生物化学杂志。2014年2月21日；289(8): 4919–4927.
肌腱细胞外基质的蛋白质组学分析揭示了疾病阶段特异性断裂和COMP（软骨寡聚基质蛋白）的差异断裂*
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斯蒂芬妮·乔治娜·达金
从‡英国赫特福德郡哈特菲尔德北迈姆斯霍克谢德巷皇家兽医学院临床科学与服务系
罗杰·肯尼斯·惠兰德斯·史密斯
从‡英国赫特福德郡哈特菲尔德北迈姆斯霍克谢德巷皇家兽医学院临床科学与服务系
迪克·海涅格德
§隆德大学隆德临床科学系，BMC计划C12，SE-22184隆德，瑞典
帕特里克·奥尼尔峡湾
§隆德大学隆德临床科学系，BMC计划C12，SE-22184隆德，瑞典
阿雷杰·卡布特
§隆德大学隆德临床科学系，BMC计划C12，SE-22184隆德，瑞典
杰耶什·杜迪亚
从‡英国赫特福德郡哈特菲尔德北迈姆斯霍克谢德巷皇家兽医学院临床科学与服务系
从‡英国赫特福德郡哈特菲尔德北迈姆斯霍克谢德巷皇家兽医学院临床科学与服务系
§隆德大学隆德临床科学系，BMC计划C12，SE-22184隆德，瑞典
2013年9月8日收到；2013年12月11日修订
背景：肌腱疾病的特征是细胞外基质的广泛重塑。
结果：新的COMP裂解片段在在体外炎症模型和自然疾病。
结论：炎症介质在肌腱疾病的不同阶段驱动不同的COMP断裂。
意义：新型COMP新末端片段为开发肌腱损伤标记物提供了机会。
关键词：细胞外基质、炎症、质谱（MS）、肽、蛋白质组学、肌腱
摘要
在炎症过程中，细胞外基质（ECM）被广泛重塑，许多组成成分被释放为蛋白水解裂解碎片。炎症性关节疾病的这些降解过程比腱病有更好的记录，尽管其发病机制有很多相似之处。本研究的目的是研究疾病早期和晚期受损肌腱的蛋白质组组成，以确定ECM蛋白软骨寡聚基质蛋白（COMP）的疾病特异性裂解模式。除了表征自然发生的疾病中释放的片段外，我们还假设用促炎介质刺激肌腱外植体在体外会诱发类似于自然疾病的COMP片段。因此，用IL-1β和前列腺素E刺激正常肌腱外植体2，并对其对COMP释放的影响及其裂解模式进行了表征。对受伤肌腱的分析发现，在损伤后的所有阶段，ECM的蛋白质组组成都发生了变化，显示了疾病阶段特有的蛋白质片段。IL-1β促进肌腱外植体中COMP的蛋白水解分解和释放，而PGE2没有分解代谢作用。在早期肌腱疾病中发现的分裂片段中，有两个片段是由IL-1介导的机制产生的。这些片段为针对肌腱疾病损伤阶段的新血管造影分析的发展提供了一个平台。
关键词：细胞外基质、炎症、质谱（MS）、肽、蛋白质组学、肌腱
介绍
肌腱有丰富的细胞外基质（ECM）2是运动员发病的重要原因(1,2). 运动中的重复机械负荷和炎症是损伤发病的驱动因素(三,–5). 由于衰老表型的共同特征，马为研究功能等效的人类跟腱提供了一个极具吸引力的大型动物模型(6,7)和两种类型的承重肌腱共同的弹性储能功能(8,9). 在成年马身上进行的运动研究没有显示出对负荷有适应性反应的证据，有人建议运动反而会导致退化，这是成年马肌腱临床损伤的先兆(10,11). 这一概念得到了对牛指屈肌腱张紧区的研究的支持，其中基于mRNA表达的ECM转换被证明是低的(12)最近在马身上的研究进一步证实了这一点，发现胶原蛋白的重塑率可以忽略不计（198年的半衰期）(13). 然而，对人类跟腱的初步研究表明，基于微透析的成人跟腱持续重塑(14,15)，最近的数据已经证实，该肌腱的中央区域在成人中也有最小的周转率(16)确认马是与人类肌腱疾病高度相关的模型(17). 相比之下，肌腱的非胶原成分似乎翻转得更快，因此，很可能受到导致临床损伤前发生的假想变化的降解过程的影响(11,18).
