霉硫醇/霉氧还蛋白1依赖性还原来自结核分枝杆菌^*

菌丝醇纯化

MSH纯化自M.污点如前所述(7).

蛋白质表达与纯化

任一种来源的菌丝醇二硫还原酶结核分枝杆菌(百万吨MR）或C.谷氨酸(Cg公司MR）如前所述进行表达和纯化(15,16). 这个Cg公司MR制剂与百万吨MR，因此优先使用。百万吨AhpE表达于大肠杆菌BL21（DE3）（表达载体pDEST17）作为重组His标记蛋白，并按前述方法纯化(22). 酶在氩气气氛下储存于−80°C。野生型百万吨x1先生(百万吨Mrx1wt）和第二个半胱氨酸残基的突变形式(百万吨Mrx1CXXA）表达于大肠杆菌BL21 Star，并按照前面所述进行纯化(15). 在固定化金属离子亲和层析步骤之后，百万吨使用Superdex 75 10/300色谱柱在100 m深处通过尺寸排除色谱进一步纯化Mrx1CXXA米磷酸盐缓冲液，0.1 m米DTPA，pH 7.4。两者都有百万吨Mrx1wt和百万吨Mrx1CXXA在−20°C下储存，保存时间为5 m米DTT公司。使用之前，使用HiTrap脱盐柱（Amersham Bioscience）通过凝胶过滤去除多余的还原剂，并在280 nm处进行UV-vis检测。

蛋白质硫醇还原

百万吨AhpE在使用前通过1m培养降低米4°C下DTT 30分钟。如上文所示，使用前立即通过凝胶过滤去除所有蛋白质中多余的还原剂。

过氧化物、蛋白质和硫醇定量

H的浓度₂O（运行）₂在240 nm（λ₂₄₀= 43.6米⁻¹厘米⁻¹) (24).百万吨AhpE、，百万吨Mrx1wt，和百万吨Mrx1CXXA浓度在280 nm处用分光光度法测定，摩尔吸收系数为23950(22)、9974和9942米⁻¹厘米⁻¹分别从氨基酸组成计算得出。计算的蛋白质浓度是指单体的蛋白质浓度。HRP的浓度通过其在Soret带（λ₄₀₃= 1.02 × 10⁵ 米⁻¹厘米⁻¹(25)). 通过Ellman分析（λ₄₁₂= 14,150米⁻¹厘米⁻¹) (26,27). MR的浓度通过FAD辅因子在463nm处的吸收来估算（ϵ=11300米⁻¹秒⁻¹)和以前一样(8).

PEG-马来酰亚胺催化蛋白质硫醇烷基化及电泳分析

含有还原和/或氧化的反应混合物（100μl）百万吨有无MSH时的AhpE，百万吨Mrx1wt，或百万吨通过添加10μl三氯乙酸（TCA）（10%（w/v米PEG-马来酰亚胺（50 m米Tris，10米米EDTA，0.1%SDS，pH 7.5），并在45°C下孵育45分钟。在没有β-ME的情况下，将样品立即加载在15%SDS-PAGE上，并用考马斯亮蓝对蛋白质进行染色。

反应产物的质谱鉴定

蛋白质样品稀释至～5μ米在50%乙腈中，0.1%乙酸和完整蛋白质的质量测量通过直接注入微电子喷雾电离离子阱质谱仪（LTQ XL，ThermoFisher Scientific，San José，CA）进行。质谱仪在正离子模式下手动操作，源电压设置为3.8 kV，离子转移管设置为220°C。母体离子通过最小能量进行源内离解（SID），以促进水分子和盐加合物的有效分离。使用ThermoFisher Scientific的ProMass反卷积软件对质谱进行反卷积。

