TRPM6激酶结构域决定TRPM7/M6异聚离子通道的Mg·ATP敏感性^*

逆转录聚合酶链反应

使用RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）从四个重复的HEK-293野生型细胞中分离出总RNA。按照制造商的程序，使用SuperScript III RT-PCR第一链合成系统（Invitrogen）从1μg用寡核苷酸（dT）引物引物引诱的总RNA合成cDNA。基因特异性引物TRPM6号机组（正向引物5′-TGCCTGGAAACAGCAATGTCAG-3′和反向引物5’-CTTTCATCAGCACAAACC-3′），TRPM7号机组（正向引物5′-AGCATACAGAACAGCCAACGG-3′和反向引物5’-TTCAACAGAGCCATCATCCACC-3′），以及GAPDH公司使用MacVector设计正向引物5′-GGAGCAAAAGGGTCATCTC-3′和反向引物5’-AGTGGTGTGCTGTTGAAGTC-3′，并用Invitrogen合成。PCR反应体积为50μl，含有1μl dNTPs（10 m）米)每个引物2μl（10pmol/μl），cDNA溶液2μl，反应缓冲液5μl（10×），水37μl，热循环（Bio-Rad）上的Pfu Ultra II融合HS DNA聚合酶（Stratagene）1μl。在94°C下进行变性20 s，在55°C下退火30 s，在72°C下延伸30 s，进行35个循环，然后在72°C下延伸3 min。在含有1×SYBR安全DNA凝胶染色剂（Invitrogen）的0.8%琼脂糖凝胶中检测PCR产物。

解决

为了测量TRPM6电流，细胞被保存在含有（单位：m）米)以下：140 NaCl、2.8 KCl、1 CaCl₂，10 Hepes-NaOH，11葡萄糖，pH 7.4。在由（单位：m）米)以下：140 NaCl、2.8 KCl、1 CaCl₂，2氯化镁₂，10 Hepes-NaOH，11葡萄糖，pH 7.4，用NaOH或HCl调节。

为了测试渗透挑战对通道的影响，通过在标准外部溶液中添加适量甘露醇来制备高渗溶液，并通过将NaCl浓度从140降至~90 m来实现低渗米低渗溶液的对照溶液是通过将渗透压调节到310 mos制成的米使用适当浓度的甘露醇。通过渗透压计（Wescor）验证溶液的渗透压。所含标准内溶液（单位：m米)如下：140个谷氨酸铯、8个氯化钠、10个乙酰胆碱酯酶、10个EGTA-CsOH；pH 7.2，用CsOH或HCl调节。在某些情况下，强镁²⁺螯合剂（EDTA）用于完全去除内部镁²⁺或在计算内部自由镁时达到更高的精度²⁺浓度。游离镁²⁺用WebMaxC标准（斯坦福大学克里斯·巴顿）计算移液管溶液中的浓度。电流记录用吸管溶液的详细成分如所示表1​1​​–5所有化学品均来自Sigma。

TRPM6和TRPM7/M6通道对低极化和高极化的敏感性

TRPM7对人体肾细胞的渗透挑战敏感(22). 由于TRPM6主要在渗透性变化常见的肠道和肾脏中表达，我们测试了TRPM6是否也具有渗透敏感性。考虑到细胞内镁²⁺可用性对通道功能有显著影响，我们在细胞内镁缺乏和存在的情况下传递渗透变化²⁺.存在10m米EDTA、TRPM6电流不受低渗溶液的影响（210个月米,图2C类)而高渗溶液略微减少了30%的电流（510个月米,图2C类). 然而，当细胞暴露于高渗溶液中时，由于细胞收缩，观察到串联电阻增加，这可能是导致TRPM6电流小幅度下降的原因。在20μ米镁²⁺(图2D类)无低张（210个月米)也没有高血压（510个月米)与相应的对照（等渗）相比，对TRPM6具有影响。总的来说，TRPM6对渗透梯度基本不敏感，这与TRPM7形成鲜明对比。

接下来，我们研究了TRPM7/M6异构体对渗透挑战的反应。在缺乏细胞内镁的情况下²⁺，TRPM7/M6在210个月的渗透变化中表现出与TRPM6相似的行为米对电流无影响，510 mos米导致电流减少约30%(图2E类). 然而，在内部游离镁的条件下²⁺调整到790μ的生理水平米，TRPM7/M6以剂量依赖性的方式恢复了对渗透梯度的敏感性(图2F类). 拟合的剂量-反应曲线得出IC₅₀460个月米渗透压介导的TRPM7/M6抑制(图2克，希尔=3.3），类似于IC₅₀430个月米用于TRPM7(22). 然而，与TRPM7相比，TRPM7/M6电流在更大范围的渗透梯度上对渗透压敏感，这由它们明显不同的Hill系数（3.3与分别为11人；图2克). 这表明镁²⁺TRPM7/M6的渗透敏感性是必需的，异聚物的形成导致对渗透变化的更梯度反应，而不改变渗透敏感性的中点。如下所示，这与异聚通道对细胞内镁的保留敏感性一致²⁺，作为介导渗透敏感性的一个重要因素，是由细胞体积变化导致的抑制分子分子拥挤引起的(22).