马腱修复过程在临床上通常被分为自然发生损伤的三个阶段；急性期发生在最初的创伤后，仅持续几天，然后是亚急性期（3-6周）和慢性损伤期（损伤后>3个月）(19). 这种愈合反应导致肌腱ECM的成分发生深刻变化(20,–22)与瘢痕组织的形成有关，这被认为是导致这两个物种功能不良的原因(23).
COMP是一种属于血小板反应蛋白家族的五聚体糖蛋白(24)在包括肌腱在内的许多机械负荷组织中发现(25). 其功能被认为包括稳定胶原纤维网络和催化纤维生成(26,27)以及ECM的组装、组织和维护(28). 这些作用将解释其与马肌腱力学特性的密切关系(29). 类风湿关节炎和骨关节炎患者的滑液和血清中COMP水平和片段在关节疾病中升高(26,30). 鞘内指屈肌腱撕裂的马也显示肌腱鞘液中COMP水平升高(31,32). COMP降解部分由基质金属蛋白酶（MMPs）介导(33)尽管MMP诱导的依赖性途径涉及聚集酶ADAMTS-4(28)也会发生。
研究人类肌腱组织的最新证据越来越多(34,35)，匹马(三,36)，啮齿动物(37)，以及在体外模型(38)支持炎症在肌腱病中的作用，涉及IL-1和PGE等促炎介质2在疾病发展和进展中。炎症细胞因子在软骨非胶原基质分解中的作用已被广泛研究在体外和体内以COMP和蛋白聚糖的丢失为代表(28,39,–42). 而肌腱和肌腱成纤维细胞产生细胞因子刺激并对其作出反应(43)，它们在ECM蛋白的特异性裂解中的作用还没有很好的记录(28,39,40). 检测特定蛋白水解酶裂解位点的能力对于了解肌腱ECM的降解机制是必要的，这些机制对靶向治疗干预和识别新末端肽片段以开发亚临床疾病标记物以用于预防策略都具有疾病阶段特异性(41). 与人类肌腱相比，马肌腱是一种更容易获得的来源，可以在各个损伤阶段以及不同年龄段的正常（未损伤）肌腱中对疾病进行有针对性的研究。本研究的目的是鉴定肌腱疾病不同阶段产生的COMP片段，并将其与IL-1β和PGE特异性诱导的COMP碎片联系起来2
在体外这是对急慢性疾病中肌腱ECM降解的首次综合分析，我们在自然疾病中发现了由IL-1β驱动机制产生的新COMP片段。
实验程序
马腱采集
从屠宰场或当地马科转诊医院获得2至20岁纯种马或纯种杂交马的马前肢，这些马有已知的受伤史，并且在死亡后4小时内获得了指浅屈肌腱（SDFT）的拉伸（掌骨中部）区域。肌腱分为亚急性损伤（损伤后3-6周，n个平均年龄9±5岁）或慢性损伤（伤后3个月以上，n个=9，平均年龄13±4岁）(三). 根据马在安乐死前从主人或转诊兽医处获得的历史信息，对马腱损伤进行年龄测定。根据肌腱的肉眼尸检外观，肌腱被归类为正常肌腱，包括肌腱体无明显肿胀迹象，苏木精和伊红染色切片上的束索模式一致(n个=19，平均年龄8±5岁）。
肌腱组织培养用外植体的制备
宏观正常肌腱用于在体外实验和马的起源(n个=10）7至14岁（平均10±3岁）。从肢体无菌解剖SDFT，去除副腱后，在组织培养流动罩中使用三个平行无菌切片机刀片（Surgipath）将肌腱外植体切割到定制的切割模板中，沿肌腱纵轴制作2×2×37-mm的片段(6). 将每孔的两个外植体培养在含有5%青霉素和链霉素（Invitrogen）的去血清DMEM（每孔3 ml）中，在37°C的湿化空气（5%CO）中的组织培养6孔板（VWR）中2和空气）。这种制备外植体组织的方法始终产生300 mg（±30 mg）的平均湿重。
为了评估促炎介质对肌腱基质成分释放的影响，用人重组IL-1β（5 ng·ml）刺激外植体−1)（钙生物化学）或PGE2（0.01或1.0μ米)（Sigma），并将总胶原蛋白和COMP释放到组织培养基中进行量化，并与非刺激对照组进行比较。切割后（时间0），将外植体培养在无血清培养基中，静置24小时，使组织适应培养环境。外植体切割后24小时，更换培养基，并用促炎介质刺激样本。将以下抑制剂添加到实验系统中，以通过PGE干预识别炎症相关的COMP释放2合成途径（包括PGE2通过IL-1β合成：1.0μ米Firocoxib（法国梅里亚尔），20μ米Ilomastat（钙生物化学），400 ng·ml−1重组马IL-1Ra（研发系统）。在48小时、72小时和96小时（切割后）收获培养基并进行分析，每一间隔进行完全培养基更换。
