生物化学杂志。2014年2月21日；289(8): 5083–5096.
Ly49天然杀伤细胞受体与病毒免疫评价素m157的正协同结合模型
动力学和热力学研究*
,‡ ,§ ,¶ ,‡ ,‡ ,¶ ,§ ,‖ ,‡和‡,1
巴勃罗·罗马桑塔
从‡国家科学研究院（IDEHU）、布宜诺斯艾利斯大学国家科学研究委员会（CONICET-UBA）和
Lucreia M.Curto公司
§库米卡生物技术部和库米卡和费西科米卡生物研究所（IQUIFIB）、CONICET-UBA、农业和生物技术学院、布宜诺斯艾利斯大学、阿根廷布宜诺斯艾C1121ABG和
尼古拉斯·厄塔桑
¶Cátedra de Microbiologia Industrial y Biotecnologia，Facultad de Farmacia y Bioquímica，布宜诺斯艾利斯大学，阿根廷，
玛丽亚·B·萨拉塔
从‡国家科学研究院（IDEHU）、布宜诺斯艾利斯大学国家科学研究委员会（CONICET-UBA）和
圣地亚哥·齐亚皮尼
从‡国家科学研究院（IDEHU）、布宜诺斯艾利斯大学国家科学研究委员会（CONICET-UBA）和
玛丽亚·米兰达
¶Cátedra de Microbiologia Industrial y Biotecnologia，Facultad de Farmacia y Bioquímica，布宜诺斯艾利斯大学，阿根廷，
何塞·德尔菲诺
§库米卡生物技术部和库米卡和费西科米卡生物研究所（IQUIFIB）、CONICET-UBA、农业和生物技术学院、布宜诺斯艾利斯大学、阿根廷布宜诺斯艾C1121ABG和
罗伊·A·马里扎
‖马里兰州大学生物科学和生物技术研究所W.M.Keck结构生物学实验室，马里兰州罗克维尔，20850
玛丽莎·费尔南德斯
从‡国家科学研究院（IDEHU）、布宜诺斯艾利斯大学国家科学研究委员会（CONICET-UBA）和
埃米利奥·马尔基奥迪
从‡国家科学研究院（IDEHU）、布宜诺斯艾利斯大学国家科学研究委员会（CONICET-UBA）和
从‡国家科学研究院（IDEHU）、布宜诺斯艾利斯大学国家科学研究委员会（CONICET-UBA）和
¶Cátedra de Microbiologia Industrial y Biotecnologia，Facultad de Farmacia y Bioquímica，布宜诺斯艾利斯大学，阿根廷，
§库米卡生物技术部和库米卡和费西科米卡生物研究所（IQUIFIB）、CONICET-UBA、农业和生物技术学院、布宜诺斯艾利斯大学、阿根廷布宜诺斯艾C1121ABG和
‖马里兰州大学生物科学和生物技术研究所W.M.Keck结构生物学实验室，马里兰州罗克维尔，20850
1由国际遗传工程和生物技术中心拨款CRP/ARG09-02支持。通信收件人：Cátedra de Inmunología和IDEHU，CONICET-UBA，Facultad de Farmacia y Bioquímica，布宜诺斯艾利斯大学，阿根廷布宜诺斯艾利斯，邮编：1113，邮编：956 4to P。，电话：5411-4964-8259；传真：5411-4964-0024；电子邮件：ra.abu.byff@oihclame公司. 2013年11月6日收到；2013年12月11日修订
- 补充材料
补充数据
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GUID:3A4CF1C5-5AE8-46EA-81FD-7D6FAF1728B3
背景：m157是一种结合Ly49自然杀伤细胞受体的巨细胞病毒免疫评价素。
结果：动力学和热力学分析揭示了Ly49/m157相互作用的机制。
结论：这种结合机制具有正协同性和构象选择的特点。
意义：该机制为解释Ly49受体的晶体结构提供了生物物理框架。
关键词：先天免疫、自然杀伤（NK）细胞、表面等离子体共振（SPR）、热力学、病毒免疫学、Ly49、荧光各向异性、m157、鼠巨细胞病毒
摘要
自然杀伤（NK）细胞利用激活和抑制的不同表面受体区分健康细胞和病毒感染或转化细胞。其中，同源二聚体Ly49NK受体可以采用两种不同的构象（后折叠和延伸），对于通过识别病毒免疫逃避素m157来检测感染小鼠巨细胞病毒（CMV）的细胞具有特别重要的意义。m157与激活（Ly49H）和抑制（Ly49I）受体的相互作用控制小鼠CMV的传播。我们进行了动力学和热力学实验来阐明Ly49/m157结合机制。结合表面等离子体共振、荧光各向异性和圆二色性（CD），我们确定描述Ly49H/m157和Ly49I/m157相互作用的最佳模型是构象选择机制，其中只有Ly49（Ly49*）的扩展构象能够结合第一个m157配体，然后将Ly49*/m157复合物结合到第二个m157。这种相互作用的特点是强正协同性，使得第二个m157与Ly49同二聚体结合，序列常数比第一个m151高1000倍（～108
与∼105
米−1). 利用远紫外CD，我们获得了Ly49在结合m157时构象变化的证据，可以解释正合作性。整体机制的速率衰减步骤是Ly49从后折叠到扩展形式的构象转变。从初始状态（后折叠Ly49和m157）到最终状态（Ly49*/（m1572)以不利焓为特征，由有利熵补偿，使相互作用自发。
关键词：先天免疫、自然杀伤（NK）细胞、表面等离子体共振（SPR）、热力学、病毒免疫学、Ly49、荧光各向异性、m157、鼠巨细胞病毒
介绍
自然杀手（NK）2细胞是抵抗病毒感染和肿瘤的先天免疫反应的重要组成部分(1,–三). NK细胞的细胞溶解活性受其表面不同类别受体传递的激活和抑制信号之间的动态相互作用调节。NK细胞接收的主要信号是抑制性的，由其受体与正常水平的主要组织相容性复合体I类（MHC-I）分子相互作用提供。如果MHC-I水平通过致瘤或感染过程降低，则抑制信号减弱，NK细胞被激活。因此，MHC-I表达异常的细胞成为NK细胞活性裂解的靶细胞(1,–三). NK细胞参与清除许多不同的病毒，它们对抵抗疱疹病毒科的感染（包括巨细胞病毒）起着不可或缺的作用(4).