细胞内镁对同聚和异聚通道激酶的抑制作用²⁺

细胞内镁²⁺调节TRPM6和TRPM7(三,5,8,10). IC₅₀对于Mg²⁺-HEK-293过表达系统中依赖性TRPM7抑制为720μ米在没有Mg·ATP的情况下(10). 然而，完全镁²⁺野生型HEK-293中天然TRPM7电流的剂量-反应曲线尚未确定。RT-PCR证实野生型HEK-293细胞表达TRPM7，但未检测到显著的TRPM6(图3C类)表明内源性电导仅由TRPM7介导。如所示图3,A类和B类细胞内游离镁抑制了天然TRPM7样电流²⁺带IC₅₀569μ米，类似于异源表达的TRPM7(图3F类) (10). 对于TRPM6，Voets等。(5)报告了IC₅₀510μ米对于Mg²⁺笼状镁的闪光光解法测定的块²⁺.我们重新评估了镁²⁺使用我们的标准全细胞膜片钳方法比较从TRPM7、TRPM6和TRPM7/M6获得的数据集的TRPM6的敏感性。我们用了10米米EDTA作为内部镁²⁺螯合剂和氯化镁₂经过计算以达到所需的游离镁²⁺浓度。无内部镁²⁺，在HEK-293细胞中评估的短暂过度表达TRPM6电流在断裂后30秒内迅速激活(图1A类和​和3三D类). 只有10μ米镁²⁺显著抑制了TRPM6的电流大小和300μ米镁²⁺几乎消除了水流(图3D类). 拟合的剂量-反应曲线得出IC₅₀29μ米希尔系数为0.7(图3F类)与TRPM7（IC₅₀= 720 μ米) (10). 接下来我们研究了镁²⁺四环素诱导体系中TRPM7/M6异构体的阻断(17)，我们测定了Mg²⁺细胞内游离镁的剂量-反应曲线²⁺用EGTA缓冲至不同浓度。如所示图3E类，细胞内镁²⁺剂量依赖性阻断TRPM7/M6电流。IC₅₀根据TRPM7/M6的剂量-反应曲线拟合，约466μ米希尔系数为0.8(图3F类). IC的差异₅₀天然和过度表达的TRPM7以及TRPM7/M6之间的值并没有达到统计显著性，尽管异聚通道对镁的敏感性可能稍高²⁺与单体TRPM7相比。然而，TRPM7·M6复合物对镁的敏感性显著降低²⁺（～16倍减少）比TRPM6同源体。

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图3。

镁对天然TRPM7和过度表达的TRPM6和TRPM7/M6通道的抑制²⁺.在野生型HEK-293细胞中评估天然全细胞TRPM7电流。在Mg中记录了全细胞TRPM6电流（野生型HEK-293细胞中短暂过度表达）²⁺-游离外部溶液，而TRPM7/M6电流（由四环素诱导）在含有2μ米镁²⁺使用螯合剂EDTA来夹持游离的Mg²⁺TRPM6电流的电平。EGTA是Mg²⁺天然TRPM7电流和诱导TRPM7/M6电流的螯合剂。电流记录用移液管溶液的详细组成如所示表1和​和2。2.A类和B、，镁²⁺通过全细胞膜片钳技术评估野生型HEK-293细胞中天然TRPM7电流的敏感性。图表示n个=0、70、210、790、1600和3200μ的7、8、10、11、4和4个电池米镁²⁺分别是。剂量反应拟合呈现IC₅₀569μ米希尔系数为1.27（434 s时提取的峰值电流）。C、，RT-PCR分析native的表达TRPM6号机组（546 bp）和本地TRPM7号机组（519 bp）在HEK-293野生型细胞系和看家基因中，GAPDH公司（532个基点）(第二和第三车道). TRPM6和TRPM7的基因特异性引物分别从异源表达的人类TRPM6与TRPM7质粒中扩增出相同大小的条带(第五和第6车道).D、，镁的全细胞膜片钳分析²⁺阻断瞬时转染的TRPM6。对于0、10、30、100、300、900和1200μ米镁²⁺分别为。E、，镁的全细胞膜片钳分析²⁺TRPM7/M6电流阻塞。图表示n个=0、20、70、210、790、1200、1600和3200μ米镁²⁺分别为。F、，镁的剂量-反应曲线²⁺-天然TRPM7的介导抑制(长虚线取自B类并归一化为1），TRPM7过度表达(小灰线从参考文献中复制。10并归一化为1），TRPM6（在100秒时提取，闭合圆，Hill=0.69）和TRPM7/M6电流（在120 s时提取，开放式圆圈，Hill=0.8）。pF值，微微法拉。