肌腱外植体的培养可行性
为了证明肌腱细胞在测量的实验时间点的活性，用4μ米溴化乙锭和2μ米PBS中钙黄绿素AM（Sigma）含量为5.6 m米葡萄糖，0.5米米氯化镁2和0.9米米氯化钙2共焦显微镜之前，在黑暗条件下放置1小时（莱卡微系统公司，米尔顿·凯恩斯，英国）。在切割后24小时和120小时，比较了在含有5%青霉素和链霉素的血清耗尽DMEM中培养的外植体的存活率，并将外植体在2%叠氮化钠中培养24小时作为阴性对照。ImageJ软件（NIH 1.42版）用于确定活细胞和死细胞的比例。
Sircol胶原蛋白检测
Sircol胶原蛋白分析（Biocolor Ltd）用于根据制造商的说明量化三螺旋胶原蛋白在组织培养基中的释放。简单地说，在96 well微量滴定板中对200μl培养基进行三次分析，并在555 nm处读取最终吸光度（Sunrise微量滴定板阅读器，瑞士梅内多夫帝肯）。从吸光度读数中减去底物背景吸光度值，并使用测定制造商规定的牛I型胶原生成标准曲线。对结果进行调整，以表示实验结束时测得的每毫克外植体湿重的胶原蛋白释放量。
COMP酶联免疫吸附试验
COMP ELISA是一种内部检测方法，已成功用于马样本，其方法在其他地方有详细描述(31,32). 在不同实验条件下，在培养肌腱外植体的组织培养基样品中测定COMP释放。结果以μg/ml表示，随后进行调整，以表示每mg外植体湿重的COMP释放量。
SDS/PAGE和COMP的Western Blotting
采用培养基样品的蛋白质印迹法比较促炎介质对肌腱释放COMP的影响。在还原和非还原条件下对未稀释培养基进行蛋白质印迹。通过添加二硫苏糖醇将样品减少至0.1米并加热至95°C 5分钟，然后在8–10%SDS/PAGE凝胶上电泳。电泳后，将蛋白质转移到PVDF膜（GE Healthcare）上进行蛋白质印迹（Bio-Rad）。在Tris缓冲盐水（0.02）中隔夜封闭膜米三基，0.02米三氯化氢和0.05米NaCl）在含有8%脱脂奶粉（漫威）和2%牛血清白蛋白（西格玛）的1%Triton（TBST缓冲液）中。在TBST中清洗后（每次清洗3次，每次10分钟），用COMP一级抗体孵育膜(25)在含有4%（w/v）牛奶和1%（w/v）BSA的TBST缓冲液中，以1:1000的稀释度冲洗2 h。与之前一样，将膜清洗3次，并在抗体缓冲液中与抗兔IgG HRP-连接的二级抗体（Cell Signaling Technology®）以1:2000的稀释率孵育2 h。使用增强化学发光（ECL）试剂和薄膜（GE Healthcare）观察抗体阳性蛋白带。使用ImageJ软件（NIH 1.42版）对非还原性印迹上的蛋白质条带进行密度分析，使用连续曝光胶片以避免饱和伪影。
质谱法蛋白质组学分析
使用四倍飞行时间质谱仪（Q-TOF micro，Waters）对实验介质样品以及正常和受损SDFT提取物进行液相色谱-质谱（LC-MS）。使用另一个LC-MS系统进行多反应监测（MRM）分析，该系统由Easy nano-LC组成TM（TM）（Thermo Scientific）三重四极仪（TSQ VantageTM（TM），Thermo Scientific）在肌腱外植体的培养基样本上在体外对于72小时的一个实验，可以对已知肽进行选择性定量。使用MS-MS的相关成本妨碍了对大量样品的分析。使用MS-MS进行蛋白质组学分析，以确定ECM蛋白和从刺激和对照正常肌腱外植体释放到培养基中的COMP片段的新末端在体外COMP是肌腱外植体在培养过程中释放的最丰富的ECM蛋白。对于这些蛋白质组分析，外植体被切割（时间0）并休息48小时，因为在先导研究中休息24小时表明，由于大量蛋白质和在48小时达到基线水平之前释放的肽，这一时间不够长。在48小时，更换培养基，用促炎介质刺激组织24小时。在外植体切割后72小时，对所有用于蛋白质组分析的培养基样品进行分析。
Q-TOF MS介质样品的制备
注意避免皮肤和头发角蛋白污染样品。每个样品中的100μl培养基减少4 m米二硫苏糖醇并在56°C下搅拌30分钟。样品用16 m烷基化米碘乙酰胺在室温、黑暗中消化1小时。样品在37°C的振动筛上用0.5μg胰蛋白酶金（Promega，Madison，WI）消化一夜。样品在SpeedVac中干燥，悬浮在100μl 0.2%甲酸中，其中10μl用自制反相尖端纯化和脱盐，如前所述，4片厚度（47-mm Empore C18吸盘，3M，明尼阿波利斯，MN）(44,45)随后干燥并在20μl 0.2%甲酸中再溶解，然后注入Q-TOF MS。