用于识别百万吨AhpE公司-百万吨Mrx1CXXA混合二硫化物，用测序级胰蛋白酶（0.5μg）在30°C下过夜，在凝胶中消化预期的相应条带。通过添加0.1%三氟乙酸停止反应。如前所述，通过LC-MS/MS分析肽(28). 质谱仪以数据依赖模式运行，并在MS、Zoom Scan（用于电荷状态测定）和MS/MS（用于最丰富的离子）之间自动切换。每次MS扫描后，最多使用35%的碰撞能量进行五次MS/MS扫描。动态排除允许分析共洗脱肽。使用Proteome Discoverer 1.3软件包中的应用光谱选择器生成肽鉴定峰列表。使用Sequest对自制的蛋白质数据库搜索得到的峰列表，该数据库包含百万吨Mrx1和百万吨AhpE序列（Uniprot{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“Q8VJ51”，“term_id”：“613782321”}}Q8VJ51型和Q73YJ5）。使用以下参数：胰蛋白酶仅在赖氨酸和精氨酸之后进行裂解；内劈裂位点数设为1个；前体离子和碎片离子的质量容限分别为1.1 Da和1.0 Da；所考虑的动态修饰为氧化蛋氨酸的+15.99Da和添加到半胱氨酸的丙烯酰胺的+71.0Da。使用电荷状态筛选肽匹配物与互相关得分（Xcorr）。混合二硫肽百万吨Mrx1和百万吨AhpE通过使用DBond软件进行识别(29)并手动验证。

AhpE-霉硫醇（AhpE-SS-M）二硫化物生成速率常数的测定

氧化动力学百万吨AhpE与霉硫醇反应形成上述混合二硫化物是通过竞争法测定的，如下所示百万吨过量H将AhpE过度氧化为亚硫酸₂O（运行）₂在没有和存在霉硫醇的情况下，由于后一种酶的速率常数很高，它不会竞争过氧化半胱氨酸的初始氧化。如前所述，使用Aminco Bowman系列2发光分光光度计在伴随固有荧光增加后测量过氧化(22)，如中所示方程式3.

减少百万吨AhpE（2μ米)与H混合₂O（运行）₂(150 μ米)在没有或存在MSH（11–33μ米)使酶的固有荧光强度迅速降低，这与它被氧化成亚硫酸有关(k个= 8.2 × 10⁴ 米⁻¹秒⁻¹，在此条件下的反应半衰期为～0.06 s），随后与酶过度氧化对应的荧光增加(k个₁= 40米⁻¹秒⁻¹，在此条件下的反应半衰期为115 s），如前所述(22). 观察到的荧光增加速率常数(k个_{光突发事件})通过将实验数据拟合到单个指数来确定。在存在霉硫醇的情况下方程式4,

哪里k个₂是氧化反应的二级速率常数百万吨AhpE和减少的霉硫醇。k个₂在pH 7.4和25°C的条件下k个_{光突发事件} 与MSH浓度，偏移量对应于k个₁×[H₂O（运行）₂].

MtMrx1wt还原MtAhpE-SS-M

含有还原剂的反应混合物百万吨AhpE（20μ米)用二硫化霉硫醇（MSSM，20μ米)或以等摩尔浓度H氧化₂O（运行）₂。氧化后立即添加还原MSH，以达到最终浓度20μ米孵育30分钟形成百万吨AhpE-SS-M。选择培养时间以允许≥90%的混合二硫化物形成，如使用Gepasy 3软件计算的(30)反应的速率常数如下。然后，百万吨Mrx1 wt添加到其中一个百万吨含有AhpE-SS-M的样品（20μ米Mrx1和10μ米 百万吨AhpE-SS-M最终浓度）。15分钟后，用TCA沉淀样品，并用PEG-马来酰亚胺进行烷基化分析。

MtMrx1wt还原MtAhpE-SOH

氧化的百万吨AhpE是通过培养百万吨AhpE（17μ米)等摩尔浓度H₂O（运行）₂氧化步骤后立即保持1分钟，减少百万吨添加Mrx1以达到最终浓度16μ米 百万吨Mrx1和10μ米 百万吨啊。在不同孵育时间（0.2、0.5和4 min）取等分试样（90μl），直接加入含有10μl 100%TCA的试管中，以停止反应并沉淀蛋白质。H之前的样本₂O（运行）₂添加（减少百万吨AhpE）、氧化后和氧化前百万吨Mrx1添加（氧化百万吨AhpE）分别用作阳性和阴性对照。样品通过PEG-马来酰亚胺烷基化进行分析。

