBA1的裂解位点如所示.
在还原剂存在下对HypBA1反应进行TLC分析。
顺式-阿拉三-Hyp-DNS与重组酶在不存在的情况下孵育(车道2)或β-巯基乙醇的存在(车道3)，二硫苏糖醇(车道4)或TCEP(车道5)在37°C下持续16小时。车道1，顺式-阿拉三-Hyp-DNS。
HypBA1反应产物的薄层色谱分析。培养底物时(车道a)或使用(车道b)HypBA1在37°C下放置16小时。Ara-Hyp(车道2)，阿拉2-海普(车道3)，阿拉三-海普(车道4)，阿拉伯4-海普(车道5),第页NP-α-我-阿拉伯吡喃糖苷(车道7),第页NP-α-我-阿拉伯呋喃糖苷(车道8),第页NP-β-我-阿拉伯吡喃糖苷(9号车道)和Ara2-我(10号车道)用作底物。车道1和6,我-阿拉伯糖标准。
HypBA1反应产物的HPAEC-PAD分析。阿拉2-海普(A类)和β-Ara2(B类)在37°C下与HypBA1孵育16小时。双峰对应于顺式-和反式-异构体。
pH和温度对HypBA1活性的影响。
A、，HypBA1活性在37°C的不同缓冲液中保持10分钟的pH依赖性。酶活性表示为pH 4.5的醋酸钠缓冲液中的活性百分比。B、，HypBA1活性10分钟的温度依赖性。酶活性表示为35°C时活性的百分比。缓冲器：醋酸钠(闭合正方形)、人工编码站(开环)，磷酸钠(闭合圆).
表2
| 基板 | K（K）米 | k个猫 | k个猫/K（K）米 |
|---|
| 米米 | 秒−1 | 秒−1
米米−1 |
| β-Ara2 | 0.85 ± 0.13 | 2.0 ± 0.20 | 2.3 |
| 阿拉2-海普一 | 0.31 ± 0.0013 | 6.3 ± 0.084 | 20 |
| Ara-Hyp公司一 | 0.43 ± 0.11 | 0.013 ± 0.0027 | 0.030 |
HypBA1与丹酰化底物反应的HPLCs。这个反式-(A类)和顺式(B类)-Ara异构体2-将Hyp-DNS与HypBA1在37°C下孵育5分钟或16小时。
比较HypBA1和HypBA2与糖蛋白的反应性。
A、，反应产物的TLC分析。马铃薯凝集素(车道2)，扩展蛋白(车道3)和Ara三-海普(车道4)用HypBA2-CΔ486孵育(车道b)或HypBA1(车道c)在37°C下持续16小时。车道a，无酶对照；车道1，
我-阿拉伯糖标准。B类，反应产物的HPAEC-PAD分析。马铃薯凝集素无酶反应(2年)，带有HypBA2-CΔ486(2亿)，或使用HypBA1(2厘米). 伸展蛋白在没有酶的情况下反应(3a年)，带有HypBA2-CΔ486(3亿)或使用HypBA1(3厘米).