在灵长类动物和啮齿类动物的NK细胞上已经鉴定出几个受体家族，它们监测周围细胞上MHC-I的表达。其中包括灵长类的杀伤性免疫球蛋白样受体和啮齿动物的Ly49家族(1,–三). 小鼠Ly49家族包括至少23个表达或潜在成员（Ly49A–W）。虽然大多数Ly49s在与MHC-I配体结合后抑制NK细胞介导的细胞溶解，但一些Ly49s正在激活。此外，已发现Ly49受体在抗病毒免疫中的关键作用。在一例病例中，小鼠巨细胞病毒（MCMV）的m157基因产物被证明与易感小鼠株（129/J）中的抑制性Ly49（Ly49I）直接相互作用，与抗性小鼠株（C57BL/6）中的活化Ly49（Ly49H）直接相互影响(5,–7). 这些相互作用影响病毒的传播并最终影响其进化存活(4). 在另一种情况下，发现MA/MyJ小鼠中的激活受体Ly49P通过与MCMV蛋白m04修饰的H-2D分子相互作用而对MCMV产生耐药性(8,–11). 巨细胞病毒与人类巨细胞病毒有许多相同的特征，并且这两种病毒都发展了多种类似的免疫逃避机制，涉及NK细胞(12). 因此，MCMV感染已成为研究NK细胞功能的既定模型，尤其是其受体与参与病毒免疫控制的内源性或非自身分子的相互作用(13).
Ly49受体属于C型凝集素样蛋白家族。Ly49是二硫键同二聚体II型糖蛋白，每条链由C型凝集素样结构域组成，称为自然杀伤受体结构域（NKD），由约70个残基的螺旋柄连接到跨膜和细胞质结构域(14,15). 激活受体和抑制受体在细胞质域上不同。MHC结合和非结合形式的Ly49受体有大量结构信息。报道了与H-2D配合物中Ly49A-NKD的晶体结构d日(16,17)，Ly49C NKD绑定到H-2Kb条(18,19)，Ly49C NKD公司(19)，Ly49I NKD公司(20)、Ly49G2 NKD(19)，Ly49L NKD公司(21)和带有柄区的Ly49L NKD(21). 总之，这些研究表明Ly49受体可以采用两种不同的构象：1）后折叠构象，其中Ly49二聚体的NKD后折叠到螺旋柄区域(A类)和2）延伸构造，其中NKD从柄延伸(B类). 这两种构象介导MHC-I识别反式和顺式(21). 背折叠构象使Ly49能够与两个MHC-I分子结合反式（NK细胞上的Ly49和并列靶细胞上的MHC-I）(C类). 相比之下，扩展构象允许Ly49结合一个MHC-I分子顺式（同一NK细胞上的Ly49和MHC-I）(D类). 此外，Ly49受体似乎能够在折叠构象和延伸构象之间切换(21).
Ly49受体采用的构象以及与MHC-I和巨细胞病毒免疫评价素m157的相互作用。
A类，Ly49在NK细胞膜上的背折叠构象(底部). Ly49同型二聚体的NKD(蓝色椭圆)折叠到α螺旋柄区域(蓝色矩形)链间二硫化物绘制为红色条(21).B类，Ly49的延伸构象，其中NKD远离茎延伸。C类，Ly49在折叠构象结合中反式到两个MHC-I分子(绿色)暴露在靶细胞膜上(顶部) (21). 与MHC-I的相互作用由NKD介导。D类，Ly49在扩展构象结合中顺式同一NK细胞上的一个MHC-I分子。E类，Ly49在扩展构象结合中在trans中两个m157分子(红色)在目标单元格上。与m157的相互作用是由Ly49柄区域介导的，而不是NKD(22).
最近，结合MCMV免疫评价素m157的Ly49H的结构被报道(22). 这种MHC-I模拟物在MCMV感染的细胞表面表达，并采用MHC-I折叠，尽管它不结合肽或与β2-微球蛋白(23). 令人惊讶的是，m157与Ly49H的柄区结合，而不是与识别MHC-I的NKD结合(E类). 在复合物中，两个m157单体与Ly49H二聚体结合，使得螺旋柄斜穿过m157的α1/α2平台。这种识别模式仅在Ly49处于扩展状态时才可能出现，这种构象在顺式(D类). 然而，Ly49/m157相互作用的结合机制尚不清楚，即采用两种截然不同构象的受体最终与两个m157配体结合。
我们进行了动力学和热力学实验，以剖析激活Ly49H和抑制Ly49I受体的Ly49/m157结合机制。将表面等离子体共振（SPR）、荧光各向异性和圆二色性（CD）与详尽的统计分析相结合，我们确定描述Ly49H/m157和Ly49I/m157相互作用的最佳模型是包含正协同性的构象选择机制。我们进一步建立了该机制的速率限制步骤，并根据自由能、焓、熵和热容表征了反应坐标。
实验程序
蛋白质表达与纯化
来自小鼠菌株C57BL/6的Ly49H的胞外部分（残基88–266）包含NKD和大部分茎部区域，被克隆到表达载体pET21a（Novagen）的NheI和BamHI位点。按照Ly49L的描述生产蛋白质(21). 简而言之，Ly49H在大肠杆菌BL21（DE3）作为包涵体；在6中溶解米胍；并折叠起来体外稀释成30%（v/v）甘油，0.4米精氨酸，50米米Hepes（pH 7.0），100 m米氯化钠，3米米还原型谷胱甘肽和0.8米米氧化谷胱甘肽。Ly49H经Superdex 200 HR和Mono S连续柱纯化为二硫键同二聚体（GE Healthcare）。来自小鼠菌株129/J（残基88–269）的Ly49I细胞外部分的制备方法类似。
为了生产生物素化的Ly49H和Ly49I，在氨基酸位置88的受体N末端添加了一个18残基Avi标签（MASGLNDIFEAQKIEWHE）（亲和力）。标记蛋白（Ly49HAvi和Ly49IAvi）在大肠杆菌并以与野生型蛋白质相同的方式进行纯化。根据制造商的协议（Avidity），使用酶BirA进行生物素化。