三重四极质谱介质样品的制备
根据制造商的说明（SUM SS18V），用反相C18柱清洁培养基样品（10μl胰蛋白酶消化物，见上文）；立柱从Nest Group购买。
肌腱组织提取物的制备及其QTOF-MS分析
还对宏观正常、亚急性（损伤后3-6周）和慢性损伤（损伤后>3个月）SDFT的组织提取物进行蛋白质组分析，以研究损伤对基质蛋白组成的影响。正常、亚急性和慢性损伤SDFT的样本(n个=每种3个）在−80°C下储存，并将其切成小块米含盐酸胍蛋白酶抑制剂（蛋白酶抑制剂混合物III，钙生物化学1:100稀释）和10 m米添加EDTA。样品在室温下旋转48小时，然后在4°C下以13000×克回收提取物。50μl提取物在10 m内减少米二硫苏糖醇在56°C的摇床上放置30分钟，并在40 m处烷基化米碘乙酰胺在室温下黑暗中放置60分钟。在离心（13200×克然后在−20°C下乙醇洗涤4小时，以去除残留的盐酸胍和其他盐类。样品在SpeedVac中干燥，并悬浮在100μl的0.1溶液中米在37°C的摇床上用1μg胰蛋白酶金在胰蛋白酶作用约16h之前，用pH 8.5的三乙基碳酸氢铵对样品进行纯化和浓缩。
COMP肽的MS-MS数据分析
对于Q-TOF LC-MS（Q-TOF-micro，Waters），使用Protein Lynx 2.1（Water）处理质谱原始数据。使用数据库（SwissProt 56.9和ENSEMBL）和MASCOT MS/MS Ions Search（2.1版）进行肽和新末端蛋白搜索。由于肌腱中存在胶原蛋白，在数据库搜索中允许脯氨酸残基的羟基化。MASCOT搜索参数包括半胱氨酸的氨基甲酰化作为固定修饰，脱酰胺（Asn和Gln）和氧化（Met和Pro）被视为可变修饰。其他MASCOT搜索参数包括：单同位素质量、±0.2-Da肽质量耐受性、±0.2-Da片段质量耐受性，最大未切割量为2，离子得分最低为20，只有排名最高的肽匹配，以及分类卡巴勒斯马.MRM数据使用Skyline 1.4软件（华盛顿大学MacCoss实验室软件）进行分析。
统计分析
使用SPSS PASW Statistics 18（SPSS Inc.）进行统计分析。使用线性混合模型分析COMP释放，以说明马、实验条件和时间的影响。对于COMP，显示了释放分析和相对于相应控制的释放百分比变化。第页<0.05被认为具有统计学意义。
道德声明
皇家兽医学院伦理与福利委员会（URN 2011 1117）寻求并批准了从屠宰场或当地马兽医转诊医院收集本研究的死后马腱的伦理批准。
结果
肌腱移植体体外存活率
显示外植体活力的共焦图像如所示在无血清培养基中培养24小时后，SDFT外植体中90±5%的细胞存活。培养120h后，外植体存活率为60±5%。大多数细胞死亡位于沿肌腱细胞行呈线性模式的切缘边缘。
肌腱成纤维细胞在外植体培养中的活性。钙黄绿素AM处理肌腱切片的共焦荧光显微照片，以表示活细胞的细胞质染色(绿色)和溴化乙锭用于核染色(红色)活细胞和死细胞。24小时后移植(A类)和120小时(B类)如图所示。培养24小时后细胞存活率为90±5%，120小时后为60±5%。C类24h后用叠氮处理的外植体作为阴性对照。所有实验均在120h培养期内进行。比例尺=20微米。
IL-1β和PGE的作用2肌腱ECM上
IL-1β和PGE对胶原蛋白的最小降解2刺激
IL-1β或PGE处理的肌腱外植体释放的可溶性胶原蛋白2在24至96小时的所有样品中，最小且范围在0.01至0.03μg/mg组织之间，但这与对照培养物没有显著差异。
IL-1β和PGE后COMP的释放2刺激
在非刺激培养物的第一个24小时平衡期，培养基中的平均COMP水平为0.26±0.1μg/mg。统计分析中不包括这24小时。在所有样品中，COMP的累积释放显著增加，时间为48至96小时(第页=0.008），与对照样品相比，IL-1β显著增加（增加约10倍(A类). 尽管1.0μm刺激后COMP释放增加米前列腺素E2与对照组相比，这在统计学上没有显著差异。添加IL-1Ra（400 ng/ml）可显著降低COMP的释放−1)和Firocoxib（1.0μ米) (第页<0.001和第页分别=0.004），但Ilomastat没有(B类).