表3
| 基板 | 活动 |
|---|
| β-Ara2 | +一 |
| 阿拉4-海普 | 第二次b条 |
| 阿拉三-连字符 | + |
| 阿拉2-海普 | + |
| Ara-Hyp公司 | + |
| 阿拉2-我 | + |
| 阿拉-梅 | + |
| Extensin公司 | 第二次 |
| 马铃薯凝集素 | 第二次 |
| 第页NP-α-我-阿拉伯呋喃糖苷 | 第二次 |
| 第页NP-α-我-阿拉伯吡喃糖苷 | 第二次 |
| 第页NP-β-我-阿拉伯吡喃糖苷 | 第二次 |
| 第页NP-α-d日-木吡喃糖苷 | 第二次 |
| 第页NP-β-d日-木吡喃糖苷 | 第二次 |
| 第页NP-α-d日-吡喃半乳糖苷 | 第二次 |
| 第页NP-β-d日-吡喃半乳糖苷 | 第二次 |
| 第页NP-α-d日-吡喃葡萄糖苷 | 第二次 |
| 第页NP-β-d日-吡喃葡萄糖苷 | 第二次 |
HypBA1的糖基化活性
当使用1-烷醇作为受体时，在TLC上检测到转糖基化产物(A类). 纯化的转糖基化产物（甲基我-阿拉伯呋喃糖苷）水解为我-HypBA1处理的阿拉伯糖(B类)，这表明甲醇是通过β-异构体形式连接的。该产品的结构由1H和13C核磁共振(和). 这个1核磁共振氢谱显示，在4.74 ppm的偶合常数下，异丙基质子为偶合质子J1,2=4.8赫兹。此外13核磁共振谱显示，转糖基化产物与甲基β-我-阿拉伯呋喃糖苷（Ara-Me）(16). 这些数据表明HypBA1是一种保留酶。
在1-烷醇存在下HypBA1的糖基化活性。
A、，HypBA1与Ara孵育2-在不在的时候欢呼(车道3)或在20%甲醇存在下(车道4)，乙醇(车道5)，或正丙醇(车道6)在37°C下保持3小时。车道1，
我-阿拉伯糖；车道2，阿拉2-Hyp公司。B、，纯甲基我-阿拉伯呋喃糖苷在没有(车道1)或使用(车道2)HypBA1在37°C下放置16小时。3号车道，
我-阿拉伯糖标准。我，甲基；等等，乙基；公共关系，丙基。
化学结构和1H和13Ara-Me的C核磁共振谱。这个星号指示杂质或边带信号的峰值。化学位移列于.
表4
中的信号分配1H和13甲基β的C核磁共振谱-我-阿拉伯呋喃糖苷
| 1 | 2 | 三 | 4 | 5 | 我 |
|---|
| 1H（δ） | 4.74 | 3.99 | 3.85 | 3.73 | 3.61 | 3.46 | 3.26 |
| J（赫兹） | 4.8 | 8.2, 4.8 | 7.5 | 7.1, 3.1 | 12.2, 3.4 | 12.2, 7.5 | |
| 13C（δ） | 102.72 | 76.86 | 75.03 | 82.54 | 63.65 | 55.65 |
HypBA1的序列分析
HypBA1由658个氨基酸组成，其中包括DUF1680，没有其他序列基序(). HypBA1与来自双歧杆菌的其他DUF1680成员相同38-98%(和补充图S1). 在几乎所有的序列中都发现了重复的DUF1680成员双歧杆菌物种。HypBA1（BLLJ_0211）与HypBA2（BLLJ_0212）和GH43家族成员（BLLJ _0213）构成基因簇(). 该基因簇在长双歧杆菌NCC2705，长双歧杆菌第（b）小节。婴儿157F和伪atenulatum双歧杆菌DSM 20438。此外，没有GH43家族成员的基因簇在链状双歧杆菌DSM 16992和牙齿双歧杆菌ATCC 27678。
HypBA1同源物之间的系统发育关系双歧杆菌菌株。这个黑匣子指示DUF1680保守区(中间的). 序列的长度显示在右侧每个示意图序列的。生物体、基因座标签和基因库TM（TM）加入编号如下：BLL公司,长双歧杆菌第（b）小节。龙眼JCM 1217，1号(BLLJ_0211型和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“BAJ65881”，“term_id”：“320455259”，“term_text”：“BA J6588一”}}BAJ65881型), 2 (BLLJ_1826型和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“BAJ67491”，“term_id”：“320456869”，“term_text”：“BA J6749一”}}BAJ67491型), 3 (BLLJ_1848型和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“BAJ67512”，“term_id”：“320456890”，“term_text”：“SAJ67512”}}BAJ67512型), 4 (BLLJ_0089型和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“BAJ65759”，“term_id”：“320455137”，“term_text”：“BA J65758”}}BAJ65759型);BL公司,长双歧杆菌NCC2705，1号(BL0422号和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“AAN24259”，“term_id”：“23325624”，“term_text”：“AAN24259“}}AAN24259型), 2 (第0174页和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“AAN24029”，“term_id”：“23325367”，“term_text”：“AAN24029“}}AAN24029型);商业智能,长双歧杆菌第（b）小节。