成熟型m157的细胞外部分（残基1–285）与C末端His融合6标签和蛋白酶3C裂解位点。将其克隆到杆状病毒转移载体pAcGP67B（BD Biosciences）中，与Baculogold Bright AcMNPV DNA共转染到Sf9昆虫细胞中后用于生产重组杆状病毒。为了产生m157，在Sf900 II培养基（Invitrogen）中培养的Sf9细胞以2倍感染率感染重组病毒，并在27°C下培养72小时。用镍从上清液中纯化分泌蛋白2+氨三乙酸珠（GE Healthcare）。用0.1洗脱m157米三氯化氢（pH 8.0），0.5米氯化钠和0.5米咪唑。亲和纯化m157的产量通常为～10 mg/L培养物。
远紫外圆二色性
使用0.1-cm石英比色杯和Jasco J-810分光偏振仪，在25°C下记录Far-UV光谱（190–250 nm），并用d日-10-cam用于磺酸。扫描速度为20 nm/min，时间常数为1s。记录三次扫描的平均值，以提高信噪比，并从所有测量值中减去缓冲谱。
摩尔椭圆度（[θ]M（M）单位为度厘米2二甲醇−1)使用以下公式计算(24): [θ]M（M）= 100θ/信用证其中θ是从实验光谱获得的椭圆度，我是以厘米为单位的光学长度路径，以及c（c）等于摩尔蛋白质浓度乘以每个蛋白质分子的残基数。
蛋白质浓度为2μ米对于Ly49H或Ly49I和2或4μ米对于50 m内的m157米磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和150 m米氯化钠。为了研究Ly49s的构象变化，在收集数据之前，将受体与m157配体在室温下以1:1和1:2的Ly49/m157摩尔比孵育3分钟。这些结果与Ly49入站谱和m157入站谱的代数和重叠。为了计算摩尔椭圆度，将数据归一化为每个混合物中氨基酸的平均重量。使用GraphPad Prism软件和Microsoft Excel进行数据分析。
SPR结合分析
通过SPR测量Ly49Avi受体与m157的相互作用。所有结合分析均在5、10、15、25和30°C下使用BIAcore T100生物传感器在含有10 m的流动缓冲液中进行米磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和150 m米氯化钠。生物素标记的Ly49HAvi或Ly49IAvi被定向耦合到CM5芯片上，链霉亲和素先前通过伯胺基团与胺偶联试剂盒（BIAcore）固定在该芯片上。将每个Ly49Avi受体的100或200个反应单位（RU）固定在芯片上。为了进行平衡结合和动力学测量，将m157注入两个流动池；第一个细胞是链霉亲和素参考细胞，第二个细胞涂有Ly49HAvi或Ly49IAvi。用于m157的浓度范围为0–12μ米结合程度计算为Ly49细胞RU和对照细胞RU之间的差异(26).
对于平衡分析，根据m157浓度绘制了每种配体浓度在最大RU值下的响应水平，并将数据点拟合到希尔方程(27). 对于动力学分析，关联和离解数据使用指数函数总和的表达式进行拟合(28). Levenberg-Marquard算法(29)用于非线性最小二乘拟合。线性化方法(30)作为第一种解释Ly49H/m157和Ly49I/m157对相互作用机制的方法。
分析了不同的动力学模型来解释相互作用数据。使用两种不同密度的固定化Ly49H在不同温度、不同流速和接触时间下获得Ly49H/m157相互作用的所有传感器图。按照莫顿的描述，将它们一起分析并进行全球拟合等。(30)和Myszka等。(31)根据每个拟议模型的微分方程，使用软件BIAevaluation 4.1（BIAcore）和Levenberg-Marquard算法进行数值积分(29). 对于数值积分，采用了五阶Runge-Kutta-Fehlberg方法(29). 我们对Ly49I/m157相互作用进行了类似的研究。对于热力学分析，根据绝对反应速率的经典过渡态理论，将使用模型D获得的动力学速率常数（见“结果”）与温度的倒数绘制成Eyring图(32).
荧光各向异性结合分析
用异硫氰酸荧光素（FITC）异构体I（Sigma-Aldrich）标记Ly49受体。简言之，将1mg/ml纯化的Ly49H或Ly49I透析50米米碳酸钠（pH 9.5），然后在50 m的透析微室中培养米碳酸钠（pH 9.5），150 m米NaCl和1 mg/ml FITC在4°C下持续2天。通过对标记蛋白进行10 m透析，去除残留的标记试剂米磷酸盐（pH 7.4）和150 m米氯化钠。
Ly49-FITC（1μ米)用不同浓度的m157（0–4μ米)在室温下黑暗中平衡3分钟后，当相互作用达到平衡时，在Jasco FP-6500荧光光谱仪中测量25°C下的荧光各向异性。用偏振光（λ前任=495 nm），测量发射（λ相对长度单位=520 nm），相对于激励源90°(25).
在每个滴定点测量15次各向异性，并计算平均值和S.D.值。各向异性图与构建了m157浓度。连接各向异性的方程(第页)总m157浓度与实验数据拟合。使用Mathematica 9软件（Wolfram Research）利用Levenberg-Marquard算法进行非线性最小二乘数据拟合(29).
为了测定Ly49I/m157对的化学计量比，在不同Ly49I浓度（1和2.6μ米)进行了分析。根据这些数据推导出了结合等温线，并绘制了归一化信号图问，定义为问= (第页−第页最小值)/第页最小值哪里第页是评估的每个m157浓度的各向异性第页最小值是游离Ly49的各向异性，与结合配体的密度表示化学计量比(33,–35).