氧化MtAhpE与MtMrx1中亲核硫醇的反应

含有还原剂的反应混合物百万吨AhpE（10μ米)在…缺席或在场的情况下百万吨Mrx1wt或百万吨Mrx1CXXA（30μ米)用H治疗₂O（运行）₂(10 μ米). 15分钟后，添加TCA，并通过SDS-PAGE分析样品。

MtAhpE-SS-M与MtMrx1wt或MtMr x1CXXA的反应

含有还原剂的反应混合物百万吨AhpE（16μ米)在没有或存在MSH（30μ米)用H治疗₂O（运行）₂(16 μ米)，以形成百万吨AhpE-SOH和百万吨分别为AhpE-SS-M。30分钟后，百万吨Mrx1重量或百万吨添加Mrx1CXXA（20μ米 百万吨Mrx1wt或CXXA和10μ米 百万吨AhpE-SOH或百万吨AhpE-SS-M最终浓度）。30分钟后，10米米添加NEM并孵育15分钟，在没有还原剂的情况下通过SDS电泳分析样品。

MtMrx1CXXA中氧化MtAhpE与亲核硫醇的反应动力学

用于确定二级反应速率常数百万吨AhpE-SOH和百万吨Mrx1 CXXA，含1μ米 百万吨AhpE和不断增加的百万吨Mrx1CXXA（10、25和40μ米)用1μ米H（H）₂O（运行）₂.由于过氧化硫醇在百万吨AhpE（8×10⁴ 米⁻¹秒⁻¹(22))与百万吨Mrx1（6.6米⁻¹秒⁻¹，见下文），H₂O（运行）₂被前者减少。在不同时间点取90μl等分试样，用移液管移到含有10μl 100%TCA的Eppendorf管中，以停止反应并沉淀蛋白质。样品通过SDS-PAGE进行分析，考马斯染色凝胶在Oddysey®LI-COR中700 nm处进行扫描。对应于百万吨AhpE公司-百万吨Mrx1CXXA混合二硫化物（通过凝胶内消化和质谱分析确定，见下文）根据百万吨Mrx1CXXA强度，超过百万吨因此，在分析期间不应大量消耗AhpE。将相对二硫键强度绘制为时间的函数，并将其拟合为指数增长曲线。反应的二阶速率常数百万吨AhpE-SOH与百万吨Mrx1CXXA是从混合二硫化物形成的观察速率常数图的斜率中获得的与MtMrx1CXXA浓度。

pK的测定_一MtMrx1wt和CXXA的亲核半胱氨酸中的硫醇

pK（K）_一的亲核半胱氨酸百万吨Mrx1wt和百万吨如前所述，用分光光度法测定Mrx1CXXA突变体(31). 请注意，我们使用烷基化蛋白质而不是氧化（S-S）蛋白质来校正背景。蛋白质用10 m烷基化米室温下碘乙酰胺30min。使用Superdex75 10/300上的体积排阻色谱去除过量的碘乙酰胺。

H氧化MtMrx1的动力学₂O（运行）₂

本征荧光强度百万吨Mrx1（λ_不包括=295 nm，λ_{相对长度单位}=335 nm）被H氧化后减少₂O（运行）₂DTT治疗完全可逆。我们利用光谱变化测量了百万吨Mrx1与H的反应₂O（运行）₂，如之前报告的布氏锥虫锥虫毒素1氧化(32). 减少百万吨Mrx1（10μ米)混合了过量的H₂O（运行）₂（0.25–1.0米米)在Aminco Bowman系列2发光分光光度计中，记录了固有荧光变化的时间过程。观察到的荧光衰减速率常数(k个_{光突发事件})通过将实验数据拟合到单个指数来确定。还原反应的二级速率常数百万吨Mrx1和H₂O（运行）₂在pH 7.4和25°C下，从k个_{光突发事件} 与H（H）₂O（运行）₂浓度。