先前的研究表明，镁²⁺单体TRPM7通道的敏感性受激酶结构域的影响，因为激酶缺失点突变减少，激酶缺失突变体增加Mg²⁺灵敏度(8). 以下两种方法用于消除TRPM6激酶的功能：磷酸转移酶活性的关键氨基酸突变（K1804R，TRPM6-K1804R）和去除过表达蛋白中的整个激酶结构域（TRPM6-Δ激酶）(17). 我们首先测定了镁²⁺同源TRPM6-K1804R和TRPM6-Δ激酶通道的敏感性。这两个TRPM6突变体都被镁强烈抑制²⁺类似于TRPM6-WT(图4,A类和B类). 电流归一化显示TRPM6-K1804R对镁的敏感性稍低²⁺尽管TRPM6-Δ激酶比TRPM6-WT更敏感(图4C类). 这说明TRPM6-WT及其激酶突变体都对镁保持高度敏感²⁺块。

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图4。

镁²⁺TRPM6磷酸转移酶活性缺陷点突变体（TRPM6-K1804R）和TRPM6-Δ激酶单独以及在与TRPM7的通道复合体中的敏感性。电流记录用移液管溶液的详细组成如所示表1和​和2。2.A、，镁的全细胞膜片钳评估²⁺TRPM6-K1804R电流闭锁。B、，镁的全细胞膜片钳评估²⁺TRPM6-Δ激酶电流阻断。C、，镁的剂量-反应曲线²⁺抑制各种TRPM6结构携带的全细胞电流。数据表示指示Mg处的峰值电流²⁺浓度归一化为0 Mg时达到的最大电流²⁺分别对100、48和48秒提取的峰值电流进行平均，以进行TRPM6 WT、TRPM6 K1804R和TRPM6Δ激酶的剂量-反应分析。注意，TRPM6 WT的曲线图来源于图2D类。图表示n个=7、6、5、5、6和5，实验（TRPM6 WT，0、10、30、100、300和900μ米镁²⁺），n个=5、5、5，5、5和5，实验（K1804R、0、10、30、100、300和900μ米镁²⁺），和n个=5、8、6个实验（Δ激酶，0、30、100μ米镁²⁺）。D–F型来自异体通道，其中HEK-TRPM7/M6-K1804R细胞和HEK-TRPM 7/M6-Δ激酶细胞分别被四环素诱导共超表达TRPM7/M6-K180 4R和TRPM7/M6Δ激酶。电流记录的内部和外部解决方案(D类和E类)与TRPM7/M6的相同图2E.D中，镁的全细胞膜片钳分析²⁺抑制TRPM7/M6 K1804R电流。吸液管溶液含有指示浓度的游离镁²⁺。图表示n个=0、20、210、790、1600和3200μ米镁²⁺分别为。E、，镁的全细胞膜片钳评估²⁺抑制诱导的TRPM7/M6Δ激酶电流。图表示n个=0、20、210、790、1600和3200μ米镁²⁺分别为。F、，镁的剂量-反应曲线²⁺抑制TRPM7/M6 K1804R（76 s时提取的峰值电流，Hill=1.34）和TRPM7/M6Δ激酶电流（136 s时提取Hill=1.28）。pF值，微微法拉。

接下来，我们分析了这些亚基与TRPM7的异体组合，并构建了TRPM7/M6-KR和TRPM7/M6-Δ激酶的剂量-反应曲线。如所示图4,D类和E类细胞内镁离子对TRPM7/M6-KR电流和TRPM7/M6Δ激酶电流的抑制呈剂量依赖性²⁺但与具有明显IC的TRPM6同源组装件相比，灵敏度低得多₅₀654和638μ米分别为(图4F类). 因此，TRPM6激酶功能的丧失使TRPM7/M6-KR对镁的敏感性稍低²⁺块大于TRPM7/M6-WT（IC₅₀= 466 μ米)表现型类似TRPM7(10). 尽管激酶缺陷突变体的敏感性轻微向右偏移在统计学上并不显著，但它们似乎扭转了TRPM7/M6-WT组合中观察到的轻微向左趋势，尽管它们的镁含量很高²⁺以同源物表示的敏感性。