结果
重组蛋白表达
Ly49H和Ly49I的细胞外部分（分别为残基88-266和88-269）在体外正如我们之前描述的Ly49L的细菌包涵体折叠(21). 重组蛋白包括整个NKD和大多数柄结构域，包括Cys100在Ly49L的晶体结构中(21)通过二硫键（Cys）连接两个Ly49单体100-赛斯100)秸秆区域之间。我们通过杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞分泌出可溶性m157（残基1-285）。
平衡SPR分析
作为研究Ly49受体与m157相互作用的首次尝试，我们在平衡结合条件下对Ly49H/m157和Ly49I/m157对进行了SPR实验。Ly49H和Ly49I在其N端被定点生物素化，并定向耦合到预先涂有链霉亲和素的生物传感器表面。不同浓度的m157（0–12μ米)在固定化Ly49上注射，并记录传感器图。该实验在5至30°C的温度范围内进行。显示了25°C下Ly49H和Ly49I每m157浓度的最大响应（RU）图。在这两种情况下，观察到实验点有明显的S形趋势。考虑到Ly49同源二聚体对m157有两个可能的结合位点(22)，这些结果表明合作绑定。
SPR平衡分析。最大响应图(R（右）)在固定化~100 RU Ly49H上通过注射测定每m157总浓度获得的RU(A类)和Ly49I(B类)温度为25°C。曲线描述了希尔方程的拟合。这个n个H（H）Ly49H/m157对的系数为1.7±0.1，Ly49I/m157对为1.9±0.2。显示残余误差在下面每个面板。
我们使用希尔方程分析了这些曲线(补充信息). 将该方程拟合到实验点，得到n个H（H）Ly49H/m157对的系数为1.7±0.1，Ly49I/m157对为1.9±0.2。因为n个H（H）大于1，这一结果表明这两个结合对具有正的协同性。
荧光各向异性平衡分析
为了进一步表征Ly49/m157相互作用，我们在平衡结合条件下进行了荧光各向异性分析。用FITC标记Ly49，并用不同的m157浓度孵育。显示了m157浓度的荧光各向异性。Ly49H-FITC（1μ米)和Ly49I-FITC（1和2.6μ米)用m157滴定，在相互作用达到平衡后测量荧光各向异性。可以建立一个模型来解释实验数据并计算Ly49同型二聚体每个m157结合位点的亲和常数(33,34). 反应方案和方程式见补充信息.
平衡荧光各向异性(第页)作为m157浓度的函数。1 μ米Ly49H-FITC公司(A类), 1 μ米Ly49I-FITC公司(B类)和2.6μ米Ly49I-FITC公司(C类)在25°C下用m157滴定，在相互作用达到平衡后测量荧光各向异性。曲线描述了与各向异性相关的方程的拟合(第页)总m157摩尔浓度。常量(K（K）G公司1,K（K）G公司2,K（K）秒1,K（K）秒2,k、和k'）如所示.误差线代表S.D。
估计的全局常数K（K）G公司1和K（K）G公司2，序列宏观常数K（K）秒1和K（K）秒2和微观常数k和k‘Ly49H和Ly49I的每个结合位点在第一个m157与Ly49H同二聚体的结合具有K（K）秒1（5±3）×105
米−1，第二个m157的绑定具有K（K）秒2（3±2）×108
米−1在Ly49I的情况下获得的常数相似：（5±4）×105
米−1用于绑定第一个m157和（2±1）×108
米−1用于绑定第二个m157。对于两个受体-受体对，第二个Ly49位点结合m157的序列宏观常数是第一个Ly49部位的1000倍。微观常数与k′ ⋙k。该分析清楚地表明两个Ly49单体在结合m157中的正合作性(33,–35). 与协同性相关的能量可以根据Cantor和Schimmel的报告进行计算(34). 与第一个m157分子相比，位点/位点相互作用使第二个m151分子稳定了约4–5 kcal/mol。
表1
用荧光各向异性分析数学拟合估算Ly49H/m157和Ly49I/m157结合常数
K（K）G公司1和K（K）G公司2，全局宏观常数；K（K）秒1和K（K）秒2，序列宏观常数；k和k′，微观常数。
| K（K）G公司1× 105 | K（K）G公司2× 1013 | K（K）秒1× 105 | K（K）秒2× 108 | k× 105 | k′ × 108 |
|---|
| 米−1 | 米−2 | 米−1 | 米−1 | 米−1 | 米−1 |
| 赖氨酸49H/m157 | 5 ± 3 | 12 ± 8 | 5 ± 3 | 3 ± 2 | 11 ± 6 | 1 ± 1 |
| Ly49I/m157 | 5 ± 4 | 5 ± 4 | 5 ± 4 | 2 ± 1 | 9 ± 8 | 0.6 ± 0.9 |
Ly49I/m157化学计量法的测定
为了使用反应方案1进行荧光各向异性数据分析，我们必须知道Ly49s和m157之间相互作用的化学计量比。Ly49H/m157相互作用的化学计量比先前通过分析超速离心测定：一个Ly49H二聚体结合两个m157分子(22). 然而，未确定Ly49I/m157的化学计量比。在这里，我们使用两种Ly49I-FITC浓度对荧光各向异性数据进行了分析，给出了归一化信号图问作为结合配体密度的函数() (). 该分析的详细说明见补充信息.最大响应问当结合配体密度接近2时达到，表明每Ly49I二聚体两个m157分子的化学计量比().
归一化荧光各向异性信号图问作为结合配体密度的函数().使用两种Ly49I-FITC浓度（1和2.6μ米)允许我们计算问和. The虚线表明Ly49I/m157相互作用的化学计量比为1:2，即响应点问达到最大值。
远紫外CD平衡分析表明结合后构象发生变化
对第二个位点亲和力增加的一个可能解释是Ly49的构象改变改善了第二个m157配体的结合。为了验证这个假设，我们用Ly49和m157进行了远紫外CD实验。显示了Ly49H和Ly49I的远紫外CD光谱，以及与Ly49和m157光谱的代数和相比，Ly49和m157在不同摩尔比下孵育后获得的光谱。这两种蛋白质的共吸收产生的信号强度（摩尔椭圆度，[θ]）低于两个单独光谱的代数相加产生的信号，这强烈表明结合时发生构象变化。这将在结构上支持在顺序宏观结合常数中观察到的差异（正协同性）。
Ly49H和Ly49I与m157组合的Far-UV CD光谱。Ly49H公司(A类)和Ly49I(B类)以1:1的摩尔比与m157预孵育(实心绿线)和1:2(实心红线)以及Ly49和一个m157分子光谱的代数和(绿色虚线)或Ly49和两个m157分子的光谱(红色虚线)如图所示。预孵育光谱和代数和光谱之间的差异表明m157结合时的构象变化。度，度。
动力学SPR分析
在证明Ly49H和Ly49I与m157相互作用的正协同性并获得结合时构象变化的证据后，我们接下来试图通过测量现象的动力学并根据Morton分析数据来阐明潜在的结合机制等。(30). 我们使用不同的流速和不同的接触时间，在两种不同密度的Ly49固定在涂有链霉亲和素的CM5芯片上，在不同温度下进行了上述几个SPR实验。这些变化是为了排除质量传递效应和解离阶段的重新结合(36)并使绑定模型的选择更加稳健(26).