H的催化消耗₂O（运行）₂MtMrx1在场时由MtAhpE提供

H（H）₂O（运行）₂缓慢输送到含有2μ米 百万吨AhpE和/或减少野生型或CXXA百万吨Mrx1（50μ米)在连续搅拌下使用电动注射器系统（KD Scientific）（通量=1μ米/15分钟内持续分钟）。在不同时间取20μl等分样品，直接用移液管移到含有180μl 1μl溶液的板孔（Fisherbrand®平底孔板，透明）中米HRP和20μ米Amplex®红色H₂O（运行）₂-使用Fluostar BMG Lab平板荧光阅读器（λ_前任=515 nm，λ_{相对长度单位}=590纳米）。H（H）₂O（运行）₂根据适当的校准曲线确定每个样品的浓度。

MtAhpE-SOH与霉素反应动力学

减少的孵化百万吨AhpE和H₂O（运行）₂过量导致酶过度氧化为亚硫酸，随后如前所述伴随着Trp荧光的变化(22). 添加H后₂O（运行）₂在存在过量的霉硫醇的情况下，我们观察到振幅降低，观察到的速率常数增加(k个_{光突发事件})第页，共页百万吨AhpE过氧化(图1C类). 这个k个_{光突发事件}该过程的浓度与MSH浓度呈线性关系(图1D类). 斜率导致二阶速率常数(k个₂)237±30米⁻¹秒⁻¹对于的反应百万吨pH 7.4和25°C下含有MSH的AhpE-SOH。偏移量对应于k个₁×[H₂O（运行）₂]与先前测定的酶过氧化速率常数完全一致(22).

MtMrx1减少MtAhpE-SS-M

当减少时百万吨AhpE（20μ米)与二硫化霉硫醇（MSSM，20μ米)与PEG-马来酰亚胺的烷基化反应没有被废除，这表明至少在这些条件下，还原酶不会被二硫形式的霉硫醇氧化。什么时候？百万吨Mrx1已添加到预成型百万吨AhpE-SS-M并用PEG-马来酰亚胺进一步处理，蛋白质被烷基化(图1E类)，表明百万吨Mrx1减少百万吨AhpE-SS-M公司。

MtAhpE减少MtMrx1

氧化时百万吨AhpE（10μ米)与减少的百万吨Mrx1（16μ米)持续0.2–4分钟并用PEG-马来酰亚胺进一步处理，酶被烷基化(图2A类)，表明百万吨AhpE减少了百万吨Mrx1符合方程式6.

百万吨Mrx1-依赖性减少百万吨0.2–0.5分钟后，AhpE完成了约50%，表明反应相对较快。有趣的是百万吨Mrx1部分抑制百万吨AhpE，氧化后缓慢出现(图2A类).

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图2。

MtAhpE被野生型MtMrx1通过二硫代机制还原。 A类，减少(车道1)或氧化(2–6车道)百万吨AhpE（10μ米)在缺席的情况下孵化(1–3车道)或出现减少百万吨Mrx1（16μ米)指定时间(车道4–6)并用5m处理米PEG-马来酰亚胺在考马斯亮蓝（CBB）染色的15%SDS-PAGE上进行评估。B类、还原和氧化百万吨仅AhpE（10μ米)，或氧化百万吨AhpE孵化百万吨Mrx1重量或百万吨Mrx1 CXXA（30μ米)用CBB染色的15%SDS-PAGE对15分钟的时间进行评估(1–4车道）或存在(车道4–8β-ME的一个新的带，其分子质量与在百万吨AhpE和百万吨Mrx1CXXA表示为百万吨AhpE-SS公司-百万吨x1先生。C类，质谱分析百万吨AhpE-SS公司-百万吨Mrx1复合体如所示图2B类.[M+4H]的四电荷母离子⁴⁺=1183.7 Da显示Cys之间二硫键的断裂特征¹⁷属于百万吨Mrx1和Cys⁴⁵属于百万吨AhpE，由DBond软件确定(29).P（P）*一条二肽；第页*二肽的另一条链；大写字母，从肽中分离离子P（P）*;小写字母，从肽中分离离子第页*. 34个原子质量单位的损失表示C-S键断裂形成脱氢丙氨酸。D类，反应百万吨AhpE-SS-M和百万吨Mrx1CXXA不形成蛋白质-蛋白质分子间混合二硫化物。减少(车道1)并被氧化百万吨AhpE公司(2–7车道)独自一人(车道2,4、和6)或与MSH孵育30分钟(车道3,5、和7)，是在缺席的情况下孵化的(车道2和三)或存在百万吨Mrx1重量(车道4和5)或百万吨x1CXXA先生(车道6和7)15分钟。通过添加5 m，停止反应米NEM和样品在非还原条件下通过CBB染色的15%SDS-PAGE进行评估。分子量与混合二硫键形成相容的新带百万吨AhpE和百万吨Mrx1CXXA表示为百万吨AhpE-SS公司-百万吨x1先生。