将COMP从培养的SDFT外植体释放到培养基中。正常的SDFT外植体取自3匹9至13岁（平均10±2岁）的马。外植体在切割后休息24小时，然后开始介质更换和刺激。在48、72和96小时收获培养基，并在每个时间点进行完全替换。A类，平均累积COMP释放量显示，单独刺激IL-1β和联合20μ米伊洛马斯塔特。1.0μ刺激后COMP释放米前列腺素E2与非刺激性对照相似。B类，COMP释放相对于相应控制的平均百分比变化。添加400 ng·ml−1IL-1Ra或1.0μ米Firocoxib显著降低了IL-1β介导的COMP释放。误差线代表S.D**第页< 0.01; ***第页< 0.001.
Western印迹法分析培养基中的ECM蛋白
肌腱外植体实验的培养基分析证实，在120小时的培养期内，肌腱ECM释放COMP(). COMP以多种已知的多元形式发布(25)在非还原条件下可以识别的(A类,尼泊尔卢比)在还原条件下以单体形式迁移(A类,R（右）). 外植体切割后48小时，组织中COMP的释放量达到最大值。用5 ng·ml刺激−1与对照组相比，IL-1β早在15小时就诱导COMP的额外释放，但在48小时后最显著(B类,R（右）和尼泊尔卢比)并且包括在还原条件下对照培养物中不存在的约100kDa蛋白质片段(和). 刺激15小时后用IL-1β观察到小于100 kDa的片段(). 用相同体积的培养基对Western blot进行定性评估()在1.0μ米前列腺素E2，经ELISA检测不显著(A类). 然而，只有在较高PGE刺激后才能观察到小于100 kDa的片段2剂量（1.0μ米)与IL-1β相比，这些片段的丰度相对较低(). IL-1β与低剂量或高剂量PGE的联合添加2对COMP释放没有额外影响。
正常SDFT外植体向培养基中释放COMP。来自实验样品的代表性培养基Western blots显示，对照组的COMP随时间释放(A类)和IL-1β刺激的肌腱移植(B类)未减少(尼泊尔卢比)并减少(R（右）)条件。蛋白质条带的密度分析显示为非还原性蛋白质印迹。与非刺激对照组相比，通过用IL-1β刺激外植体，COMP的释放增强，最大释放发生在48小时，并且出现许多不同的肽<100 kDa。在IL-1β刺激的外植体中，单体COMP在外植体切割后15到120小时的还原条件下表现为双倍体，这一点在较低的面板中表现得更好。T型，马SDFT提取物（总蛋白负载10μg），4米（盐酸胍）被用作COMP的负荷标准物和阳性对照物，COMP主要以550-kDa五聚体的形式存在于组织中。
IL-1β和PGE的差异作用2COMP版本。在4小时和48小时采集的培养基样品的代表性Western blot。肌腱提取物=阳性对照（总蛋白10μg）；对照=在相同的相应时间点来自未刺激肌腱的培养基。在48小时用IL-1β刺激COMP的释放和裂解，同时出现低分子量片段，包括100-kDa肽（双肽）的出现。添加PGE2导致在48小时时释放完整和碎片COMP（100 kDa）。较高剂量的PGE可检测到较小的碎片2但与IL-1β刺激相比，这些蛋白的丰度较低。
培养基的质谱蛋白质组分析
LC-MS和Q-TOF分析
半定量LC-MS分析表明，COMP是来自刺激和非刺激外植体的所有培养基样品中最丰富的ECM蛋白，其次是血小板反应蛋白-4、聚集蛋白和纤维连接蛋白(). IL-1β刺激（5 ng·ml−1)与其他实验条件相比，诱导COMP释放增加约2倍。因此，对COMP及其相关片段进行了进一步分析。在不同的炎症刺激下产生的COMP的新末端肽的列表显示在.对照样品中存在的五种COMP新末端肽也与每种促炎介质刺激的样品相同(即。存在于所有样本中）。添加IL-1β（5 ng·ml−1)与对照组相比，生成了更多的COMP新末端肽，并用1.0μ米前列腺素E2.用0.01μ刺激外植体产生的新末端肽米前列腺素E2与对照组释放的相同。有趣的是，IL-1β和低剂量（0.01μ米)前列腺素E2与高剂量（1.0μ米)前列腺素E2().