作为阐明相互作用分子机制的第一种方法，我们将传感器图中的关联和分离数据拟合为指数函数的总和(28)利用Levenberg-Marquard算法(29).,A类和B类，分别显示25°C下Ly49H/m157和Ly49I/m157对的关联和解离SPR数据，并用双指数函数拟合。残差也显示出来，并且是随机分布的。单指数函数与实验数据拟合不好，且χ2使用三指数方程（未显示数据）不会进一步提高值。
25°C下SPR动力学数据分析。
A类和B类显示了Ly49H/m157和Ly49I/m157对的缔合和离解SPR数据，分别用两个指数函数拟合。残差随机分布，如图所示在下面每个面板。C类，响应的一阶导数(R（右）)作为Ly49H/m157关联数据响应的函数(左侧面板)和Ly49I/m157对(右侧面板).D类，响应的半对数图与对这对夫妇的分离时间数据进行了分析。这些绘图(C类和D类)描述双相曲线并指出至少两步机制。这与双指数函数的拟合是一致的(A类和B类).
在C类，我们绘制了响应的一阶导数，作为Ly49H/m157和Ly49I/m157关联数据响应的函数。如果交互是简单的1:1绑定，则此函数应给出一条直线。本研究中所涉及的任何一对都不是这样，并且曲线图描述了一种双相行为。
在D类，显示了解离数据的线性化。同样，如果交互是简单的1:1绑定，则此函数应该生成一条直线，但它会呈现一条双相曲线。这些图表(,C类和D类)明确支持相互作用现象的双相行为，与拟合的指数函数数一致,A类和B类该观察结果表明，结合机制至少涉及两个单独的步骤。
显示了k光突发事件拟合双指数函数后获得（补充信息) (28)到传感器图中的关联数据。在A类，我们显示k光突发事件
与m157浓度对应于慢指数(k光突发事件1)Ly49H/m157和Ly49I/m157对的方程11的函数分量。这种反双曲依赖性指向构象选择机制(37,–40)其中受体的构象中只有一种能够与配体结合，因此，这种构象被选在另一种构象之上（反应方案1）。
在B类，绘图kobs2系统
与m157浓度对应于方程式11中所研究的两对相互作用的快速指数函数分量。点的线性分布表示简单的1:1交互作用(39,40)与第二个m157配体的Ly49*/m157络合物（反应方案2）。
考虑到我们迄今为止的结果和可用的结构信息(15,16,18,19,21,–23)，我们考虑了可能描述至少涉及两个步骤的绑定机制的不同模型(). 为了完整起见，我们还展示了经典的1:1 Langmuir模型（模型A）。我们考虑了以下假设，以生成用于描述交互作用的测试模型。1） 根据Ly49H/m157复合物的结构和分析超速离心分析，化学计量比为Ly49:m1571:2（一个Ly49二聚体结合两个m157配体）(22)以及Ly49I/m157相互作用的荧光各向异性分析。2） Ly49受体可以在折叠（Ly49）和延伸（Ly49*）构象之间切换，如x射线晶体学、流式细胞术和FRET对Ly49与MHC I类配体结合的研究所示(21,41). 3） Ly49的两个原异构体之间存在正的协同性，这与此处通过荧光各向异性测量的结合常数以及我们在远紫外CD实验中观察到的构象变化一致。4） 当Ly49按照Ly49H/m157复合物的结构处于扩展构象时，m157只能与Ly49结合(22). 这意味着不应考虑物种Ly49/m157（m157与后折叠的Ly49原聚体1结合）和m157/Ly49（m157-与后折叠Ly49原聚体2结合）。5） 小孢子种Ly49*/m157（m157与原单体1结合）和m157/Ly49*（m151与原双体2结合）是等效的。第一个m157与一个原单体的结合在性质上与另一个原双体的结合相同。这是因为Ly49是对称的同二聚体(19). 6） 背折和伸展形式之间的构象变化是一致的；也就是说，这两个原聚体总是以相同的构象存在，或者是折叠的，或者是延伸的。一个单体的背折叠构象和另一个扩展构象的混合物种不存在。这个假设是基于具有柄区的Ly49s的晶体结构(21,22)其中两个原聚体采用相同的构象。
25°C下SPR关联动力学数据分析。
k光突发事件将两个指数函数拟合到传感器图的关联数据后获得与m157浓度。A类,k光突发事件1
与m157浓度对应于Ly49H/m157和Ly49I/m157对的慢指数函数分量。这些分布对应于构象选择机制。B类,kobs2系统
与m157浓度对应于所研究的两种相互作用的快指数函数分量。点的线性依赖性表明Ly49*/m157络合物与第二个m157配体的简单1:1相互作用。
提出了Ly49和m157之间结合机制的模型。根据文中所述的假设，Ly49H/m157和Ly49I/m157相互作用的模型应至少包括两个步骤。A类，背面折叠Ly49；A类*，延长Ly49；B类，m157。
确定中显示的模型的步骤是最适合我们实验数据的，我们应用了几个统计标准，包括χ2(χ2/n个)修正了Akaike准则（模型选择准则）、Bayesian选择准则（贝叶斯信息准则）和Hannan-Quinn信息准则对可用动力学数据的影响。这些统计数据的方程式在补充信息.