婴儿157F，1(BLIF_0192和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“BAJ70339”，“term_id”：“320459719”，“term_text”：“BaJ7033九”}}BAJ70339型), 2 (蓝色_1895和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“BAJ72029”，“term_id”：“320461409”，“term_text”：“BA J72029“}}BAJ72029型);BP，假链状芽孢杆菌帝斯曼20438，1(比夫塞乌多_02879和｛“type”：“entrez protein”，“attrs”：｛“text”：“EEG71985”，“term_id”：“225158743”，“term_text”：“EEG71985”｝｝EEG71985标准), 2 (比夫斯尤多_02839和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“EEG71945”，“term_id”：“225158703”，“term_text”：“EG71945“}}EEG71945标准);不列颠哥伦比亚省,B.链状DSM 16992，1号(BIFCAT_02005年和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“EEB20621”，“term_id”：“212660046”，“term_text”：“EE 20621”}}EEB20621标准), 2 (BIFCAT_00247号和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“EEB22303”，“term_id”：“212661728”，“term_text”：“EE 22303”}}EEB22303标准), 3 (BIFCAT_01782和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“EEB20699”，“term_id”：“212660124”，“term_text”：“EE 20699”}}EEB20699标准);BD公司,B.牙本质ATCC 27678，1号(比夫登_01462和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“EDT45627”，“term_id”：“171277966”，“term_text”：“ADT45628”}}EDT45627), 2 (比夫登_00978和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“EDT45157”，“term_id”：“171277496”，“term_text”：“ETD45157“}}东部夏令时45157);添加,链状双歧杆菌ATCC 15703型(BAD_1529号和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“BAF40310”，“term_id”：“118766131”，“term_text”：“BA F40310”}}BAF40310型);禁令,B.动物第（b）小节。乳汁AD011年(布拉_1513和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“ACL29795”，“term_id”：“219621638”，“term_text”：“AMCL29795”}}ACL29795型);BB公司,短双歧杆菌帝斯曼20213(比夫布雷_03130和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“EFE89858”，“term_id”：“291382340”，“term_text”：“efE8985八”}}EFE89858型). 本研究中描述的蛋白质包含在箱利用MEGA5软件，采用邻接法构建系统发育树(左边). 包含GH127、GH121和GH43成员的基因簇的比较双歧杆菌菌株(正确的).aa公司，氨基酸。
HypBA1的关键氨基酸残基
根据多重比对和Pfam数据库中DUF1680家族的HMM标志，选择候选酸性氨基酸残基进行定点突变研究(17). 丙氨酸替换被引入Glu-322、Glu-338和Glu-366的位置，这些位置在HypBA1同源物中高度保守（在补充图S1). 对突变酶进行纯化，以测定其特定活性。用BugBuster在可溶性组分中回收E322A和E338A突变酶。E338A突变酶的活性显著下降（0.0013%），E322A突变酶的酶活为野生型酶的1.5%(). E366A突变酶不溶，仅回收少量蛋白质。然而，与野生型酶相比，它表现出16%的相对活性。利用不同浓度的叠氮化钠进一步研究了外源亲核剂对E338A突变体活性的影响。通过添加叠氮化物挽救了突变体的活性(). 存在200 m米叠氮化钠的酶活性是没有外源亲核剂时的33倍。我们还证实了β-Ara对叠氮化物的解救作用2作为底物，而在HPAEC-PAD和TLC上未观察到糖基叠氮化产物（数据未显示）。
表5
| 突变酶 | 比活度一 | 特定活动百分比 |
|---|
| 毫克−1 | % |
| 野生型 | 2100 | 100 |
| E322A型 | 32 | 1.5 |
| E338A型 | 0.028 | 0.0013 |
| E366A型 | 340 | 16 |
叠氮化物浓度对HypBA1 E338A突变体活性的影响。
误差线显示三次测量的标准偏差。
β-Ara的体外发酵性能2B.longum
首先，使用生长在GAM中的双歧杆菌细胞的裂解物作为酶源。β-我-阿糖呋喃苷酶活性存在于长双歧杆菌JCM 1217和长双歧杆菌JCM 7054，但不在链状双歧杆菌JCM 1275，短双歧杆菌JCM 1192，双歧杆菌JCM 1254，假长双歧杆菌JCM 1205，或长双歧杆菌第（b）小节。婴儿JCM 1222公司(A类). 此外，在培养基或细菌细胞悬浮液中均未观察到酶活性双歧杆菌上述菌株（数据未显示）。含有0.25%β-Ara的PYF培养基2被用作碳水化合物来源长双歧杆菌JCM 1217，但不是链状双歧杆菌西马克1275(). 此外，β-Ara2在PYF培养基中通过发酵长双歧杆菌JCM 1217公司(B类). 此外，β-我-在细胞裂解液中发现阿拉伯呋喃糖苷酶活性长双歧杆菌JCM 1217生长在β-Ara上2但在含有葡萄糖和我-阿拉伯糖(C类). 这些数据表明β-Ara2被β代谢-我-阿拉伯呋喃糖苷酶长双歧杆菌.