表1
促炎介质释放到介质中的排名靠前的肌腱ECM蛋白（按蛋白评分）
蛋白质丰度通过半定量LC-MS测量，并由括号中的指数修正蛋白质丰度指数（emPAI）表示。
| 蛋白质等级 | 控制 | IL-1β（5 ng·ml−1) | 前列腺素E2(0.01 μ米) | 前列腺素E2(1.0 μ米) |
|---|
| 1 | 压缩机（3.44） | 压缩机（6.41） | 压缩机（3.84） | 压缩机（3.08） |
| 2 | 血栓反应蛋白4（1.35） | 血栓反应蛋白4（1.7） | 血栓反应蛋白4（1.28） | 血栓反应蛋白4（0.92） |
| 三 | 纤维结合蛋白（0.6） | 群集蛋白（0.85） | 群集蛋白（0.85） | 群集蛋白（0.5） |
| 4 | 群集蛋白（0.5） | 纤维结合蛋白（0.51） | 纤维结合蛋白（0.74） | 纤维结合蛋白（0.49） |
| 5 | 去色剂（0.09） | 白细胞介素-6（0.56） | 胶原蛋白3（0.23） | 去色剂（0.3） |
| 6 | 血栓反应蛋白1（0.06） | 胶原蛋白3（0.17） | 血栓反应蛋白1（0.06） | 胶原蛋白3（0.29） |
| 7 | CILP-1（0.06） | 血栓反应蛋白1（0.11） | CILP-1（0.06） | 血栓反应蛋白1（0.08） |
| 8 | 胶原蛋白1（0.06） | Aggrecan（0.05） | Aggrecan（0.03） | Aggrecan（0.02） |
表2
| 控制 | IL-1β | 1.0 μ米前列腺素E2 | 0.01 μ米前列腺素E2+IL-1β | 1.0 μ米前列腺素E2+IL-1β |
|---|
| 228–238立方厘米一 | 37–48 E↓LQETNAALQDVR↓E | 89–108 Q↓CAPGSCFPGVACTQTASGAR↓C | 37–48 E↓LQETNAALQDVR↓E | 81–88 R↓VSVRPLAQ↓C |
| 294–303伏↓PNSGQEDADR↓D一 | 88–108安↓QCAPGSCFPGVACTQTASGAR↓C | | 88-108 A↓QCAPGSCFPGVACTQTASGAR↓C | 89–108 Q↓CAPGSCFPGVACTQTASGAR↓C |
| 642–649 S↓TGPGEQLR↓N一 | 89–108 Q↓CAPGSCFPGVACTQTASGAR↓C | | 89–108 Q↓容量 | |
| 724–736 F↓CFSQENIIWANLR↓Y一 | 203–222 F↓QCGPCGFVGDQASGCRPR↓A | | 254–266℃↓AVGWAGNGLLCGR↓D | |
| 726–736 F↓SQENIIWANLR↓Y一 | 254–266℃↓AVGWAGNGLLCGR↓D | | 725–736 C↓FSQENIIWANLR↓Y | |
| 269–279 T↓DLDGFPDEKLR↓C | | | |
| 320–330伏↓PNEGDNCPLVR↓N | | | |
| 600–613年 | | | |
使用MRM的靶向质谱
在一个实验的培养72小时后，对实验培养基样品进行MRM分析。使用这种方法，可以在用促炎介质刺激的样品和非刺激对照品之间对已知肽和COMP的新末端片段进行相对定量。与非刺激对照组相比，IL-1β刺激的肌腱外植体释放更多肽的总体趋势(,A–F). 当外植体与IL-1β和低剂量（0.01μ米)前列腺素E2.