按照莫顿的描述，对Ly49H/m157对在不同温度、不同流速和接触时间以及不同固定化Ly49密度下的所有传感器图进行了分析和全局拟合等。(30)和Myszka等。(31)根据使用BIAevaluation 4.1软件和Levenberg-Marquard算法进行数值积分得出的每个拟议模型的微分方程(29). 对于数值积分，采用了五阶Runge-Kutta-Fehlberg方法(29). 我们对Ly49I/m157对进行了类比。计算的统计值显示在补充表S1和S2分别用于Ly49H/m157和Ly49I/m157对。根据这些标准，D型似乎最适合这对夫妇。为了阐明是否有同样有效的模型来描述相互作用，我们在两个不同的模型之间应用了茨万齐格选择准则单位和v（v）（方程式见补充信息). 使用后者，我们将所有模型与模型D进行了比较。
Zwanzig准则获得的值如下所示补充表S1和S2它们表明，模型C和D似乎同样适用于描述Ly49H/m157和Ly49I/m157对的结合机制。实际上，模型C似乎比模型D更好地解释了Ly49I/m157的相互作用。模型D描述了一种构象选择机制，其中Ly49以两种不同构象共存（后折叠（Ly49）和扩展（Ly49*）），而m157仅在Ly49处于扩展构象时才能够结合。构象变化意味着最慢的速率限制步骤，两个未结合物种（Ly49和Ly49*）在快速预平衡中共存(k一2≫kd日1). 接下来的机制涉及第二个m157配体与Ly49的延伸构象的结合，而没有进一步的构象变化。第一个m157配体的结合与观察到的行为一致k光突发事件1作为m157浓度的函数(A类)这是前面描述的构象选择模型的典型特征；和kobs2系统
与m157的浓度图B类也与第二个m157配体与Ly49的延伸形式的结合一致，没有随后的构象变化。D型也符合可用的结构数据(22).
模型C在第一个平衡中描述了一个浓缩步骤，总结了模型D的前两个阶段：Ly49和Ly49*之间的构象变化以及第一个m157的后续结合。第二个平衡与模型D中的相同。然而，模型C暗示构象发生了变化只是作为一个结果第一个绑定事件的(即它忽略了形式Ly49和Ly49*在绑定之前的预先存在）。此外，模型D与和因此，我们认为模型D最适合描述Ly49H/m157和Ly49I/m157绑定机制。
显示了Ly49H/m157和Ly49I/m157对在5、10、15、25和30°C温度下的传感器图，以及使用模型D拟合的曲线。动力学速率常数（关联速率k一和离解率kd日)和宏观序贯平衡常数(K（K）A类1对于构象变化平衡，K（K）A类2用于绑定第一个m157，以及K（K）A类三对于第二个m157）的结合，用模型D微分方程的数值积分分析的SPR数据确定，如所示和对于两种复合物Ly49H/m157和Ly49I/m157。
不同温度下Ly49/m157相互作用的传感器组图。显示了5、10、15、25和30°C下Ly49H/m157和Ly49I/m157相互作用的传感器图。在每个传感器图的一侧，显示了检测的m157摩尔总浓度。黑色线条使用BIAevaluation 4.1软件对模型D的微分方程进行数值积分，得出拟合曲线。动力学速率常数和宏观顺序平衡常数如所示和分别适用于Ly49H/m157和Ly49I/m157对。R（右），回应。
表2
根据模型D在不同温度下的SPR动力学分析估算Ly49H/m157和Ly49I/m157的动力学速率常数
| T型 | k一1× 10−5 | kd日1× 10−3 | k一2× 10三 | kd日2 | k一三× 105 | kd日三× 10−3 |
|---|
| °C类 | 秒−1 | 秒−1 | 米−1
秒−1 | 秒−1 | 米−1
秒−1 | 秒−1 |
| 赖氨酸49H/m157 | | | | | | |
| 5 | 510 ± 20 | 0.02 ± 0.01 | 2.8 ± 0.1 | 0.130 ± 0.003 | 0.52 ± 0.01 | 3.69 ± 0.09 |
| 10 | 0.02 ± 0.01 | 13 ± 1 | 10.7 ± 0.2 | 0.97 ± 0.08 | 6.8 ± 0.5 | 2.56 ± 0.04 |
| 15 | 0.653 ± 0.008 | 12 ± 5 | 58 ± 3 | 0.99 ± 0.07 | 52 ± 3 | 107 ± 11 |
| 25 | 0.4 ± 0.1 | 18 ± 1 | 6.99 ± 0.08 | 1.58 ± 0.02 | 16.1 ± 0.2 | 5.63 ± 0.05 |
| 30 | 0.3 ± 0.1 | 10.2 ± 0.7 | 24.5 ± 0.3 | 0.0159 ± 0.0009 | 30.5 ± 0.9 | 8.9 ± 0.8 |
|
| Ly49I/m157 | | | | | | |
| 5 | 59 ± 5 | 0.6 ± 0.3 | 12.4 ± 0.5 | 0.176 ± 0.004 | 0.312 ± 0.007 | 0.12 ± 0.01 |
| 10 | 20 ± 10 | 12 ± 3 | 26.2 ± 0.2 | 0.43 ± 0.03 | 43 ± 3 | 2.60 ± 0.07 |
| 15 | 0.9 ± 0.3 | 10.4 ± 0.5 | 68 ± 3 | 4.14 ± 0.06 | 4.4 ± 0.2 | 3.05 ± 0.06 |
| 25 | 180 ± 60 | 0.0266 ± 0.0004 | 16.8 ± 0.1 | 0.396 ± 0.002 | 2.65 ± 0.02 | 2.01 ± 0.02 |
| 30 | 740 ± 10 | 0.0100 ± 0.0007 | 4.28 ± 0.07 | 0.00093 ± 0.00006 | 0.04 ± 0.02 | 0.04 ± 0.02 |
表3
Ly49H/m157和Ly49I/m157结合平衡常数由SPR动力学分析估算，模型D在不同温度下计算为K（K）A类=k一/kd日
| T型 | K（K）A类1 | K（K）A类2× 104 | K（K）A3号× 108 |
|---|
| °C类 | | 米−1 | 米−1 |
| 赖氨酸49H/m157 | | | |
| 5 | 330 ± 40 | 2.2 ± 0.1 | 0.140 ± 0.001 |
| 10 | (1 ± 1) × 10−5 | 1.1 ± 0.1 | 2.7 ± 0.2 |
| 15 | (6 ± 2) × 10−4 | 5.9 ± 0.7 | 0.49 ± 0.08 |