β的检测-我-阿拉伯呋喃糖苷酶活性双歧杆菌菌株。
A、，高效液相色谱法分析与顺式-阿拉2-Hyp-DNS和细胞裂解物双歧杆菌GAM上生长的菌株。这个双歧杆菌与培养的菌株顺式-阿拉2-Hyp-DNS如下：长双歧杆菌JCM 1217公司(b条),长双歧杆菌JCM 7054公司(c),长双歧杆菌第（b）小节。婴儿JCM 1222公司(d日),假长双歧杆菌JCM 1205公司(e（电子）),链状双歧杆菌JCM 1275公司(（f）),短双歧杆菌JCM 1192公司(克)，以及双歧杆菌JCM 1254公司(小时).顺式-阿拉2-Hyp-DNS标准(一).B、，含有β-Ara的PYF培养基的HPAEC-PAD分析2之前(一)以及之后(b条)发酵长双歧杆菌JCM 1217。C、，酶活性长双歧杆菌在含有β-Ara的PYF培养基上生长的JCM 12172(一),我-阿拉伯糖(b条)和葡萄糖(c)作为碳水化合物来源。
表6
的增长能力双歧杆菌碳水化合物菌株
细菌生长判断如下：−，ΔpH<0.5；±，0.5≤ΔpH<1.0；+，1.0≤ΔpH<1.5；++，1.5≤ΔpH。ΔpH=（试验pH）−（对照pH）。
| 碳源 | 长双歧杆菌JCM 1217公司 | 链状双歧杆菌JCM 1275公司 |
|---|
| 葡萄糖 | ++ | ++ |
| 我-阿拉伯糖 | ++ | − |
| β-Ara2 | ++ | − |
讨论
DUF1680家族有597个成员，分布在315种肠道细菌中(即双歧杆菌,拟杆菌,沙门氏菌,梭状芽孢杆菌、和大肠杆菌属)，植物性黄单胞菌属、放线菌、真菌和植物，如Pfam数据库所示。该家族的成员是功能未知的假设蛋白质，与其他糖苷水解酶家族没有序列相似性。在本研究中，我们克隆了编码DUF1680家族成员的基因，并将其产物表征为一种新的β-我-阿拉伯呋喃糖苷酶。因此，我们建议将该酶归入一个新的糖苷水解酶家族，即糖苷水化酶家族127。
β-Ara2是HypBA1和Ara的合适底物三-Hyp和Ara2-Hyp，其中包含Ara如果-β1,2-Ara（f）非还原终端的结构。在伸展蛋白中，β-我-重复Ser-Hyp上存在阿拉伯寡糖4基序并有助于蛋白酶抗性。人们认为Hyp-linkedβ-我-阿拉伯寡糖在正常环境中不会自然产生。此外，HypBA1没有直接发布我-来自伸展蛋白或马铃薯凝集素的阿拉伯糖(). 此外，我们发现β-Ara2被用作碳水化合物来源长双歧杆菌，在细胞裂解液中检测到酶活性(和). 有趣的是，在含有我-阿拉伯糖或葡萄糖。HypBA1的氨基酸序列缺乏分泌信号和跨膜结构域。总之，这些结果表明HypBA1是一种细胞内酶，可降解HypBA2释放的β-Ara2，如图所示和.