培养72小时后释放到培养基中的COMP肽的MRM分析：AVAEPGIQLK(A类)、ELQETNAALQDVR(B类)，IDVCPENAEVTLTDFR(C类)、LVPNPGQEDADR(D类)、SSTGPGEQLR(E类)和COMP新末端片段CFSQENIIWANLR(F类).每个样品在MRM上运行，一式三份，并显示每个实验条件下S.D.的平均值。MRM分析是对来自一个实验而非生物复制品的三份样品进行的；因此，没有进行统计分析。峰归一化面积表示测量的每个肽的离子峰跃迁的总面积。与非刺激对照组相比，IL-1β有增强COMP肽/新N末端片段释放的趋势。对于所有肽，在用IL-1β和0.01μ米前列腺素E2.
正常肌腱和损伤肌腱的蛋白质组分析
对正常和自然患病屈肌肌腱的分析确定了大量蛋白质的蛋白质表达谱差异，总结如下正常肌腱、亚急性肌腱和慢性肌腱损伤共有21种蛋白质，但在损伤样本中发现了更多的额外蛋白质，包括白蛋白、肌腱蛋白酶C、纤维连接蛋白和膜联蛋白A1、A2和A5。在亚急性和慢性损伤的肌腱中发现COMP，但与正常样本相比，COMP不是最丰富的ECM蛋白。在正常、亚急性和慢性损伤的SDFT的提取物中检测到的COMP neo末端片段如在亚急性损伤肌腱的组织提取物样品中鉴定出四个COMP新末端片段，一个处于慢性损伤阶段。在自然损伤中发现的这五个COMP新末端片段中，C↓AVGWAGNGLLCGR↓D和F↓CFSQENIIWANLR↓Y在在体外IL-1β刺激后的模型系统。定量MRM分析表明，自然损伤常见的COMP新N末端片段CFSQENIWANLR水平和在体外与非刺激对照组和PGE相比，IL-1β刺激的肌腱移植物培养基中的模型升高2-模拟样本。
Q-TOF LC-MS鉴定的蛋白质的Venn表示。正常、亚急性和慢性受伤马SDFT样品的提取物样品(n个=3）分析整体蛋白组成，显示肌腱ECM蛋白表达谱随损伤阶段的差异。虽然在亚急性期和慢性期损伤中都发现了相似数量的蛋白质，但在亚急性阶段损伤中存在的独特蛋白质数量最多。
表3
天然SDFT损伤特有的COMP肽概述
数字表示马COMP蛋白序列中的肽位置。
| 正常SDFT | 亚急性SDFT损伤 | 慢性SDFT损伤 |
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| 228–238℃↓PDGTPSPCHEK↓A | 254–266℃↓AVGWAGNGLLCGR↓D一 | 682–692 R↓WFLQHRPQVGY↓I |
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讨论
用两种促炎介质刺激肌腱外植体，在24到96小时之间没有诱导显著的胶原蛋白释放。因此，肌腱外置体在培养早期释放的胶原蛋白缺乏方面表现出与软骨相似的行为(46,47). 然而，肌腱外植体在5天后不可能保持良好的细胞活力，这就是为什么这一时间间隔被选为本研究的最大时间间隔。COMP与IL-1β的释放增加支持了IL-1β在肌腱中的分解代谢作用，类似于软骨的分解代谢(28,39,40)IL-1Ra的消除作用进一步证实了这一点。非罗昔布而非伊洛马司他抑制IL-1β诱导的COMP释放。先前的研究表明，除基质金属蛋白酶以外的蛋白酶可能是COMP降解的原因在体外通过聚合酶，如ADAMTS-4(28)Ilomastat对其无抑制作用，尽管在当前研究中未探讨聚集酶抑制剂的作用。