| 25 | (2.4 ± 0.9) × 10−4 | 0.44 ± 0.01 | 2.86 ± 0.06 |
| 30 | (3 ± 2) × 10−4 | 15 ± 1 | 3.4 ± 0.4 |
|
| Ly49I/m157 | | | |
| 5 | 1.0 ± 0.6 | 7.0 ± 0.4 | 2.5 ± 0.3 |
| 10 | 0.02 ± 0.01 | 6.1 ± 0.5 | 17 ± 2 |
| 15 | (8 ± 3) × 10−4 | 1.6 ± 0.1 | 1.4 ± 0.1 |
| 25 | 70 ± 20 | 4.25 ± 0.05 | 1.32 ± 0.02 |
| 30 | 740 ± 60 | 460 ± 30 | 1 ± 1 |
值得注意的是，宏观序列常数K（K）A类2和K（K）A类三计算的(K（K）A类=k一/kd日)从动力学分析的SPR数据与常数一致K（K）秒1和K（K）秒2通过荧光各向异性分析测定。两者都有K（K）A类2和K（K）秒1为～105
米−1、和K（K）A类三和K（K）秒2为～108
米−1这验证了通过不同方法获得的结果，将动力学和热力学实验整合到一个一致的画面中。
Ly49/m157相互作用的热力学分析
为了完成Ly49与m157结合的研究，我们使用将模型D应用于SPR数据获得的动力学速率常数进行了Eyring分析(42). 这些常数对温度的依赖关系如图所示对于Ly49H/m157和Ly49I/m157对。将Eyring方程拟合到参考温度为25°C的实验点上，得出热力学活化参数ΔH（H）o个‡（活化焓），ΔS公司o个‡（激活熵）和ΔCpo个‡（活化热容量）(补充表S3). ΔG公司o个‡还根据动力学速率常数计算了活化自由能。
使用不同温度下的动力学速率常数进行Eyring分析。使用模型D应用于Ly49H/m157的SPR数据后获得的动力学速率常数进行Eyring分析(A类)和Ly49I/m157相互作用(B类)如图所示。将Eyring方程拟合到25°C下的实验数据点，以获得热力学活化参数ΔH（H）o个‡, ΔS公司o个‡和ΔCpo个‡(补充表S3).实心圆圈指示关联数据，以及空圆圈指示分离数据。误差线代表S.D。
描述25°C下反应进展的景观如所示对于自由能(A类)连同它反褶积成焓(B类)和熵(C类)Ly49H/m157和Ly49I/m157相互作用的成分。该图表明，该过程中的限速步骤可归因于从后折叠到扩展形式的构象变化。约30 kcal/mol的焓屏障限制了该过程，由于熵的增加，该过程变得自发。相比之下，两个m157配体随后与扩展形式的Ly49结合的特点是形成小的熵势垒以形成过渡状态，过渡状态由有利的能量焓释放进行补偿。总的来说，初始状态的全局热力学参数（自由形式的背折叠Ly49和m157）到最终状态（Ly49*/（m157）2络合物）的特征是系统中的焓增加（吸热反应），由熵增加补偿，使相互作用自发。
25°C下的反应过程景观。自由能在25°C下的反应进度图(A类)以及焓的反褶积(B类)和熵(C类)Ly49H/m157的组件(红色)和Ly49I/m157对(绿色)如图所示。该图表明，全局速率限制步骤是Ly49从后折叠状态到扩展状态的构象变化。A类，反向折叠49；A类*，延长Ly49；B类，m157；A类T型，Ly49处于构象变化步骤的过渡状态；A类*–B类，绑定到第一个m157的过渡状态；A类*B类，扩展Ly49结合到一个m157分子；A类*B–B类，绑定到第二个m157的过渡状态；A类*B类2，延伸的Ly49与两个m157分子结合。
讨论
在这项工作中，我们详尽地描述了Ly49H和Ly49I与来自MCMV的免疫evasin m157的相互作用。我们确定了控制m157与Ly49第一和第二原聚体结合的常数，并证明配体结合涉及正合作性。我们通过进行互补的动力学和热力学实验得出了这个结论。最后，我们确定了最能描述结合机制的模型，并进行了热力学分析，以确定Ly49/m157相互作用的能量分布。
序列宏观常数K（K）秒1和K（K）秒2用荧光各向异性和平衡常数测量K（K）A类2和K（K）A类三从SPR数据得出的值与先前研究中报告的值不同(22,23).K（K）秒1和K（K）A类2对应于第一个m157配体与Ly49原聚体的结合，位于～105
米−1范围。另一方面，K（K）秒2和K（K）A类三对应于第二个m157配体与另一个Ly49原聚体的结合，并落在～108
米−1范围。亚当斯测定的结合常数等。(23)使用SPRK（K）D类=166 n米(K（K）A类= 6 × 106
米−1)对于Ly49I/m157相互作用和K（K）D类= 1 μ米(K（K）A类= 1 × 106
米−1)用于Ly49H/m157相互作用。这个K（K）D类由Berry测量等。(22)使用SPR的Ly49H/m157对为K（K）D类= 81.0 μ米(K（K）A类= 1.23 × 104
米−1). 这些差异可以用以下因素来解释。1） Berry使用的m157等。(22)由MCMV的G1F应变而非亚当斯使用的m157的史密斯应变导出等。(23)在本研究中。这些m157分子在与Ly49的界面上的几个氨基酸中有所不同(22). 2） 在之前的研究中，固定在生物传感器表面上的Ly49的量（Berry为～500 RU等。(22)和～亚当斯的600 RU等。(23))是我们研究中固定量的5-6倍（～100 RU）。高表面密度放大了质量传递效应，从而改变了结合动力学并模糊了相互作用机制(26). 3） 在之前的两项研究中，仅使用Langmuir 1:1相互作用模型分析了SPR实验得出的传感图和图。相比之下，我们进行了统计计算，以确定哪一个假设模型最适合，并使用该模型从SPR数据估计结合常数。我们还使用荧光各向异性确定了结合常数，这是一种用于验证SPR数据的独立解决方案技术。如果我们将传感器图拟合到简单的Langmuir 1:1模型K（K）A类值应该是～106
米−1。此值与K（K）A类Adams报告的值等。(23)但与贝瑞不同等。(22)可能是因为上述m157的不同MCMV应变源。这项工作强调了明智选择约束模型作为正确解释定量结果的前提的重要性。
根据之前来自Ly49A流式细胞术和FRET研究的证据(21,41)，我们使用CD分析检测了不同的Ly49构象。后退等。(21)表明Ly49A的两种状态，即后折叠和扩展，共存并介导反式和顺式在我们的远紫外CD实验中，光谱表明当m157与Ly49结合时发生构象变化。光谱强度的变化可能代表了背折叠形式的构象平衡位移，背折叠形式是Ly49s在没有配体的情况下的主要（或默认）构象(21)，到可用于绑定m157的扩展形式(22).