Ara水解示意图三-Hyp by HypBA1和HypBA2。
示意图β-我-阿拉伯寡糖代谢途径长双歧杆菌.β的领域组织-我-阿拉伯寡糖降解酶和预测的糖转运蛋白显示在上部面板.含有β的基因簇-我-阿拉伯寡糖降解酶如图所示下部面板。注释的基因产物如下：LacI型转录调控子（BLLJ_0207）黑色; 推测ATP结合盒式糖转运系统（BLLJ_0208-BLLJ_0210）黄色的; HypBA1（BLLJ_0211）英寸绿色; HypBA2（BLLJ_0212）英寸红色; 和假定的GH43α-我-阿拉伯呋喃糖苷酶（BLLJ_0213）蓝色.
之前，我们描述了endo-α-N个-乙酰氨基半乳糖酶（BLLJ_0168）来自长双歧杆菌JCM 1217，从核心-1粘蛋白型中释放Gal-β1,3-GalNAc（GNB）二糖O（运行）-聚糖(18). 北冈和同事(19,20)提出了一种来自core-1粘蛋白型的GNB代谢途径O（运行）-基于母乳低聚糖的GNB/LNB操纵子（BLLJ_1620-BLLJ_1626）中编码的基因的表征长双歧杆菌.Fushinobu及其同事(21,22)表征了GNB/LNB途径中ATP-结合盒型糖转运系统的GNB/LNBA结合蛋白（BLLJ_1626）。如所示，的相邻基因hypBA1型基因（BLLJ_0211）也被注释为编码假定的ATP结合盒型糖转运系统的亚基(23)如下：一个溶质结合蛋白（BLLJ_0208）和两个跨膜亚基（BLLJ _0209和BLLJ _ 0210）。BLLJ_0208与GNB/LNB结合蛋白的同源性为28%，BLLJ_（0209）和BLLJ_0210与GNB/LNB跨膜亚基（BLLJ_1624和BLLJ（_1625））的同源性也大于27%。此外，邻近基因（BLLJ_0207）被预测为LacI型转录调控因子。因此，我们预计BLLJ_0207将调节包含β-Ara的基因簇2运输系统（BLLJ_0208-BLLJ_0210）和β-我-内化β-Ara的阿拉伯寡糖降解酶（BLLJ_0211-BLLJ_0213）2.
β-我-阿拉伯寡糖代谢途径长双歧杆菌预测结果如所示。首先，GH43家族成员（BLLJ_0213）发布我-来自伸展蛋白的阿拉伯糖（Ara4-Hyp到Ara三-Hyp），然后HypBA2（BLLJ_0212）释放β-Ara2（阿拉三-Hyp到Ara-Hyp）。接下来，发布的我-阿拉伯糖和β-Ara2通过非特征化运输系统和预测的β-Ara内化到双歧杆菌细胞中2运输系统（BLLJ_0208-BLLJ_0210）。然后，HypBA1（BLLJ_0211）降解β-Ara2到我-阿拉伯糖。此外我-阿拉伯糖代谢酶转化为d日-5-磷酸木果糖，其特征在于谷氨酸棒杆菌ATCC 31831型(24)，表现出50-59%的认同度长双歧杆菌JCM 1217如下：我-阿拉伯糖异构酶（BLLJ_0342），我-核蛋白激酶（BLLJ_0340），和我-核酮糖5-磷酸4-差向异构酶（BLLJ_0341）。因此，HypBA1在长双歧杆菌对于β-我-阿拉伯寡糖用作碳水化合物和能源。
最近，福田等。(15)报告说长双歧杆菌具有先进的果糖吸收和醋酸盐生成能力，释放的醋酸盐可改善上皮细胞介导的肠道防御。除了果糖，我-阿拉伯糖是一种天然的常见碳水化合物，是生物聚合物如半纤维素和果胶的组成部分。长双歧杆菌JCM 1217对α-我-阿拉伯呋喃糖苷酶基因，GH43基因家族11个成员，GH51基因家族4个成员。几份报告表明长双歧杆菌有成长的能力我-阿拉伯糖与α-我-阿拉伯寡糖(14,23,25,–27). 我们证明了这一点长双歧杆菌也使用β-Ara2作为碳水化合物来源(). 几个α-和β-我-阿拉伯糖降解酶长双歧杆菌可能涉及我-从大肠中的植物聚合物中获取阿拉伯糖。