虽然我们没有研究应变对肌腱的影响，但研究表明，应力剥夺可诱导IL-1的产生(48)损伤时可能发生应力剥夺，这可能解释了在患病肌腱中观察到的一些新末端肽。COMP很容易从基质中释放出来，这可能是由于与其他基质蛋白相比，与基质成分的相互作用较弱，或者释放的COMP是新合成的。然而，对照样品中COMP裂解形式的存在更符合蛋白质水解介导的释放。虽然细胞死亡可能释放了胞内蛋白酶，但这不太可能是片段的主要来源，因为我们的对照样品区分了添加细胞因子后产生的片段或显著升高的片段。IL-1β刺激增强了裂解形式COMP的释放，并进一步降解单体COMP（<100 kDa，B类). PGE的低剂量和高剂量2与对照样品相比，增强了额外的碎片模式。然而，MRM分析显示IL-1β和PGE联合刺激的趋势2根据PGE浓度产生不同影响2IL-1β和低剂量PGE刺激2导致ECM蛋白裂解肽的释放增加，而IL-1β和高剂量PGE2限制新末端切割位点的数量。低剂量前列腺素E之间的协同作用2在本研究中，IL-1β对肽释放的影响很奇怪，可以用一些假设来解释。首先，较高浓度的前列腺素E可能延长前列腺素受体占用的动力学2导致受体脱敏，从而抑制受体效应。第二，PGE水平较高2可能对IL-1活性产生自我调节反馈作用，以调节炎症反应(49). 第三，较高剂量的PGE2可以通过产生特殊的前溶解介质（如脂蛋白）来激活肌腱成纤维细胞的炎症消退(50). 这已在相同的实验系统中报告，其中添加1.0μ米前列腺素E2正常肌腱移植体诱导的最大脂蛋白A4组织培养72h后释放(三). 我们已经证明用IL-1β和相同浓度的PGE联合刺激外植体2类似诱导的脂蛋白A4释放，PGE剂量越高，产量越大2，表明PGE2可能对肌腱ECM产生抗分解代谢作用(36).
对正常肌腱和自然患病肌腱进行比较蛋白质组学分析，确定蛋白质/肽谱的差异。仅在亚急性和慢性损伤样本中发现的膜联蛋白A1的存在表明炎症和促凋亡机制都是活跃的(51)并持续到肌腱愈合的后期。在受伤的SDFT样本中也发现了COMP，但与正常肌腱相比，COMP不是最丰富的蛋白质，这表明肌腱蛋白谱在受伤后发生了变化。通过蛋白质组分析，两个损伤阶段的蛋白质数量相似，尽管亚急性疾病特有的蛋白质数量较多，表明肌腱细胞表型的巨大变化是早期疾病阶段的特征，并且这种变化在很大程度上持续存在于慢性病中。蛋白质图谱未能恢复正常表明，损伤会永久改变肌腱ECM的组成，这可能会损害组织的机械特性及其对肌腱细胞在维持体内平衡时的反应的影响。这可能是导致马再次受伤的高风险因素，因为修复疤痕的机械性能低于正常肌腱(23,52).
MRM分析表明，IL-1β刺激肌腱外植体后，亚急性损伤中的F↓CFSQENIIWANLR↓Y COMP肽水平也升高。MRM分析表明，用IL-1β而不是PGE刺激后，F↓CFSQENIIWANLR↓Y片段的相对丰度更大2此外，C↓AVGWAGNGLLCGR↓D COMP片段仅在用IL-1β而非PGE刺激后才被识别2（低剂量或高剂量），因此，这些片段的存在体内为IL-1在自然发生的肌腱损伤中发挥作用提供了支持性证据。
常见于自然疾病和在体外肌腱炎症模型为开发抗体识别肌腱损伤阶段和酶抑制剂进行治疗干预提供了平台。这些疾病特异性片段的组合可以为肌腱损伤开发多重标记平台。
致谢
我们感谢Crafoord基金会和Inga-Britt&Arne Lundberg基金会资助本研究中使用的质谱仪。
*这项工作得到了英国生物技术和生物科学研究委员会（BBSRC）和法国Ceva Grant BB/F018258/1的支持。这项工作的一部分得到了欧洲委员会第七研究框架计划、NanoDiaRa和Anamar Medical的支持。
2使用的缩写如下：
- 发动机控制模块
- 细胞外基质
- PG公司
- 前列腺素
- 标准立方英尺
- 指浅屈肌腱
- Q-TOF（质量-飞行时间）
- 四倍TOF
- 物料需求管理
- 多元反应监测
- 压缩机
- 软骨寡聚基质蛋白
- 基质金属蛋白酶
- 基质金属蛋白酶。
参考文献
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