我们首先尝试使用莫顿描述的线性化方法，通过将指数函数拟合到动力学数据来理解结合机制等。(30)作为石蕊测试。这种方法表明至少有两个连续的半反应，并导致我们提出了几个不同的机制来解释SPR数据。在应用了大量统计方法后，我们得出结论：构象选择模型（模型D)最适合描述Ly49/m157相互作用。该模型包括解释实验数据所需的最少假设（奥卡姆剃刀准则）：快速预平衡中Ly49从后折叠到扩展形式构象变化的第一个限速步骤(k一2≫kd日1)以及对应于第一和第二m157配体结合的两个连续步骤。显著的相互作用能与这种两步结合现象有关（～4–5 kcal/mol）。
为了研究这种构象选择机制是否也适用于Ly49与MHC-I的结合，我们对Ly49P/H-2D进行了SPR分析k，Ly49H/H-2Dd日和Ly49I/H-2Dd日交互对。三然而，我们在最大响应图中没有观察到S形趋势与Ly49H/m157和Ly49I/m157相互作用的配体浓度。这一发现很容易用MHC-I在两个后折叠（反式)和延伸（英寸顺式)构象(21)而m157只能在扩展构象中结合Ly49(22). 因为未结合的Ly49主要存在于折叠态(21)，MHC-I无需切换到扩展状态即可绑定。
当两个分子的相遇是速率限制步骤时，反应是扩散控制的，当过渡态的形成是速率限制时，反应由活化能垒的高度控制(43). 这个k一2和k一三此处研究的相互作用值(k一2∼ 10三
米−1秒−1和k一三∼ 105
米−1秒−1)比典型值低3-6个数量级k一涉及两个不带电且均匀反应球体（～3×10）碰撞的扩散控制机制的最大值9
米−1秒−1)由De La Cruz和Pollard定义(44). 此外，ΔH（H）o个‡我们获得的Ly49/m157缔合反应值（约为−10至−20 kcal/mol）高于水中扩散限制反应的报告值（约−4至−5 kcal/mol/）(45). 因此，我们得出结论，Ly49/m157结合受活化能控制，形成过渡态，这意味着存在大量的能垒。此外，常数k一1和kd日1与构象变化平衡相对应的是～10−5和10−3秒−1分别是。这表明当没有配体时，平衡被转移到后折叠的Ly49形式(K（K）A类1∼ 10−2)，这一观察结果与Ly49的晶体学研究一致(21).
在研究描述第一和第二m157与Ly49H和Ly49I扩展态结合的速率常数时，我们发现了这些关系k一三>k一2和kd日三<kd日2，这使K（K）A类三>K（K）A类2因此，Ly49*/（m157）2与Ly49*/m157复合物相比，复合物形成更快，解离更慢。这种差异可以通过假设描述第一个m157相互作用的步骤受到第一个构象平衡的影响和制约来解释，这有效地减缓了第一个配体的结合。当添加第一个m157时，必须克服全球速率限制能量屏障(A类). 高解离率kd日2可能是因为存在Ly49/m157型非常不稳定的物种（m157结合到后折叠状态），该物种快速分解。此外，Ly49*/m157物种的稳定性与过渡态非常相似(A类)，使分离成为更频繁的事件。观察到的第二个m157结合率的增加可以用Ly49采用扩展构象后第二个位点的可用性来解释。离解率kd日三慢于克朗2由于最终络合物Ly49*/（m157）的高度稳定性2(ΔG公司0介于−10和−20 kcal/mol之间）。
自由活化能景观A类可以反褶积成焓(B类)和熵(C类)组件。焓垒（正ΔH（H）o个‡)必须克服约40–50 kcal/mol，以实现Ly49的扩展形式(B类)这表明构象转变需要能量来打破水分子和氨基酸残基之间以及残基之间的氢键和其他接触。事实上，在后折叠Ly49的晶体结构中，茎部区域与NKD进行了大量接触，这些接触在伸展时会丢失(21). 然而，这一步具有有利的熵（正T型ΔS公司o个‡) (C类)，这是反应的驱动力，这意味着与后折叠构象相比，伸展构象具有更大的灵活性。ΔCpo个‡从后折叠到扩展形式的过渡值为正值（～2 kcal/mol），表明疏水表面的溶剂暴露(46,–48)，与可用结构数据一致的图片(21). 相比之下，第一和第二m157配体与扩展形式Ly49的结合具有良好的焓（负ΔH（H）o个‡)，不利熵（负T型ΔS公司o个‡) (,B类和C类)和负ΔCpo个‡表明Ly49和m157之间形成了生产性接触，柔韧性降低，疏水表面埋藏在复杂界面。
我们已经证明，Ly49 NK受体通过一种涉及正合作性和构象选择的机制结合m157，并且该机制与可用的晶体结构密切相关。此外，我们已经证明抑制和激活Ly49使用相同的机制结合m157。因此，信号的差异完全是由于Ly49s细胞质域的差异，抑制性Ly49s通过免疫受体酪氨酸基抑制基序传递信号，而激活Ly49s则使用信号同源二聚体DAP12。
鸣谢
我们感谢S.K.Anderson（国家癌症研究所）和A.P.Makrigiannis（蒙特利尔临床研究所）提供Ly49 cDNA。
*这项工作得到了美国国立卫生研究院AI47990（发给R.A.M.）和福格蒂国际中心TW007972（发给E.L.M.）的全部或部分支持。这项工作还得到了布宜诺斯艾利斯大学、阿根廷国家研究委员会（CONICET）、国家促进公民社会基金会拨款机构PICT-2010-373（发给M.M.F.）、PICT-2007-0632（发给J.M.D.）、PICT 2010-0460（发给L.M.C.）和PICT-2008-1139和PICT-2010-10657（发给E.L.M.）的支持。
本文包含补充表S1-S3、方程式和反应方案.
三P.N.Romasanta、L.M.Curto、N.Urtasun、M.B.Sarratea、S.Chiappini、M.V.Miranda、J.M.Delfino、R.A.Mariuzza、M.M.Fernández和E.L.Malchiodi未发表的结果。
2使用的缩写如下：
- NK公司
- 自然杀手
- MCMV公司
- 小鼠巨细胞病毒
- NKD公司
- 自然杀伤受体结构域
- SPR公司
- 表面等离子体共振
- 鲁
- 响应单元。
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