如上所述，HypBA1被鉴定为保留糖苷水解酶。保留糖苷水解酶的水解过程通过两个催化残基的双置换机制进行。通常使用的催化残留物是天冬氨酸或谷氨酸残留物。在化学救援研究中，E338A突变体通过添加叠氮化物被拯救，这表明Glu-338是HypBA1的催化残基。然而，反应混合物中没有形成叠氮化糖糖基产物。如GH43β-木糖苷酶和GH14β-淀粉酶所示，被叠氮离子激活的水分子可能会在不产生叠氮糖基的情况下重新激活E338A突变体(28,29).
长双歧杆菌JCM 1217编码DUF1680家族的四个成员（BLLJ_0211、BLLJ_1826、BLLJ _1848和BLLJ _0089），而长双歧杆菌NCC2705编码两个成员（BL0422和BL0174）(). BL0422与GH121β构成保守基因簇-我-阿拉伯糖苷酶基因和GH43编码基因以及BLLJ_0211。BL0174（与BLLJ_1826的同源性为98.8%）的两侧是一个含有五个GH43成员和一个α-半乳糖苷酶的基因簇（BL0176–BL0190），而BLLJ_ 1826的两侧是不含GH43成员的小基因簇（CLLJ_182 4-BLLJ_1820）。有趣的是，BLLJ_1848由五个重复的GH43成员组成的基因簇（BLLJ_1850-BLLJ_ 1854），其中簇被插入序列替换长双歧杆菌NCC2705。
含有β的富含羟脯氨酸的糖蛋白-我-阿拉伯寡糖广泛分布于陆地植物、苔藓、蕨类植物和绿藻中(30). 此外，β末端-我-阿拉伯呋喃糖苷存在于许多植物生物聚合物中(三,–8)以及甲藻中的叶黄素网状原角毛藻(31,32). 由于DUF1680家族成员在许多细菌、放线菌、真菌和植物中保存，因此它们被认为在植物生物聚合物以及富含羟脯氨酸的糖蛋白的有效降解中发挥作用。
致谢
我们感谢M.Wakao博士和Y.Suda博士（日本鹿儿岛鹿儿岛大学）在测量NMR光谱方面提供的帮助。我们感谢S.Fushinobu博士（日本东京东京大学）的有益讨论。
2使用的缩写如下：
- 海普
- 羟脯氨酸
- 阿拉（f）
- 我-阿拉伯呋喃糖
- 域名服务器
- 丹酰，5-二甲氨基萘-1-磺酰基
- HPAEC-PAD公司
- 脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱法
- GAM公司
- 岐阜厌氧培养基
- 第页NP公司
- 第页-硝基苯
- PYF公司
- 胃蛋白酶-酵母提取物-填充物
- TCEP公司
- 三（2-羧乙基）膦
- 阿拉-梅
- 甲基β-我-阿拉伯呋喃糖苷
- GNB公司
- 半乳糖-N个-生物群落
- LNB公司
- 乳糖-N个-比奥斯。
参考文献
1Kieliszewski M.J.，Lamport D.T.（1994）延伸蛋白：重复基序、功能位点、翻译后代码和系统发育.J工厂.5, 157–172 [公共医学][谷歌学者] 2Kieliszewski M.J.、Showalter A.M.、Leykam J.F.（1994）马铃薯凝集素：一种与伸展蛋白家族、橡胶凝集素家族和蛇毒去整合素（血小板聚集抑制剂）相似的模块化蛋白质共享序列.J工厂.5, 849–861 [公共医学][谷歌学者] 三。Brecker L.、Wicklein D.、Moll H.、Fuchs E.C.、Becker W.M.、Petersen A.（2005）timothy草花粉阿拉伯半乳聚糖多糖的结构和免疫学性质(梯牧草L.）.碳水化合物。雷斯.340, 657–663 [公共医学][谷歌学者] 4Mohnen D.（2008年）果胶结构与生物合成.货币。操作。植物生物.11, 266–277 [公共医学][谷歌学者] 5Pérez S.、Rodríguez-Carvajal M.A.、Doco T.（2003）一种复杂的植物细胞壁多糖：鼠李糖乳糖醛酸Ⅱ。寻求功能的结构.生物芯片