MtMrx1对MtAhpE的双硫还原与单硫还原

在C.谷氨酸Mrx1，只有CXXC活性位点序列基序的N末端半胱氨酸残基被发现对砷酸-间硫醇加合物中间体的还原至关重要(16,33). 对于百万吨然而，Mrx1的C端半胱氨酸突变为丙氨酸(百万吨Mrx1 CXXA）无法减少百万吨AhpE公司。它形成了混合的二硫化物(百万吨AhpE公司-百万吨Mrx1 CXXA），可被β-ME还原(图2B类)表明半胱氨酸残基百万吨Mrx1对于减少百万吨根据以下机制，在这些条件下，AhpE方程式7和8.

质谱研究证实了混合二硫化物的形成。对应于百万吨AhpE公司-百万吨Mrx1 CXXA英寸图2B类发现每个蛋白质的两个含半胱氨酸的胰蛋白酶肽之间存在混合二硫(图2C类).

如上所示，野生型百万吨Mrx1可以直接减少百万吨AhpE-SOH公司(图2,A类和B类). 有趣的是，当百万吨Mrx1CXXA已添加到百万吨AhpE-SS-M，未观察到AhpE-SS-Mrx1混合二硫化物(图2D类)表明半胱氨酸百万吨Mrx1CXXA与MSH的硫原子反应，生成还原的百万吨AhpE通过以下反应方程式9,

这是一种单硫代还原机制的反应。

MtMrx1CXXA与MtAhpE-SOH反应动力学

当我们氧化百万吨存在过量时，AhpE转化为其硫酸衍生物百万吨Mrx1CXXA，混合二硫化物在百万吨AhpE和百万吨观察到Mrx1CXXA(图3A类). 这种混合二硫化物形成的时间过程符合指数曲线(图3B类)，并且观察到的速率常数取决于百万吨Mrx1CXXA浓度(图3C类). 从图中所示的坡度图3C类，二阶速率常数，用于氧化反应百万吨AhpE和N-末端硫醇百万吨Mrx1CXXA形成（1.6±0.3）×10的混合二硫化物^三 米⁻¹秒⁻¹在pH 7.4和25°C下测定。

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图3。

MtMrx1CXXA中MtAhpE-SOH与亲核硫醇的反应动力学。 A类，氧化百万吨AhpE（1μ米)被孵化百万吨Mrx1CXXA（25μ米)，在不同孵育时间取等分试样，通过添加10%TCA停止反应。样品在CBB染色的15%SDS-PAGE上进行评估。B类，混合二硫化物的相对带强度随时间增加，如所示A类，表示为百万吨AhpE-SS公司-百万吨x1先生/百万吨x1CXXA先生。百万吨Mrx1CXXA在超过10倍的浓度下保持恒定，并用作蛋白质负荷控制。连续线表示指数曲线的最佳拟合。C类，增加的效果百万吨Mrx1CXXA浓度对观察到的分子间二硫化物形成速率常数的影响。

pK（磅/平方公里）_一MtMrx1wt和MtMr x1CXXA中的亲核半胱氨酸值

在之前的工作中，我们已经确定了pK（K）_一亲核半胱氨酸残基的价值百万吨Mrx1wt为6.8(15). 为了研究CXXA突变对亲核半胱氨酸反应性的可能影响，我们测定了pK（K）_一亲核半胱氨酸的价值百万吨x1CXXA先生。我们得到了7.6的中点值(图4A类).