85, 109–121 [公共医学][谷歌学者] 6Whitcombe A.J.、O'Neill M.A.、Steffan W.、Albersheim P.、Darvill A.G.（1995）果胶多糖鼠李糖乳聚糖-II的结构表征.碳水化合物。雷斯.271, 15–29 [公共医学][谷歌学者] 7Cardoso S.M.、Silva A.M.、Coimbra M.A.（2002）橄榄渣果胶多糖阿拉伯糖侧链的结构表征.碳水化合物。雷斯.337, 917–924 [公共医学][谷歌学者] 8曹伟，李小强，刘磊，杨天华，李灿，范海涛，贾敏，陆志刚，梅秋波（2006）一种抗肿瘤多糖的结构当归（橄榄色）狄尔斯.碳水化合物。波利姆.66, 149–159[谷歌学者] 9York W.S.、Kumar Kolli V.S.、Orlando R.、Albersheim P.、Darvill A.G.（1996）茄科植物产生的阿拉伯木聚糖的结构.碳水化合物。雷斯.285, 99–128 [公共医学][谷歌学者] 10Fujita K.、Sakamoto S.、Ono Y.、Wakao M.、Suda Y.、Kitahara K.、Suganuma T.（2011）β-l-阿拉伯糖苷酶的分子克隆和鉴定长双歧杆菌属于一个新的糖苷水解酶家族.生物学杂志。化学.286, 5143–5150[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11.格雷·W·R（1967）氯化丹程序.酶学方法.11, 139–151[谷歌学者] 12霍姆斯·E·W、奥布莱恩·J·S（1979）糖蛋白衍生低聚糖的薄层色谱分离.分析。生物化学.93, 167–170 [公共医学][谷歌学者] 13Yoshimoto M.、Yamakawa O.、Tanoue H.（2005）潜在的化学预防特性和品种：甘薯膳食纤维的差异(巴塔叶蝉L.）根.1月
39, 37–43[谷歌学者] 14Suzuki Y.、Tanaka K.、Amano T.、Asakura T.、Muramatsu N.（2004年）阿拉伯寡糖的肠道细菌利用和消化率在体外.J.Jpn.杂志。Soc.霍尔特科学.73, 574–579[谷歌学者] 15福田S.、Toh H.、Hase K.、Oshima K.、Nakanishi Y.、Yoshimura K.、Tobe T.、Clarke J.M.、Topping D.L.、Suzuki T.、Taylor T.D.、Itoh K.、Kikuchi J.、Morita H.、Hattori M.、Ohno H.（2011）双歧杆菌可以通过产生乙酸盐来预防肠道致病菌感染.自然
469, 543–547 [公共医学][谷歌学者] 16Joseleau J.-P.、Chambat G.、Vignon M.、Barnoud F.（1977年）化学和13两种阿拉伯糖的核磁共振研究格劳卡蔷薇.碳水化合物。雷斯.58, 165–175[谷歌学者] 17.Schuster-Böckler B.、Schultz J.、Rahmann S.（2004）用于蛋白质家族可视化的HMM徽标.BMC生物信息学
5, 7.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Fujita K.、Oura F.、Nagamine N.、Katayama T.、Hiratake J.、Sakata K.，Kumagai H.、Yamamoto K.（2005）一个新的核心1型糖苷水解酶家族的鉴定和分子克隆O（运行）-聚糖特异性内切-α-N个-乙酰氨基半乳糖苷酶长双歧杆菌.生物学杂志。化学.280, 37415–37422 [公共医学][谷歌学者] 19Kitaoka M.、Tian J.、Nishimoto M.（2005年）涉及乳糖的新型半乳糖操纵子-N个-生物磷酸化酶长双歧杆菌.申请。环境。微生物.71, 3158–3162[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Nishimoto M.、Kitaoka M.