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图4。

MtMrx1硫醇pK（K）_一H氧化的测定和动力学₂O（运行）₂. A类,pK（磅/平方公里）_一野生型滴定曲线(圈子) (15)和CXXA突变体(三角形). 显示了硫醇盐离子在240nm处的比吸收作为pH的函数。A类_经验按说明确定(31). 数据采用Henderson-Hasselbach方程进行拟合。B类，总固有荧光强度随时间而降低（λ_前任=295 nm，λ_{相对长度单位}=335 nm）百万吨Mrx1wt（10μ米)H氧化后₂O（运行）₂100米米磷酸钠缓冲液+0.1 m米在pH 7.4和室温下的DTPA。这个第一个箭头表示添加了多余的H₂O（运行）₂（1.5米米)第二，增加DTT（1.5 m米).C类，H的影响₂O（运行）₂wt观测速率常数的浓度百万吨Mrx1固有荧光变化。

氢氧化MtMrx1硫醇的动力学₂O（运行）₂

什么时候？百万吨Mrx1（10μ米)被H氧化₂O（运行）₂（1米米)，通过DTT处理可以完全可逆的方式观察到蛋白质固有荧光的时间依赖性降低，表明蛋白质硫醇氧化的特异性(图4B类). 荧光衰减的时间过程符合指数曲线，观察到的速率常数依赖于H₂O（运行）₂浓度(图4C类). 根据曲线斜率百万吨Mrx1通过H氧化₂O（运行）₂（6.6±0.6）米⁻¹秒⁻¹在pH 7.4和25°C下获得。

MtAhpE-催化H₂O（运行）₂通过MtMrx1减少

我们测试了百万吨AhpE能够催化消耗H₂O（运行）₂在减少的情况下百万吨Mrx1.当通量为H时₂O（运行）₂(1 μ米最小值⁻¹)被注射到减少百万吨Mrx1（50μ米)，H随时间的增加₂O（运行）₂已观察到(图5). 15分钟后，接近14μ米H（H）₂O（运行）₂累积，表明H的<10%₂O（运行）₂已被消耗。这与低反应性一致百万吨Mrx1朝向H₂O（运行）₂(6.6 ± 0.6米⁻¹秒⁻¹pH 7.4，图4C类). 减少百万吨AhpE（2μ米)单独不能催化消耗H₂O（运行）₂然而，当H的流量相同时₂O（运行）₂被注入一种混合物中百万吨Mrx1和百万吨AhpE，H的增长速度慢得多₂O（运行）₂观察到浓度：2.8μ米H（H）₂O（运行）₂15分钟后累积，表明81%的注入H₂O（运行）₂已被消耗(图5). 重要的是，虽然百万吨AhpE催化消耗H₂O（运行）₂在wt存在下百万吨Mrx1，过氧化物酶活性百万吨AhpE在百万吨使用Mrx1CXXA变体，再次表明百万吨Mrx1对于直接百万吨AhpE降低(图5).

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图5。

MtAhpE催化H₂O（运行）₂MtMrx1存在时减少。H（H）₂O（运行）₂注入（J=1μ米最小值⁻¹)反应混合物含50μ米减少百万吨Mrx1重量(三角形), 50 μ米减少百万吨Mrx1 CXXA+2μ米 百万吨AhpE公司(圈子)，或50μ米减少百万吨Mrx1重量+2μ米 百万吨AhpE公司(正方形). 剩余H₂O（运行）₂使用Amplex®红色氧化试验在不同时间点进行测量。数据点表示n个=3±S.D。