（2007）的标识N个-完整乳汁中的乙酰己糖胺1-激酶-N个-biose I/半乳糖-N个-biose代谢途径长双歧杆菌.申请。环境。微生物.73, 6444–6449[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Fushinobu S.（2010）双歧杆菌独特的糖代谢途径.Biosci公司。生物技术。生物化学.74, 2374–2384 [公共医学][谷歌学者] 22铃木R.、和田J.、片山T.、福新武S.、瓦卡吉T.、寿H.、杉本H.、田中A.、熊井H.、阿希达H.、北冈M.、山本K.（2008）溶质结合蛋白的结构和热力学分析长双歧杆菌针对核心1二糖和乳糖-N个-生物群落I.生物学杂志。化学.283, 13165–13173 [公共医学][谷歌学者] 23Parche S.、Amon J.、Jankovic I.、Rezzonico E.、Beleut M.、Barutçu H.、Schendel I.、Eddy M.P.、Burkovski A.、Arigoni F.、Titgemeyer F.（2007）糖运输系统长双歧杆菌新冠2705.《分子微生物学杂志》。生物技术.12, 9–19 [公共医学][谷歌学者] 24Kawaguchi H.、Sasaki M.、Vertès A.A.、Inui M.、Yukawa H.（2009）阿拉伯糖利用基因簇的鉴定和功能分析谷氨酸棒杆菌.申请。环境。微生物.75, 3419–3429[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Biavati B.、Scardovi V.、Moore W.E.C.（1982）属内蛋白质的电泳图谱双歧杆菌并提出四个新物种.国际期刊系统。细菌素.32, 358–373[谷歌学者] 26Pastell H.、Westermann P.、Meyer A.S.、Tuomainen P.、Tenkanen M.（2009）体外双歧杆菌和混合粪便微生物发酵阿拉伯木聚糖衍生碳水化合物.农业杂志。食品化学.57, 8598–8606 [公共医学][谷歌学者] 27罗伊·D·沃德·P（1990）快速鉴别方法的评价双歧杆菌物种.J.应用。细菌素.69, 739–749 [公共医学][谷歌学者] 28Miyake H.、Otsuka C.、Nishimura S.、Nitta Y.（2002）β-淀粉酶的催化机理蜡样芽孢杆菌变量。霉菌：叠氮化物对催化位点突变（Glu367→Ala）水解活性的化学救援.生物化学杂志.131, 587–591 [公共医学][谷歌学者] 29Shallom D.、Leon M.、Bravman T.、Ben-David A.、Zaide G.、Belakhov V.、Shoham G.、Schomburg D.、Baasov T.和Shoham Y.（2005）一个43β-d-木糖苷酶家族催化残基的生化表征和鉴定嗜热脂肪地芽孢杆菌T-6型.生物化学
44, 387–397 [公共医学][谷歌学者] 30兰波特·D·T、米勒·D·H（1971）植物界中的羟基脯氨酸阿拉伯糖苷.植物生理学.48, 454–456[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Konishi M.、Yang X.、Li B.、Fairchild C.R.、Shimizu Y.（2004）温带甲藻培养上清液中的高细胞毒性代谢物原角质层囊性纤维变性。心脏叶瓶尔小草.J.自然产品.67, 1309–1313 [公共医学][谷歌学者] 32Souto M.L.、Fernández J.J.、Franco J.M.、Paz B.、Gil L.V.、Norte M.（2005）糖基埃索毒素A，一种来自网状原角毛藻.J.自然产品.68, 420–422 [公共医学][谷歌学者] 
